枸杞幼苗對鹽脅迫的生理響應

白麗麗，李玉龍，鞏 健，李 豪，謝志霞，王文穎，徐 進

（1.青海師范大學生命科學學院，青海西寧 810008；2.淄博職業(yè)學院制藥與生物工程系，山東淄博 255314；3.中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所農業(yè)資源研究中心，河北石家莊 050022；4.山西農業(yè)大學林學院，山西晉中 030801；5.中國科學院西雙版納熱帶植物園，云南昆明 650223）

鹽脅迫是嚴重影響植物生長發(fā)育的非生物因素，會擾亂植物正常的代謝活動、影響根系對K+及其他必需元素的吸收，進而造成生理干旱并引起氧化脅迫等次生脅迫，導致植物生長受到抑制甚至死亡。植物在進化中形成不同的對鹽脅迫響應機制[1-2]。一些植物在逆境脅迫中會累積有機兼容性溶質并分泌一些有機酸（如脯氨酸）[3-5]，在脅迫環(huán)境下可以維持細胞膨脹、保護酶和膜免受傷害，在植物抗逆過程中可能起著重要的作用。

1995年，Kavi Kishor P B等人[6]將P5CS（吡咯啉-5'-羥酸氧化酶；脯氨酸生物合成過程中的限速酶）基因轉化煙草，發(fā)現(xiàn)在轉基因煙草中脯氨酸的含量明顯提高，其耐鹽性也有所提高[7]。另外，可溶性糖（葡萄糖、果糖、蔗糖、果聚糖等）是另一種重要的滲透調節(jié)物質。有研究表明，隨著鹽脅迫時間的延長，番茄葉片中可溶性糖含量逐漸增加[8]。在較低的NaCl脅迫下，枸杞葉片中的可溶性糖含量顯著增加，但較高的含鹽量（0.5%）下降低其可溶性糖含量[9-10]。在重鹽堿地上種植枸杞的脯氨酸含量較對照增加，而可溶性糖在地上部無明顯變化，在根部大量積累。在枸杞不同的營養(yǎng)器官中，其含量有所差別，表現(xiàn)為脯氨酸和可溶性糖在根中大量積累，葉片次之，莖中最少[11]。

目前，多年來人們對枸杞的研究主要集中在栽培、育種、中藥成分分析及臨床應用方面[9，11-13]。但目前對其響應鹽脅迫的生理和分子機制研究較少。試驗以枸杞為材料，對不同濃度和不同時間的鹽脅迫下枸杞幼苗的生理生化指標進行了研究，為進一步探明枸杞響應鹽脅迫的生理與分子機理，更好地利用枸杞改良鹽堿地和生產高品質的枸杞子提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

海杞（Lycium barbarum L.），中科院南皮農業(yè)生態(tài)試驗站提供。海杞是中科院南皮農業(yè)生態(tài)試驗站經過6年選育出的枸杞優(yōu)良品種，在濱海重鹽堿地生長和結果良好，并可豐產穩(wěn)產。

1.2 試驗設計

從中科院南皮農業(yè)生態(tài)試驗站挑選生長狀況一致的海杞枝條，挑選粗細相近的枝段（直徑3.5～5.0 mm）剪裁成15 cm長的枝條，據頂端1 cm處留一個完整的側芽。然后放入自來水中，21 d后開始長新芽，剪下生長狀況相近的新芽，放入IAA質量濃度為0.5 mg/L的自來水中催根，待生根后進入鹽濃度梯度和時間梯度的處理。鹽處理設4個濃度梯度（0，50，100，150 mmol/L NaCl），處理5 d取樣（分別取根和葉）。同時，設置100 mmol/L NaCl處理下，4個時間梯度（0，1，5，10 d）。每個重復處理3次，分別測定根和葉中的抗壞血酸過氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）、可溶性糖和脯氨酸（Pro）的含量。

1.3 測量方法

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）測定方法依據超氧化物歧化酶抑制氮藍四唑（Nitroblue tetrazolium，NBT） 光氧化還原的50%酶量為1個活力單位，參照張雯莉，張?zhí)兜热说姆椒╗11-12]。

過氧化氫酶（Catalase，CAT） 測定方法：H2O2于波長240 nm處有強烈吸收，CAT能分解過氧化氫，使反應溶液吸光度（A240）隨反應時間而降低；根據測量吸光率的變化速度測出CAT的活性[13-15]。

抗壞血酸過氧化物酶 （Ascorbate peroxidase，APX）活性測定方法：利用APX在H2O2存在的條件下使抗壞血酸量減少的原理測定[14-17]。

過氧化物酶（Peroxidase，POD） 測定方法：在有過氧化氫酶的存在下，POD能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質，該物質于波長470 nm處有最大吸收，可用分光光度計測量470 nm處的吸光度變化測定POD酶活性[14-17]。

丙二醛（Malondialdehyde，MDA） 含量的測定方法：MDA是常用的膜脂過氧化指標[18]，在酸性和高溫條件下，可以與硫代巴比妥酸（Thiobarbituric acid，TBA） 反應生成紅棕色的三甲川（3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮），測定其最大吸收波長于532 nm處的吸收，并計算MDA含量。

可溶性糖含量的測定方法：于波長485 nm處進行比色測定[8]。

可溶性蛋白含量的測定方法：依據考馬斯亮藍G-250的方法測定[8]。

1.4 數(shù)據整理和分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析方差處理，顯著性分析采用LSD檢驗法（p＜0.05為差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 不同鹽濃度脅迫條件下枸杞生理生化的響應

2.1.1 不同鹽濃度脅迫條件下枸杞氧化傷害的程度

對于海杞品種的枸杞幼苗，葉片中的丙二醛（MDA） 含量顯著高于根中的含量（p＜0.05）。隨著鹽濃度的升高，葉片的MDA含量顯著升高；而根中的MDA含量在低鹽濃度（≤50 mmol/L）下差異不顯著，但在高濃度（＞50 mmol/L）下顯著升高。結果表明，隨著鹽濃度的升高，葉片和根中的細胞膜氧化傷害顯著增多。

不同鹽濃度處理條件下枸杞葉片和根中MDA含量變化見圖1。

圖1 不同鹽濃度處理條件下枸杞葉片和根中MDA含量變化

2.1.2 不同鹽濃度脅迫條件下枸杞抗氧化酶系統(tǒng)的響應

枸杞幼苗葉片的SOD活性與其根中的SOD活性無顯著差異（p＞0.05）。隨著鹽濃度的升高，葉片和根的SOD活性無顯著變化。在低鹽濃度（＜100 mmol/L）處理條件下，CAT活性顯著下降，而在高鹽濃度處理（150 mmol/L） 條件下CAT又顯著升高到對照水平；并且根和葉片對不同鹽濃度的反應呈相同的趨勢。隨著鹽濃度的升高，葉片的APX活性無顯著變化；根中APX活性顯著高于對照組的水平，但在不同鹽濃度下差異不顯著。與對照組相比，鹽處理顯著增加葉片中的POD活性；而根中的POD活性在低鹽濃度（＜50 mmol/L） 下變化不顯著，但在高鹽濃度下顯著上升。

不同鹽濃度脅迫條件下枸杞葉片和根中抗氧化酶活性的變化見圖2。

圖2 不同鹽濃度脅迫條件下枸杞葉片和根中抗氧化酶活性的變化

2.1.3 不同鹽濃度脅迫條件下枸杞可溶性蛋白和滲透調節(jié)物質含量的變化

與對照組相比，鹽處理顯著降低葉片中的可溶性蛋白含量；而根中的可溶性蛋白含量隨著鹽濃度的升高呈顯著上升趨勢。

不同鹽濃度脅迫條件下枸杞葉片和根中可溶性蛋白含量的變化見圖3。

在高鹽濃度（＞50 mmol/L）下，葉片中的可溶性糖含量顯著升高；根中的可溶性糖含量在低鹽濃度（≤100 mmol/L）下顯著增加，但在高鹽濃度下又顯著降低。葉片中的脯氨酸含量隨著鹽濃度的升高呈顯著上升趨勢。

不同鹽濃度脅迫條件下枸杞滲透調節(jié)物質含量的變化見圖4。

圖3 不同鹽濃度脅迫條件下枸杞葉片和根中可溶性蛋白含量的變化

圖4 不同鹽濃度脅迫條件下枸杞滲透調節(jié)物質含量的變化

2.2 不同時間鹽（100 mmol/L NaCl）處理下枸杞的生理生化響應

2.2.1 不同時間鹽處理下枸杞氧化傷害的程度

不同時間鹽（100 mmol/L） 處理下枸杞葉片MDA含量的影響見圖5。

圖5 不同時間鹽（100 mmol/L） 處理下枸杞葉片MDA含量的影響

由圖5可知，隨著鹽脅迫時間的變長，葉片中MDA含量顯著升高，表明鹽脅迫時間越長，枸杞受到的膜過氧化傷害加劇。

2.2.2 不同時間鹽處理下枸杞抗氧化酶系統(tǒng)的響應

隨著鹽脅迫的時間延長，葉片中的SOD活性顯著升高；根中的SOD活性呈顯著上升后顯著下降再顯著上升的趨勢，但都高于對照水平。隨著鹽脅迫的時間延長，葉片中的CAT活性變化不顯著，但根中的CAT活性顯著上升，并一直維持在較高的水平；與對照組相比，鹽脅迫的時間延長顯著增加葉片中的APX活性，但在處理后不同時間差異不顯著；但根中的APX活性變化不十分顯著。隨著鹽脅迫時間延長，葉片和根中的POD活性先顯著下降后又上升，并高于對照的水平。

不同時間鹽（100 mmol/L）處理下枸杞葉片和根中抗氧化酶活性變化見圖6。

圖6 不同時間鹽（100 mmol/L） 處理下枸杞葉片和根中抗氧化酶活性變化

2.2.3 不同時間鹽處理下枸杞可溶性蛋白和滲透調節(jié)物質含量變化

隨著鹽脅迫的時間變長，葉片中可溶性蛋白含量無顯著變化；根中的可溶性蛋白含量則顯著升高，分別為對照的145.6%，113.5%，142.8%。

不同時間鹽（100 mmol/L）處理下枸杞葉片和根中可溶性蛋白含量變化見圖7。

圖7 不同時間鹽（100 mmol/L） 處理下枸杞葉片和根中可溶性蛋白含量變化

在短時間（＜5 d） 的鹽處理下，葉片的脯氨酸含量無顯著變化；而根中的脯氨酸含量顯著升高。在長時間（10 d）處理下，葉片的脯氨酸含量顯著升高，而根中的脯氨酸含量顯著降低。不同時間鹽處理對葉片的可溶性糖含量無顯著影響。

不同時間鹽（100 mmol/L）處理下枸杞滲透調節(jié)物質含量的變化見圖8。

圖8 不同時間鹽（100 mmol/L） 處理下枸杞滲透調節(jié)物質含量的變化

3 結論

細胞膜是植物細胞和外界環(huán)境之間的界面和屏障。在鹽堿環(huán)境下，鹽分首先作用于細胞膜，鹽脅迫損傷植物細胞質質膜，導致膜透性增大和膜脂過氧化，而膜脂過氧化產物對植物防御體系的破壞又再次加劇了膜脂過氧化作用[19]。丙二醛（MDA） 含量是細胞膜脂質過氧化作用水平反映細胞膜結構受損的程度。在試驗中，由圖1和圖5可以看出，對照組與鹽處理組相比MDA含量隨著鹽濃度升高和處理時間的延長，大體呈現(xiàn)逐漸上升趨勢且差異均達到顯著水平，說明鹽脅迫破壞了枸杞細胞膜的穩(wěn)定性，且隨著鹽濃度升高和處理時間的延長對枸杞葉片和根的質膜透性傷害程度不同，且作用增加。在低鹽濃度（50 mmol/L） 處理下根中的MDA含量與對照無顯著差異，說明低鹽濃度對枸杞質膜透性傷害較小。在鹽脅迫下，根作為與鹽分直接接觸的器官，其積累膜脂過氧化產物的速度可能要快于地上部分。但MDA含量在枸杞器官中的分布規(guī)律為葉大于根，說明根相比葉片受害較輕，而鹽脅迫對葉片的嚴重傷害，從而嚴重影響其光合碳同化。枸杞MDA的變化規(guī)律與賈新平等人[19]在關于海濱雀稗耐鹽能力的研究結論相一致。

植物在正常條件下，活性氧的形成和清除之間保持著一種動態(tài)平衡[20]。當受到外界逆境脅迫時，植物通常會通過自身的抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化劑對活性氧進行清除，從而提高其抗逆性[21]。活性氧清除系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（APX）等。SOD的主要作用就在于它能將超氧陰離子自由基快速歧化為過氧化氫（H2O2）和分子氧[22]。POD催化由過氧化氫參與的各種還原劑的氧化反應，使H2O2還原成水而減小植物體內的氧化狀態(tài)，并可以與超氧化物歧化酶、過氧化氫酶相互協(xié)調配合，清除過剩的自由基。CAT是含有血紅素的四聚體酶，是清除H2O2的主要酶類，可以清除線粒體電子傳遞、脂肪酸β氧化及光呼吸氧化過程中產生的H2O2，避免細胞因H2O2累積而產生傷害。APX是清除H2O2的主酶類，對抗壞血酸有很高的特異性和親和性。SOD，CAT，APX和POD是植物體內清除活性氧的4種重要酶，在保護細胞膜正常代謝、控制膜脂過氧化、清除超氧自由基等方面起重要作用。試驗對枸杞體內這幾種保護酶的活性變化進行了分析，其活性的高低變化反映了植物對氧化損傷的修復能力。在鹽脅迫條件下，隨鹽濃度的增加，SOD活性在根、葉中和APX活性在葉中變化差異不顯著，說明一定鹽濃度范圍內枸杞具有一定的抵抗鹽害的機制。但隨著鹽濃度的增加，APX活性在根中明顯高于對照，而且差異達到顯著。說明在鹽脅迫下枸杞體內會自動增強酶的活性，緩解鹽脅迫對其的傷害。POD在根和葉中的活性呈先增加后降低的趨勢，說明在低濃度鹽逆境脅迫下枸杞會通過自身的抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化劑對活性氧進行清除，從而提高其抗逆性，但隨著鹽濃度的增加，活性會逐漸降低，幼苗會受到一定程度的傷害。然而，CAT活性在根和葉中表現(xiàn)出先下降后上升的增長趨勢。這說明植物對鹽脅迫可能有一個適應的過程，要先在特定的環(huán)境下激發(fā)酶的活性，待其穩(wěn)定后才起作用。隨著鹽脅迫時間的延長，SOD活性在葉中隨處理時間的延長活性增強，一直維持在較高水平，說明枸杞具有較強的抗鹽脅迫能力，脅迫長達10 d SOD活性依然沒有下降；根中在脅迫初期顯著上升，脅迫5 d時下降，然而在10 d時又顯著上升，說明枸杞在一定脅迫下幼苗會受到傷害，活性逐漸降低。由于枸杞抗鹽能力較強，在幼苗受到傷害后會誘導其增強活性，使枸杞在長時間脅迫下SOD仍能與超氧陰離子反應。APX活性在葉中脅迫初期顯著上升，后期出現(xiàn)略有下降趨勢，說明隨著枸杞體內的鹽積累量的增加致使活性氧平衡系統(tǒng)遭到破壞，使其酶活性下降，造成過剩的活性氧不能及時清除，導致枸杞對鹽害的防御能力下降；在根中脅迫初期顯著下降，后期的上升活性保持對照水平。說明鹽脅迫可能有一個適應的過程，要先在特定的環(huán)境下激發(fā)酶的活性，待其穩(wěn)定后才起作用。POD活性在葉和根中的變化趨勢一致都表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢，說明枸杞體內抗氧化保護酶防御系統(tǒng)隨激活需要有一個誘導的過程，從而使其對鹽脅迫有一定的耐受能力。隨著鹽處理時間的延長，CAT在葉中變化不顯著，在根中顯著上升，明顯高于對照并一直在維持較高水平。說明枸杞能夠適應一定程度的鹽脅迫，在長期鹽脅迫下依然能夠增強其活性，提高枸杞抗鹽能力。整個抗氧化酶系統(tǒng)的防御能力的變化是這幾種酶彼此協(xié)調作用的結果，膜脂過氧化作用涉及到多種活性氧及酶促和非酶促保護系統(tǒng)的復雜平衡關系。

大量研究顯示，在鹽脅迫下許多植物會在體內積累大量滲透調節(jié)物質，通過滲透調節(jié)和滲透保護來適應逆境條件。脯氨酸（Pro）是一種重要的有機滲透調節(jié)物質。脯氨酸除作為植物細胞質內滲透調節(jié)物質外，還在穩(wěn)定生物大分子結構、降低細胞酸性、解除氨毒、作為能量庫調節(jié)細胞氧化還原勢等方面起重要作用。在逆境條件下（旱、鹽堿、熱、冷、凍），植物體內脯氨酸的含量會顯著增加。植物體內脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性。結果顯示，隨著鹽濃度的升高，枸杞葉片中的脯氨酸積累越多（見圖4）。說明當枸杞遭遇鹽脅迫時其體內主動調節(jié)來適應鹽脅迫帶來的傷害。隨著鹽脅迫的時間變長，根中脯氨酸含量第1天呈緩慢上升，到5 d與對照達到顯著差異（見圖8）。這一結果說明，脯氨酸的大幅增加，必須要經過前期鹽脅迫的刺激和信號傳導等過程。由于根向葉輸送鹽需要一個過程，因此葉中鹽脅迫前5d差異不顯著，到10 d時差異達到顯著水平（見圖8）。

可溶性糖（葡萄糖、果糖、蔗糖、果聚糖等）和可溶性蛋白也是2種重要的滲透調節(jié)物質。高等植物在鹽脅迫或水分脅迫條件下通過滲透調節(jié)以維持細胞的膨壓。滲透調節(jié)包括對無機離子及有機小分子物質的轉運、累積和區(qū)隔化分布[15]。細胞內的各種碳化合物（碳水化合物、糖醇及有機酸）和含氮化合物等滲透調節(jié)物質參與細胞的滲透調節(jié)。有機溶質在維持細胞的滲透壓的平衡過程中發(fā)揮了重要的作用。此外，它們還可以保護細胞質內的酶免受鹽基離子的損傷。隨著鹽濃度的升高，枸杞葉片中的可溶性糖含量顯著升高，根中的可溶性糖含量顯著升高后顯著降低，但仍高于對照水平。無論處理組還是對照葉片中的可溶性糖含量始終高于根中的含量。這與徐晨等人[23]在鹽脅迫下水稻葉片相比根系積累了更多的可溶性糖的研究結果一致。隨著鹽濃度的升高，葉中的可溶性蛋白含量先顯著降低后顯著回升，但仍低于對照水平，根中的可溶性蛋白含量呈顯著上升趨勢；隨著鹽脅迫的時間延長，葉片中可溶性蛋白含量變化不顯著，根中的可溶性蛋白含量顯著升高。無論是鹽脅迫濃度的增加還是鹽脅迫時間的延長，可溶性蛋白在各器官中的分布規(guī)律為根＞葉，與丙二醛的分布正好相反，說明在鹽脅迫下，可溶性蛋白優(yōu)先在地下部分積累，并利用其高含量緩解了鹽分對根部的直接傷害。脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白在鹽脅迫期間的變化說明，有機溶質通過維持植物細胞的滲透壓的方式在枸杞對抗鹽脅迫的過程中發(fā)揮了重要作用。此結論與李永潔[24]在黑果枸杞幼苗對干旱脅迫的生理響應研究中發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞幼苗能有效積累脯氨酸和可溶性糖來改變細胞滲透勢，從而改變自身的滲透調節(jié)能力，以提高自身抗旱能力的結論一致。

植物細胞在鹽脅迫下所能忍受的活性氧水平存在一個閾值，在閾值內，植物能夠通過提高抗氧化酶活性來清除活性氧自由基，當超過這個閾值時，抗氧化酶活性便會受到抑制，活性氧過多積累，對植物組織會造成傷害[25]。試驗中，隨著鹽脅迫的增強和鹽脅時間的延長，抗氧化系統(tǒng)的各項指標并未整體出現(xiàn)達到某值時，其活性急速下降至很低水平，致使植株壞死的現(xiàn)象，說明試驗設計的脅迫濃度和脅迫時間均未達到枸杞耐鹽的閾值。因此，枸杞對鹽漬化土壤有較強的適應能力，這與劉克彪[26]的黑果枸杞種子萌發(fā)對水分和鈉鹽脅迫的響應研究結論具有相似性。在高鹽濃度的鹽脅迫條件下，枸杞體內大量累積脯氨酸，對枸杞長期處在高鹽濃度條件下起到重要的保護作用。在長時間的鹽脅迫條件下，后期的抗氧化酶的累積及滲透調節(jié)物質的累積可以保證枸杞耐受長時間的鹽脅迫。根據河北濱海平原土壤鹽漬特點，試驗探討了枸杞在鹽脅迫條件下生理生化指標的變化，揭示枸杞對鹽脅迫的生理響應，對更好地利用枸杞改良鹽堿地和生產高品質的枸杞具有重要科學和現(xiàn)實意義。綜合評價，在鹽脅迫下，枸杞通過SOD，CAT等抗氧化物質及可溶性糖、脯氨酸等滲透調節(jié)物質清除活性氧自由基，保護細胞膜結構，降低過氧化傷害，維持了細胞膜的穩(wěn)定性和完整性，從而提高枸杞的耐鹽性。在高鹽濃度處理（150 mmol/L） 條件下，鹽脅迫長達10 d時，抗氧化系統(tǒng)和滲透調節(jié)物質仍然沒有達到紊亂致使不起保護細胞膜結構作用。說明枸杞抗鹽性較強，適合在鹽堿地種植。但試驗中的濃度設置還未達到枸杞鹽濃度的閾值范圍，對于枸杞耐鹽濃度的閾值還需進一步深入研究。