玉米苞葉HPLC指紋圖譜的研究

周曙光，甄丹丹，陳明偉，丘 琴，甄漢深

（1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

玉米苞葉也稱玉米苞皮，是禾本科玉蜀黍?qū)僦参镉衩祝╖ea mays L）果穗外部的包被部分［1］，為玉米收割后的廢棄物。我國是玉米的生產(chǎn)大國，玉米苞葉資源豐富，其含有大量的纖維素、一定量的淀粉、總黃酮及單糖多糖等活性成分。研究表明，玉米苞葉具有降低血脂［2-4］、抗氧化［5］、抑制 α-糖苷酶活性而降糖等藥理作用［6］。目前還沒有關(guān)于玉米苞葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，為此，筆者對廣西十個不同產(chǎn)地玉米苞葉的HPLC指紋圖譜進(jìn)行研究，為建立玉米苞葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，為玉米苞葉的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試藥

1.1 儀器 Alliance e2695高效液相儀（美國沃特世）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀有限公司）；Millipore Simplicity-185超純水儀（美國密里博公司）；AJ150電子天平分析天平（瑞士梅特勒）；色譜柱：非羅門OOG-4435-EO（C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 試劑與試藥 乙腈（德國默克股份有限公司，色譜純）；甲醇（德國默克股份有限公司，色譜純）；乙酸乙酯（國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司，分析純，批號：20140320）；95%乙醇（廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心，分析純，批號：20130715）；正丁醇（上海申博化工有限公司，分析純，批號：20140620）；冰乙酸（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，色譜純，批號：20150930）；超純水。本實(shí)驗(yàn)所用玉米苞葉經(jīng)廣西一心藥業(yè)馬利飛副主任藥師鑒定為禾本科玉蜀黍?qū)僦参镉衩祝╖ea mays L）的苞葉。藥材來源見表1。

表1 10個不同產(chǎn)地的玉米苞葉

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 取玉米苞葉藥材粉末約5g，精密稱定，置50ml錐形瓶中，加入30ml95%乙醇溶液，搖勻，于超聲波清洗器中超聲提取45min，冷卻，過濾，置于水浴鍋上揮干溶劑，加5 ml甲醇溶解，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱定蘆丁對照品56.66mg，置25 ml容量瓶中，加70%乙醇溶解，定容至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱：phenomenonC18（5μm，4.6mm×250 mm）色譜柱；流動相系統(tǒng)見表 2；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μl；流速：0.8 ml/min。

表2 流動相組成

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 按2.1項(xiàng)下方法制備供試樣品溶液，按2.3項(xiàng)下的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。計(jì)算保留時間和峰面積的精密度。保留時間RSD值為0.09%～0.47%，峰面積的RSD值為0.64%～5.17%。RSD值均符合儀器精密度要求，結(jié)果見表3、表4。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一產(chǎn)地玉米苞葉6份，各約5 g，按2.1項(xiàng)下制備供試品溶液，并按2.3項(xiàng)下的色譜條件測定。結(jié)果，保留時間的RSD值為0.08%～0.50%，峰面積的RSD值為0.02%～2.08%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。結(jié)果見表5、表6。

表3 玉米苞葉精密度試驗(yàn)結(jié)果（保留時間）

表4 玉米苞葉精密度試驗(yàn)結(jié)果（峰面積）

表5 玉米苞葉重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（保留時間）

表6 玉米苞葉重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（峰面積）

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取玉米苞葉1份，約5 g，按2.1項(xiàng)下供試品溶液制配方法制配，并按2.3項(xiàng)下的色譜條件測定，記錄圖譜。分別在 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h檢測圖譜，考察穩(wěn)定性。結(jié)果各色譜峰的保留時間RSD值為0.07%～0.51%，峰面積的RSD值為0.50%～1.78%。說明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。見表7、表8。

表7 玉米苞葉穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（保留時間）

表8 玉米苞葉穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（峰面積）

2.5 建立指紋圖譜

2.5.1 空白試驗(yàn) 按2.3項(xiàng)下的條件測定，以提取溶劑為供試品，記錄圖譜。提取溶劑及流動相中沒有雜質(zhì)干擾。結(jié)果見圖1。

2.5.2 延長沖洗試驗(yàn) 取一供試品溶液，按2.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，梯度洗脫120 min。從圖上可以看出60 min以后再也沒有其他色譜峰出現(xiàn)。見圖2。

圖1 空白溶劑色譜圖

2.6 參照峰的建立 依照指紋圖譜研究的有關(guān)規(guī)定，制定指紋圖譜參照物。由供試品中所含化學(xué)成分的性質(zhì)，選擇合適的對照品作為參照物。本課題實(shí)驗(yàn)研究中，2號峰為已知物蘆丁。所以選擇2號峰為參照峰，進(jìn)行相對保留時間和相對峰面積的計(jì)算，符合指紋圖譜的要求。按2.3項(xiàng)下的色譜條件取對照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣，結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 蘆丁對照品色譜峰

圖5 A號樣品色譜圖

圖2 玉米苞葉120分鐘色譜圖

圖4 玉米苞葉樣品色譜峰

2.7 各批玉米苞葉的指紋圖譜的采集 取10批玉米苞葉按2.1項(xiàng)下供試品溶液制備方法配制供試品溶液，再按2.3項(xiàng)下的色譜條件測定，分別記錄各色譜圖，見圖5～圖14。10批玉米苞葉疊加色譜圖見圖15。

圖6 B號樣品色譜圖

圖7 C號樣品色譜圖

圖8 D號樣品色譜圖

圖9 E號樣品色譜圖

圖10 F號樣品色譜圖

圖11 G號樣品色譜圖

圖12 H 號樣品色譜圖

圖13 I號樣品色譜圖

圖14 J號樣品色譜圖

圖15 10批不同產(chǎn)地玉米苞葉疊加色譜圖

2.8 共有指紋峰的標(biāo)定 采用國家藥典頒布的中藥色譜指紋圖譜（2012.1版本）評價軟件進(jìn)行自動匹配10批玉米苞葉藥材，以2號色譜峰蘆丁為參照圖譜，標(biāo)定其中匹配數(shù)目8個色譜峰為共有指紋峰，以平均數(shù)法作為對照指紋圖譜的生成方法，設(shè)定時間寬度為0.1 min，提取玉米苞葉藥材的共有模式建立對照指紋圖譜，見圖16。

圖16 共有模式建立對照指紋色譜圖

本實(shí)驗(yàn)選擇玉米中成分含量比較穩(wěn)定的2號色譜峰—蘆丁為指紋圖譜參照峰，設(shè)定參照峰的相對保留時間和相對峰面積為1，以此為基準(zhǔn)分別計(jì)算出10批玉米苞葉的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表9、表 10。

2.9 10批玉米苞葉非共有峰面積的百分比 見表11。

2.10 玉米苞葉藥材相似度評價 見表12。由結(jié)果可以看出，10批不同產(chǎn)地的玉米苞葉藥材的相似度均大于0.8，相似度較好。

表9 10批玉米苞葉的相對保留時間

表10 10批玉米苞葉的相對峰面積

表11 10批玉米苞葉非共有峰面積的百分比

表12 玉米苞葉藥材相似度

3 討論與小結(jié)

3.1 供試品的制備方法考察 本實(shí)驗(yàn)分別用水、95%乙醇、乙酸乙酯作為提取溶劑，分別對玉米苞葉進(jìn)行超聲提取和回流提取，結(jié)果以95%乙醇超聲提取的提取結(jié)果較好。

3.2 色譜柱的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了Thermo C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）色譜柱、Agilent WondaSil C18-WR（5 μm，250 mm×4.6 mm）色譜柱和 phenomenon C18（5 μm ，250 mm×4.6 mm）色譜柱。結(jié)果 phenomenon C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）色譜柱分離出來的色譜峰比較豐富，且分離效果較好。

3.3 流動相的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水系統(tǒng)、甲醇-0.1%冰乙酸系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)、乙腈-0.1%冰醋酸系統(tǒng)，結(jié)果提示乙腈-0.1%冰醋酸為最理想的流動相，該條件下峰形尖、較對稱、不拖尾、無陰性干擾。

3.4 檢測波長的確定 本實(shí)驗(yàn)使用了DAD檢測器，對樣品進(jìn)行190～400 nm全波長掃描，獲得3D圖，并重點(diǎn)考查了 250 nm、280 nm、300 nm、320 nm、340 nm波長處色譜圖。結(jié)果顯示在色譜峰最豐富的波長為250 nm，但是分離度差而且蘆丁對照品出峰不明顯。綜合考慮分離度及對照品的出峰情況，最終確定280nm為本指紋圖譜實(shí)驗(yàn)的檢測波長。

3.5 柱溫的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了20℃、25℃和30℃三個不同柱溫的色譜圖，三個圖總體相差不大，但25℃峰形整體比較好而且基于對色譜柱和儀器的保護(hù)，所以選擇25℃為檢測溫度。

3.6 流速的確定 本實(shí)驗(yàn)分別考察了0.5 ml/min、0.8 ml/min和1.0 ml/min流速對有效成分出峰的影響。結(jié)果0.5 ml/min、1.0 ml/min流速的色譜圖分離效果不好，因此選用0.8 ml/min流速。

3.7 小結(jié) 本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對10批不同產(chǎn)地玉米苞葉進(jìn)行HPLC指紋圖譜研究，并采用相似度軟件對色譜峰數(shù)據(jù)進(jìn)行評價，建立了玉米苞葉HPLC指紋圖譜，結(jié)果表明，各批次玉米苞葉的整體圖貌基本一致，確定了8個共有峰，相似度均在0.8以上。因此HPLC特征指紋圖譜能夠有效評價玉米苞葉，可作為其質(zhì)量的評價方法，為完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。