人參白虎湯證發(fā)熱大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究*

張序晴，王志琪，李 賽，周志華，彭 蘭，李耀偉，蒲科婷，叢夢(mèng)靜

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化及功能工程中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

人參白虎湯出自《傷寒論》，主治癥見(jiàn)“傷寒，若吐若下后，……，表里俱熱，……，大渴，……，欲飲水?dāng)?shù)升者”，即陽(yáng)明里熱兼有氣津兩傷。雖人參白虎湯解熱作用已被臨床實(shí)踐證實(shí)，然關(guān)于其解熱作用機(jī)制研究的報(bào)道較少。課題組在前期通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法測(cè)算了人參促白虎湯解熱作用的可能的免疫學(xué)機(jī)制[1]，若要開(kāi)展后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證則需使用相應(yīng)的動(dòng)物模型。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為苦寒中藥能夠損陰傷津，灌胃苦寒中藥造模符合中醫(yī)“下”法致虛的理論[2-3]。目前發(fā)熱動(dòng)物模型中，研究解熱藥物的作用及機(jī)制常用腹腔注射LPS復(fù)制的大鼠模型[4]，課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)灌胃大黃芒硝水煎液后再腹腔注射LPS可成功建立腹瀉高熱模型，且大鼠發(fā)熱的具體情況與大黃芒硝水煎液的灌胃天數(shù)有關(guān)[5]。因此本次實(shí)驗(yàn)使用大鼠灌胃 0、1、3、5、7 d的大黃芒硝湯并結(jié)合腹腔注射 LPS的方法復(fù)制發(fā)熱的大鼠模型，并對(duì)該模型大鼠的免疫功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為人參白虎湯證發(fā)熱動(dòng)物模型的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠，SPF級(jí)，雄性，25只，體質(zhì)量170～200 g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：1100111911002984，許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0005。本實(shí)驗(yàn)的環(huán)境與設(shè)施條件符合中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施》，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)單位的許可證編號(hào)為SYXK（湘）2013-0005。正式實(shí)驗(yàn)前，大鼠于溫度基本恒定（22±2）℃，相對(duì)濕度不發(fā)生較大改變（55±2）%的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d（每只大鼠每天喂食1次，每次喂食15 g大鼠飼料，并提供水源）。

1.1.2 藥物 大黃（飲片，湖南橫岳中藥飲片有限公司，批號(hào)：19100103）；芒硝（飲片，湖南省宏華中藥飲片有限公司，批號(hào)：181204）；LPS（sigma 公司，批號(hào)：L-2880）。

1.2 藥液的制備 大黃芒硝湯制備[6]：大黃與芒硝按照4∶3的比例配伍，制備時(shí)首先稱取適量大黃放置于1 000 mL圓底燒瓶中，隨后加入10倍量蒸餾水，浸泡30 min。再使用電熱套加熱的冷凝回流裝置，將浸泡過(guò)的大黃加熱，至溶液沸騰后并保持微沸狀態(tài)15 min。隨后將所制得水煎藥液用紗布（兩層）趁熱過(guò)濾，取濾液，并將其趁熱加入裝有已稱好芒硝的燒杯中，邊加熱邊攪拌使芒硝充分溶解。隨即在減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中將大黃芒硝水煎藥液進(jìn)行濃縮，濃縮后所得的藥液中每1 mL應(yīng)含生藥1.30 g。

LPS溶液制備[7]：將LPS用0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行稀釋，最終配置成 100 μg/mL的LPS溶液。LPS溶液于臨用前新鮮配制。

1.3 動(dòng)物的分組與造模 經(jīng)過(guò)適應(yīng)性飼養(yǎng)的Wistar大鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為5組，分別為灌胃0 d組、灌胃1 d組、灌胃3 d組、灌胃5 d組、灌胃7 d組，每組5只。各組動(dòng)物于正式實(shí)驗(yàn)第1天起，每天2次，連續(xù) 7 d 定時(shí)（早上 8∶30 和晚上 18∶30）進(jìn)行體溫測(cè)定以及灌胃大黃芒硝湯（按照1 mL/100 g體積給藥）。灌胃0 d組連續(xù)7 d按上述方法灌胃給予提藥用的超純水；灌胃1 d組按上述方法連續(xù)6 d灌胃給予蒸餾水，在實(shí)驗(yàn)第7天灌胃大黃芒硝湯；其余各組以此類推進(jìn)行灌胃操作。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于正式實(shí)驗(yàn)第7天前6 h進(jìn)行禁食，最后一次灌胃大黃芒硝湯后觀察大鼠是否有腹瀉情況產(chǎn)生，出現(xiàn)腹瀉后行腹腔注射LPS溶液1次，給藥劑量為100 μg/kg。

1.4 樣本采集與指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 大鼠的一般狀態(tài) 觀察灌胃給藥大黃芒硝湯后各組大鼠的活動(dòng)以及呼吸頻率、精神狀態(tài)、皮毛色澤、糞便稀軟程度等情況。

1.4.2 大鼠體溫的變化 體溫測(cè)量方法：將歐姆龍電子體溫計(jì)（MC-347）涂上甘油插入大鼠肛門約2 cm處。于正式實(shí)驗(yàn)第7天，在大鼠灌胃給藥大黃芒硝湯的末次，以出現(xiàn)明顯腹瀉為提示，之后每隔30 min測(cè)定大鼠體溫1次，共計(jì)測(cè)定體溫3次，并作為基礎(chǔ)體溫。隨后注射LPS，每隔1 h測(cè)定1次體溫，共測(cè)定體溫11次。將注射LPS前后體溫進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比。

1.4.3 生物樣本采集 于正式實(shí)驗(yàn)第7天，末次灌胃后大鼠出現(xiàn)明顯腹瀉時(shí)分別收集各組糞便，隨后進(jìn)行第1次眼眶血樣采集。再注射LPS，待測(cè)完最后一次體溫，麻醉大鼠，通過(guò)腹主動(dòng)脈進(jìn)行第2次采血，并摘取大鼠脾臟。

1.4.4 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 將所采集的大鼠糞便進(jìn)行稱重，放入烘箱烘干后，再稱重，糞便含水量%=（烘干前質(zhì)量-烘干后質(zhì)量）/烘干前重量×100%；將大鼠脾臟稱重并計(jì)算脾臟指數(shù)：脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/大鼠體重×10；采用全自動(dòng)血液分析儀將兩次采集的血樣進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般狀態(tài) 通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，隨著灌胃天數(shù)的增加，灌胃1、3、5、7 d組大鼠較灌胃0 d組大鼠活動(dòng)活躍程度出現(xiàn)明顯降低，且飲水量表現(xiàn)出明顯增高。灌胃1、3、5、7 d組大鼠的皮毛較灌胃0 d組大鼠明顯失去光澤，產(chǎn)生糞便明顯更加稀軟。其中灌胃5 d組大鼠產(chǎn)生糞便的稀軟程度較灌胃0、1、3、7 d組更加明顯。

2.2 大鼠各項(xiàng)指標(biāo)的變化

2.2.1 體溫變化 注射LPS后大鼠的體溫變化見(jiàn)表1。注射LPS 5 h后各組大鼠體溫呈現(xiàn)出明顯升高，隨后繼續(xù)升高。直到7 h左右體溫升高達(dá)到峰值，且較基礎(chǔ)體溫有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（*P<0.05），7 h后各組大鼠體溫開(kāi)始有下降趨勢(shì)。其中灌胃5 d組較灌胃0、1 d組最早出現(xiàn)體溫升高且體溫極值最大，較灌胃0、1、3、7 d組體溫最先升高到極值。

表 1 注射 LPS后 1～10 h各組大鼠體溫（±s，n=5，℃）

表 1 注射 LPS后 1～10 h各組大鼠體溫（±s，n=5，℃）

注：與基礎(chǔ)體溫比較，*P＜0.05

組別0 d基礎(chǔ)體溫 1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h 7 h 8 h 9 h 10 h 11 h 37.3±0.19 37.6±0.15 37.4±0.32 37.3±0.4 38.1±0.30 38.0±0.30*38.7±0.21*38.9±0.26*38.7±0.15*38.2±0.29*37.9±0.28*37.6±0.32 1 d 37.6±0.18 37.6±0.14 37.5±0.30 37.7±0.38 38.2±0.38 38.5±0.30*38.7±0.23*38.9±0.32*38.7±0.16*38.7±0.23*38.2±0.16*37.8±0.29 3 d 37.4±0.19 37.4±0.18 37.5±0.20 37.9±0.20*38.2±0.38*38.8±0.34*38.9±0.35*39.3±0.45*38.9±0.33*38.9±0.29*38.7±0.35*37.8±0.26 5 d 37.4±0.17 37.6±0.21 37.3±0.06 38.0±0.12*38.2±0.27*39.2±0.28*39.6±0.29*39.4±0.16*38.9±0.32*38.8±0.29*38.5±0.24*37.9±0.27*7 d 37.4±0.33 37.4±0.29 37.4±0.15 37.9±0.17*38.1±0.35*38.8±0.19*39.4±0.14*39.4±0.14*38.9±0.43*38.8±0.24*38.6±0.42*37.7±0.16

2.2.2 脾臟指數(shù)、糞便含水量和血細(xì)胞計(jì)數(shù) 灌胃天數(shù)對(duì)大鼠脾臟指數(shù)以及糞便含水量的影響見(jiàn)表2。與灌胃0 d組比較，灌胃1、3、5、7 d組的脾臟指數(shù)均出現(xiàn)明顯下降，糞便含水量均出現(xiàn)升高。其中灌胃5 d組較灌胃0 d組脾臟指數(shù)的變化顯著，較其他灌胃組的糞便含水量有明顯升高。

灌胃天數(shù)對(duì)大鼠血液中各類細(xì)胞數(shù)目的影響見(jiàn)表3。通過(guò)比較注射LPS前后的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)各組大鼠的白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞數(shù)均有增加，淋巴細(xì)胞數(shù)有所減少。且其中灌胃5 d組的白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)較灌胃1、3、7 d組明顯增多，而淋巴細(xì)胞的數(shù)目較灌胃0 d組有明顯減少。

表2 灌胃天數(shù)對(duì)大鼠脾臟指數(shù)以及糞便含水量的影響（±s，n=5）

表2 灌胃天數(shù)對(duì)大鼠脾臟指數(shù)以及糞便含水量的影響（±s，n=5）

注：與灌胃0天組比較，*P＜0.05；與灌胃5天組比較，▲P<0.05

灌胃天數(shù)/d檢測(cè)指標(biāo)0 1 3 5 7脾臟指數(shù) 0.31±0.003▲ 0.28±0.005*▲ 0.26±0.002*▲ 0.22±0.001* 0.23±0.003*糞便含水量%49.4±8.74▲ 69.0±9.01*▲ 85.0±0.38*▲ 91.4±2.92* 82.6±2.49*▲

表3 灌胃天數(shù)對(duì)大鼠血液中各類細(xì)胞數(shù)目的影響（±s，n=5）

表3 灌胃天數(shù)對(duì)大鼠血液中各類細(xì)胞數(shù)目的影響（±s，n=5）

注：與灌胃0天組比較，*P＜0.05；與灌胃5天組比較，▲P<0.05

注射LPS前注射LPS后0 1 3 5 7 0 1 3 5 7中性粒細(xì)胞數(shù) 5.2±0.43 5.8±1.02 5.6±1.50 5.1±1.23 5.9±1.02 7.2±0.90▲ 8.0±0.44▲ 10.2±2.40*▲ 18.5±3.82*12.8±1.4*▲白細(xì)胞數(shù)淋巴細(xì)胞9.8±0.69 10.4±2.83 10.2±4.53 10.8±2.1910.8±1.3112.8±1.70▲ 13.8±1.06*▲ 13.7±2.04*▲ 21.4±0.99*15.9±2.65*▲6.5±0.74▲ 5.9±0.69▲ 4.5±0.56*4.1±1.69*4.9±0.78*6.17±1.05▲ 6.1±0.16▲ 4.8±0.32* 4.6±0.41*4.8±0.87*

分析以上數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，灌胃5 d組大鼠注射LPS后升溫潛伏期最短，且升溫達(dá)到極值時(shí)間最短，體溫極值最大，其糞便含水量最高。在血液中的各類細(xì)胞的數(shù)目中灌胃5 d組大鼠較其他灌胃組的白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞明顯增加，淋巴細(xì)胞的數(shù)目同灌胃0 d組相比明顯減少。

3 討論

高熱是多種臨床疾病中常見(jiàn)的表現(xiàn)形式，并且由高熱所致的體征（如體溫調(diào)節(jié)紊亂、體質(zhì)減弱等）變化，往往對(duì)應(yīng)著不同的發(fā)熱機(jī)理[8]?，F(xiàn)有關(guān)于解熱藥物的治療機(jī)理研究以及發(fā)熱大鼠模型的建立大多基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論，基于中醫(yī)藥理論對(duì)解熱藥機(jī)理的研究，及針對(duì)中醫(yī)熱證的模型并不多見(jiàn)[9]。已有虛熱證動(dòng)物模型的造模往往采用給大鼠灌胃熱性中藥（多為復(fù)方）合并腹腔注射致熱藥物和激素類藥物或高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的方法，致使大鼠陰液大損[10-12]。

人參白虎湯證屬中醫(yī)氣分熱證之陽(yáng)明病，系體內(nèi)陰陽(yáng)調(diào)節(jié)紊亂，熱氣盛盈，邪熱未被完全從體內(nèi)清除，表現(xiàn)為氣陰大傷，治療宜清熱、滋陰，補(bǔ)益[13]?！秱摗分嘘P(guān)于人參白虎湯的原文為“傷寒，若吐若下后，七八日不解，熱結(jié)在里，表里俱熱，時(shí)時(shí)惡風(fēng)，大渴，舌上干燥而煩，欲飲水?dāng)?shù)升者，白虎加人參湯主之”，提示如應(yīng)用中醫(yī)的“下”法引起體虛再結(jié)合LPS復(fù)制發(fā)熱動(dòng)物模型很可能符合人參白虎湯證。中醫(yī)認(rèn)為苦寒中藥能夠損陰傷津，灌胃苦寒中藥造模符合中醫(yī)“下”法致虛的理論?，F(xiàn)大多數(shù)研究使用的腹腔注射LPS致熱也是制備發(fā)熱模型的經(jīng)典方法。氣血津液虧損導(dǎo)致的體虛與免疫有著高度相關(guān)性[14]，發(fā)熱與天然免疫及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[15-16]，故炎癥和免疫功能的相關(guān)指標(biāo)可作為評(píng)價(jià)體虛高熱模型的指標(biāo)之一。

在炎癥發(fā)生的過(guò)程中，中性粒細(xì)胞會(huì)通過(guò)一系列聯(lián)級(jí)反應(yīng)來(lái)對(duì)抗人體中出現(xiàn)的炎癥，從而起到維持人體的機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡。而白細(xì)胞在抑制炎癥方面起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)解作用。因此當(dāng)炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，中性粒細(xì)胞的數(shù)目與白細(xì)胞數(shù)目均會(huì)有所提升[17-18]。淋巴細(xì)胞則是免疫系統(tǒng)中重要的細(xì)胞，可以起到對(duì)免疫的調(diào)節(jié)作用，當(dāng)免疫功能急劇減弱時(shí)會(huì)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞的減少[19]。同樣在免疫功能中起著重要作用的還有脾臟這一臟器，當(dāng)免疫功能低下的時(shí)候脾臟指數(shù)也會(huì)隨之下降[20-21]。

實(shí)驗(yàn)的體溫變化與糞便含水量數(shù)據(jù)顯示，灌胃大黃芒硝湯的天數(shù)對(duì)發(fā)熱及腹瀉程度有影響，且灌胃5 d組的腹瀉發(fā)熱效果最好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明白細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的數(shù)目同腹腔注射LPS所致的發(fā)熱密切相關(guān)，具體表現(xiàn)為腹腔注射LPS后白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)目增加；而脾臟指數(shù)與淋巴細(xì)胞的數(shù)目則同灌胃大黃芒硝湯后所致的體虛有關(guān)，且灌胃大黃芒硝湯天數(shù)不同，脾臟指數(shù)和淋巴細(xì)胞的減少也有所不同。其中灌胃5 d組白細(xì)胞與中性粒細(xì)胞數(shù)以及脾臟指數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)的變化均是最為顯著的，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)研究中，復(fù)制方證動(dòng)物模型是難點(diǎn)之一。本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，灌胃苦寒性瀉下中藥大黃芒硝湯結(jié)合注射LPS可以成功建立體虛高熱模型，其脾臟指數(shù)與各類血細(xì)胞計(jì)數(shù)是體虛高熱動(dòng)物模型免疫功能的評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。從統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較中可以得出灌胃5 d組可以建立出更為理想的體虛高熱大鼠模型，也更符合人參白虎湯證。該模型的建立可為人參白虎湯解熱機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)。