超聲制漿工藝對冷凍干燥豆腐制備及品質的影響

劉寶華，佟曉紅，吳長玲，綦玉曼，劉宗政，張菀坤，李 楊，江連洲，陳復生，馬傳國，王中江,*

（1.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南 鄭州 450052）

葡萄糖酸-δ-內酯（gluconic acid lactone，GDL）豆腐是以GDL為促凝劑制作的豆腐，其制作工藝通常包括兩步加熱：先在中性pH值條件下加熱豆?jié){，隨后加入GDL酸化后再在酸性條件下加熱[1]。GDL會釋放質子中和大豆蛋白聚合物表面所帶負電荷，隨后通過氫鍵、離子相互作用等形成三維網狀結構[2]。由于GDL豆腐中含有大量水分和蛋白質，極易腐敗變質，不易運輸。將其冷凍制成凍豆腐后，雖然滿足了運輸和貯藏需求，但復水后卻沒有傳統豆腐的細膩感，并有海綿體形成，影響了口感[3]。

近年來，超聲處理被廣泛應用于食品改性中。超聲波的空穴效應使得液體迅速形成氣泡并破裂[4]，進而可產生強大的剪切力和混合效應[5]，從而可對各種蛋白溶液進行改性。Tang Chuanhe等[6]研究發(fā)現高場強超聲能夠使大豆分離蛋白的溶解性和凝膠性提高。Hu Hao等[7]研究發(fā)現高場強超聲波可以降低大豆分離蛋白溶液的粒徑，提高GDL誘導大豆分離蛋白凝膠的凝膠強度、凝膠硬度和持水性。Madadlou等[8]研究發(fā)現超聲處理能夠推遲酪蛋白的凝膠點并提高其凝膠硬度。由于豆腐的功能特性與大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）的變性和聚集程度有關，而超聲處理可以導致天然SPI發(fā)生變性和聚集，所以推測超聲處理有可能會對GDL豆腐的功能特性產生影響，進而改變冷凍干燥豆腐的質地。鄒曉霜等[9]通過向豆乳中加入淀粉、高麥芽糖漿、凝固劑得到填充豆腐，并利用響應面優(yōu)化法確定了豆腐最優(yōu)冷凍干燥工藝：物料厚度9.00 mm、預凍降溫速率-0.70 ℃/min、冷阱溫度-48.7 ℃、真空度70 Pa、加熱板溫度51.9 ℃，經此工藝制備得到高復水比冷凍干燥豆腐。Harnkarnsujarit等[10]在豆腐冷凍前采用短時液氮冷凍處理，得到了具有高復水率的冷凍干燥豆腐。鑒于此，本實驗通過對豆?jié){進行超聲處理（0、100、200、300、400、500 W，10 min）并制備成GDL填充豆腐，聯合短時液氮處理和真空冷凍干燥技術制備冷凍干燥豆腐，明晰超聲制漿工藝對冷凍干燥豆腐制備及品質的影響，以期為將超聲制漿工藝運用于冷凍干燥豆腐生產中提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（蛋白質量分數42.8%、脂肪質量分數18.2%）東北農業(yè)大學大豆研究所；消泡劑 鄭州大志食品有限公司；GDL 江西新黃海醫(yī)藥食品化工有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JJ-2型組織搗碎勻漿機 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；JY92-IIN超聲波細胞粉碎機 寧波新藝超聲設備有限公司；DK-S12數顯恒溫水浴鍋 上海三發(fā)科學儀器有限公司；Zetasizer Nano-ZS90光散射粒度分析儀 英國馬爾文公司；FD-5型真空冷凍干燥機北京博醫(yī)康技術公司；SU8020冷場掃描電子顯微鏡日本日立公司；TA.XT PLUS質構儀 英國SMS公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲制漿工藝

將新鮮大豆清洗干凈，以料液比1∶5（m/V）的比例浸泡于蒸餾水中15 h，將浸泡好的大豆以料液比1∶5（m/V）磨漿，用棉布過濾兩次后加入0.01 g/100 mL消泡劑消除泡沫。由于豆?jié){的煮漿時間為10 min，因此本實驗以不同超聲功率對豆?jié){進行同步10 min超聲處理。分別取適量的豆?jié){于超聲波細胞破碎儀（探頭直徑為0.636 cm）中，液面浸沒變幅桿頂端3 cm，分別在超聲功率0、100、200、300、400、500 W條件下超聲10 min，超聲頻率為20 kHz，溫度為20 ℃，工作時間和間歇時間均為4 s，以冰水浴控制超聲溫度，并每隔5 min向冰水浴中加入冰塊保持低溫。

1.3.2 冷凍干燥豆腐的制作工藝

參考鄒曉霜[9]和Harnkarnsujarit[10]等的方法制備冷凍干燥豆腐，并略作修改。

將處理后的豆?jié){煮沸10 min，冷卻至70 ℃時加入GDL使其終質量濃度為0.30 g/100 mL，充分混勻后置于80 ℃恒溫水浴鍋中保溫30 min得到豆腐花，隨后壓制成GDL豆腐（壓力為0.01 kg/cm2）。將GDL豆腐切成10 mm×10 mm×9 mm的豆腐塊，置于-196 ℃液氮中保存15 min后轉移至-40 ℃冰箱冷凍24 h制成冷凍豆腐。隨后利用真空冷凍干燥機處理得到冷凍干燥豆腐。

1.3.3 豆?jié){的粒徑分布測定

豆?jié){的粒徑分布測定參考Cruz等[11]的方法，利用Zetasizer Nano-ZS90光散射粒度分析儀分別測定上述超聲處理后以及煮沸后的豆?jié){粒徑分布規(guī)律。蛋白質的折射率設定為1.46，水溶液的折射率設置為1.33。為了降低多重光散射效應，分析前用蒸餾水將豆?jié){稀釋1 000 倍體積后測粒徑。

1.3.4 豆腐析水率的測定

豆腐析水率的測定參考Harnkarnsujarit[10]和Puppo[12]等的方法。取質量約3 g剛制備好的鮮豆腐樣品于離心管中，3 000 r/min離心30 min，離心結束后吸干其表面水分，按公式（1）計算豆腐樣品的析水率。

式中：m1為離心前樣品的質量/g；m2為離心后樣品的質量/g。

1.3.5 冷凍干燥豆腐復水率的測定

參考鄒曉霜[9]和Harnkarnsujarit[10]等的方法對冷凍干燥豆腐復水率進行測定。將冷凍干燥豆腐置于25 ℃蒸餾水中，100 min后取出吸干表面水分，按公式（2）計算冷凍干燥豆腐的復水率。

式中：m1為復水前樣品的質量/g；m2復水后樣品的質量/g。

1.3.6 質地剖面分析測定

豆腐及復水后冷凍干燥豆腐質地剖面分析（texture profile analysis，TPA）測定參考姜梅[13]的方法。探頭為P/50，測定參數為：測前速率2 mm/s、測試速率1 mm/s、測后速率1 mm/s、觸發(fā)力3 g，進行兩次壓縮，壓縮比為30%，每次停留5 s。每個樣品重復測定3 次。

1.3.7 掃描電子顯微鏡觀察

將冷凍干燥豆腐置于液氮中脆斷，處理好后粘在金屬樣品臺上，斷裂面向上，采用離子濺射方法鍍金，鍍金的條件為15 kV、15 mA、1.5 min。然后將樣品置于掃描電子顯微鏡（10 kV、100 Pa）下觀察其顯微結構，圖像放大800 倍。

1.4 數據統計分析

所有數據均重復實驗3 次，結果表示為 ±s。數據統計分析采用SPSS 20軟件對數據進行方差分析（analysis of variance，ANOVA），P＜0.05為差異顯著。繪圖采用Origin 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 超聲制漿對豆?jié){粒徑的影響

豆?jié){是一種分散相（蛋白質、脂肪、碳水化合物和鹽類物質等）不連續(xù)分散在水（連續(xù)相）中所形成的水包油乳濁液復合體系[14]。圖1表示豆?jié){分別經超聲制漿/超聲制漿-煮沸的粒徑分布，由圖1A可知，未經超聲處理的豆?jié){體系在10～100 μm處存在一個小峰，而經超聲處理后，10～100 μm處的小峰消失且體系的粒徑分布向低粒徑處移動，這說明超聲處理可破碎豆?jié){體系內較大的液滴并顯著降低體系的粒徑（P＜0.05）。超聲制漿工藝對豆?jié){體積平均粒徑（D[4,3]）和體積-表面平均粒徑（D[3,2]）的影響如表1所示。超聲功率0～300 W內，豆?jié){的平均粒徑隨著超聲功率的增加而逐漸降低（D[4,3]從1.378 μm降至0.78 μm，D[3,2]從0.38 μm降至0.27 μm），這可能是由于超聲的空穴效應干擾了豆?jié){內蛋白質、脂肪等物質的分子間相互作用，使聚集物或顆粒減少。當超聲功率大于300 W時，豆?jié){的D[4,3]和D[3,2]均顯著升高（P＜0.05），這可能是由于超聲功率過大，致使體系內物質發(fā)生聚合[15]。

煮沸能促使豆?jié){中形態(tài)各異的蛋白質解離聚集成均一的顆?；蚓奂w，這些重新形成的聚集體的平均粒徑越小越有利于豆?jié){形成品質穩(wěn)定的豆腐[16-17]。因此，當經超聲處理的豆?jié){經煮沸處理后，其平均粒徑顯著下降（P＜0.05）。對比圖1A、B可知，豆?jié){經煮沸后其粒徑分布由較寬的“單峰+肩峰”圖轉變成較窄的單峰圖，且粒徑更多地分布在0.1～1 μm之間，顯著地改變了豆?jié){的粒徑分布（P＜0.05），這可能是由于熱作用使豆?jié){內較大的蛋白聚集物解聚[15]。Nik等[18]研究也表明熱處理可以改變豆?jié){的平均粒徑和粒徑分布。

表1 超聲制漿工藝對豆?jié){粒徑的影響Table 1 Effect of ultrasound pulping process on particle size of soybean milk

圖1 超聲制漿工藝對豆?jié){粒徑分布的影響Fig. 1 Effect of ultrasonic pulping process on particle size distribution of soybean milk

2.2 析水率及復水率分析

超聲制漿工藝對GDL豆腐析水率及冷凍干燥豆腐復水率的影響如圖2所示，超聲制漿可顯著降低GDL豆腐的析水率（P＜0.05），并且當超聲功率為300 W時，GDL豆腐的析水率最低。這可能是由于超聲處理提高了豆?jié){體系內蛋白的溶解性，降低了蛋白和脂肪等物質的粒度，使其形成更加均一的空間結構，而這種空間結構可能會有益于凝膠對水分子的綁定[15]。Wu Jianping等[19]研究發(fā)現蛋白的平均粒徑降低會使其凝膠的持水性能增強。Kao等[20]研究發(fā)現由于較小的孔隙可以更牢固地保留水分子，結構均一的蛋白質凝膠比非均勻結構的凝膠持水性高。Jambrak[21]和Li Chen[22]等認為在超聲處理過程中，大量空化氣泡的快速形成和塌陷會使氣泡周圍區(qū)域局部溫度和壓力大幅度增加，從而導致蛋白質通過水解解折疊暴露出疏水基團。由此可推測，超聲制漿使豆?jié){體系中蛋白質的疏水基團暴露，提高蛋白質分子間的疏水相互作用，促進熱聚集過程中蛋白-蛋白聚合物的形成，進而形成結構致密、均一的豆腐，降低其析水率。類似地，胡昊[15]研究發(fā)現超聲處理可以提高內酯大豆分離蛋白凝膠的持水性。而超聲功率大于300 W時，GDL豆腐的析水率增大，這可能是由于過高的功率致使豆?jié){體系內部分蛋白發(fā)生聚集，形成大的蛋白質聚合物，使豆腐內部存在較大的空隙，從而使水分更易從豆腐內部析出。由2.1節(jié)內容可知，超聲功率大于300 W時，豆?jié){體系的D[4,3]和D[3,2]均顯著增加（P＜0.05），該結果進一步佐證了這一推斷。

圖2 超聲制漿工藝對豆腐析水率及冷凍干燥豆腐復水率的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic pulping process on syneresis of tofu and rehydration rate of freeze-dried tofu

復水是冷凍干燥食品的重要特性。由圖2可知，冷凍干燥豆腐的復水率均高于90%，且冷凍干燥豆腐的復水率隨超聲功率的增強而升高，這可能是由于本實驗在-40 ℃冷凍前采用了液氮預處理。-196 ℃的超低溫預處理使豆腐內的水分迅速凍結，在冷凍干燥過程中冰晶升華留下小孔隙，這種小孔隙的存在致使水分迅速滲入冷凍干燥豆腐內部形成較高的復水率。前人的研究表明水分通過毛細管滲流（毛細管梯度壓力驅動）進入冷凍干燥物料中，而非擴散[23-25]。毛細管滲流是由于液體分子與固體分子間相對吸引力存在差別而產生的[26]。Datta等[26]研究發(fā)現，在冷凍干燥物料復水的初級階段，水分子通過毛細管作用迅速填滿冷凍干燥物料的孔隙，因此會瞬間吸收大量水分，物料發(fā)生凍結的溫度越低，冷凍干燥物料的孔隙就越小，從而會導致水分被較快地吸收，這是由于較小的孔隙促進了毛細管滲流作用。由此可進一步推測，超聲功率0～300 W時，由于超聲處理的均質作用使豆?jié){體系的平均粒徑降低，蛋白質結構局部解折疊，更多的疏水性氨基酸趨向暴露態(tài)[27]，疏水作用增強，形成分布均一、尺寸小的孔隙（圖3），進而增強了水分的毛細管作用，從而使冷凍干燥豆腐的復水率隨超聲功率的增強而提高。當超聲功率為400～500 W時，冷凍干燥豆腐的孔隙尺寸變大，抑制了水分的毛細管作用，從而降低了冷凍干燥豆腐的復水率。

2.3 TPA分析

豆腐和復水冷凍干燥豆腐的質構特性會影響它們的品質和能被消費者接受的程度。表2、3分別為豆腐和冷凍干燥豆腐復水后的TPA測定結果。

表2 超聲制漿工藝對豆腐質構特性的影響Table 2 Effect of ultrasonic pulping process on texture properties of tofu

由表2可知，隨著超聲功率的增大，豆腐的硬度、彈性、黏聚性和咀嚼性均呈先增大后下降的趨勢。豆腐的硬度主要與參與網絡結構形成的蛋白數量及形成網絡結構的作用力有關[28]。因此，當超聲功率為0～300 W時，隨著超聲功率的增強，豆?jié){體系內物質逐漸分散均勻，平均粒徑逐漸降低，蛋白質疏水基團暴露，蛋白-蛋白結合作用力逐漸增強，從而使豆腐的硬度逐漸增大。此外，Tomotada等[29]研究發(fā)現，向豆?jié){中加入凝固劑時，豆?jié){中的油滴（帶有蛋白）會參與豆腐網絡結構的形成，豆腐硬度隨網絡結構中油滴數量的增多而增大。由此可推測，隨著超聲功率的增加，豆?jié){體系中的油滴逐漸暴露出來，進而使參與形成蛋白網絡的油滴數量增多，從而使豆腐硬度增大。豆腐的彈性是指其在去除形變力后恢復到形變前條件下的高度比[13]。彈性高是由于樣品經首次壓縮后，其凝膠結構被分成幾大塊而造成的，彈性低則是由于樣品被分成了許多碎片[30]。因此，當超聲功率為0～300 W時，由于超聲處理提高了豆腐凝膠網絡的均勻性以及蛋白-蛋白間結合作用力，從而使豆腐的彈性逐漸增大。黏聚性指豆腐內部黏合力，其數值越大表示豆腐結構越穩(wěn)定，越難被破壞所致[30]。當超聲功率為0～300 W時，由于超聲處理使豆?jié){體系內蛋白質疏水基團暴露，增強了蛋白質疏水性及蛋白網絡間作用力，從而使豆腐的黏聚性增強。當超聲功率大于300 W時，由于“過處理效應”的發(fā)生，空化氣泡最大振幅增加，崩潰時最高溫度及最大壓力逐漸減小，進而使豆?jié){中暴露出的油滴與蛋白重新聚集，疏水作用力降低，從而降低豆腐的硬度、彈性、黏聚性和咀嚼性。

由表3可知，冷凍干燥豆腐經復水處理后，其硬度、彈性、黏聚性和咀嚼性較鮮豆腐相比均顯著增大（P＜0.05）。這可能是由于豆腐中的大豆蛋白發(fā)生了凍結變性反應，即蛋白質分子天然狀態(tài)下的緊湊有序結構N轉變成了變性狀態(tài)下的無序結構D[31]，蛋白質分子間發(fā)生了締合作用進而使其表面水合層的水分分離析出[32]，從而使蛋白質凝膠的韌性提高[33]。而隨著超聲處理過程的進行，復水后冷凍干燥豆腐的硬度逐漸下降，逐漸貼合豆腐的硬度數值，這可能是由于隨著超聲功率的變化，冷凍干燥豆腐的復水率升高，從而使其質地逐漸變軟，硬度降低，彈性升高。

表3 超聲制漿工藝對復水后冷凍干燥豆腐質構特性的影響Table 3 Effect of ultrasonic pulping process on texture properties of freeze-dried tofu after rehydration

2.4 掃描電子顯微鏡觀測分析

在豆腐的冷凍過程中，溫度越低，豆腐中水分的冷卻速率越快，從而會提高結冰時冰晶成核速率并限制冰晶增長。冰晶成核速率決定了冰晶的數量，而熱量和蛋白質從晶核擴散遠離的速率決定了冰晶的尺寸[34]。因此，在迅速冷凍過程中會形成大量的小冰晶，而這些小冰晶在升華后會形成小的孔洞。圖3為不同超聲功率所制備的冷凍干燥豆腐的掃描電子顯微鏡結果，觀察可知，超聲制漿工藝對冷凍干燥豆腐的顯微結構存在顯著影響。

圖3 冷凍干燥豆腐掃描電子顯微鏡圖Fig. 3 Scanning electron microscopic images of freeze-dried tofu

在圖3A中可觀察到一些排列不均一、孔徑較大的孔洞，而隨著超聲的進行，這些孔洞的孔徑逐漸變小或者消失，這可能是由于超聲處理使得豆?jié){體系中的顆粒粒徑逐漸降低，從而使形成的豆腐結構致密均一。Tay等[35]研究發(fā)現大豆蛋白所形成的熱誘導聚合物會影響內酯凝膠的空間結構。由此可推測，超聲處理可能會導致豆?jié){體系內形成可溶性蛋白聚集物，在80 ℃加熱30 min的過程中，這些聚集物轉變成難溶聚合物填充在GDL豆腐的凝膠網絡中，使GDL冷凍干燥豆腐的空間結構更加均一。超聲處理豆?jié){可導致其體系內蛋白質四級結構分離，疏水基團暴露[36]。隨后，這些蛋白質由于靜電引力、與疏水區(qū)域相連的二硫鍵以及表面所帶的負電荷發(fā)生聚集現象[37-40]。加入GDL后會釋放出質子中和聚集體表面的電荷，進而使聚集體間的疏水相互作用占主導地位，最終加速豆腐的凝膠化進程并形成纖維狀結構[36]。由圖3D可看出，當超聲功率為300 W時，冷凍干燥豆腐的網絡均勻性增強，且只能看到少量的小孔，這可能是由于在超聲功率300 W時，蛋白質疏水性和分子間作用力增強，豆腐的結構更加均一致密，所以在液氮冷凍的協同作用下得到了孔徑小、分布均勻的冷凍干燥豆腐。當超聲功率為400～500 W時，由圖3E、F可以明顯看出冷凍干燥豆腐的孔數量變多、孔徑變大，這可能是由于超聲功率過高導致豆?jié){體系內蛋白質、脂肪等重新聚合，降低了蛋白質疏水性和分子間作用力。

3 結 論

本實驗采用超聲制漿-真空冷凍干燥技術制備冷凍干燥豆腐，并探析超聲制漿工藝對冷凍干燥豆腐制備及品質的影響。研究表明當超聲功率為0～300 W時，隨著超聲功率的升高，豆?jié){的平均粒徑和豆腐的析水率逐漸降低，豆腐的硬度、彈性、黏聚性、咀嚼性和冷凍干燥豆腐復水率逐漸升高，而復水后冷凍干燥豆腐的硬度逐漸下降，彈性逐漸升高，冷凍干燥豆腐的內部孔洞逐漸分布均勻，孔徑變小。當超聲功率大于300 W時，豆?jié){體系內部分蛋白質發(fā)生聚集使豆?jié){的平均粒徑和析水率升高，豆腐硬度、彈性、黏聚性、咀嚼性和冷凍干燥豆腐復水率降低，冷凍干燥豆腐的內部孔洞數量變多，孔徑變大。因此，采用超聲功率為300 W的制漿工藝可以得到高復水率的冷凍干燥豆腐，該結果為將超聲制漿-真空冷凍干燥技術運用于冷凍干燥豆腐加工提供了一定的參考依據。