LP-8大孔樹脂制備高含量酯型兒茶素茶多酚

陳 琳，呂楊俊，張海華，朱躍進(jìn)，王岳飛，張士康,*

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310016；2.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

茶多酚占茶葉干物質(zhì)質(zhì)量的18%～36%[1]，是茶葉中重要的組成成分。目前茶多酚已實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，所用原料一般為低檔綠茶，且茶多酚產(chǎn)品已有相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 31740.2—2015《茶制品 第2部分：茶多酚》。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全國每年生產(chǎn)茶多酚的總量為3 000 t左右[2]。目前從茶葉中生產(chǎn)制備茶多酚仍主要依賴于溶劑萃取法，即利用水或乙醇浸提，經(jīng)氯仿或二氯甲烷萃取以脫除咖啡堿，再經(jīng)乙酸乙酯萃取得到茶多酚?，F(xiàn)有方法存在不同程度的食品安全隱患和環(huán)保壓力，隨著消費(fèi)者對茶多酚產(chǎn)品安全性要求越來越高，新的生產(chǎn)工藝也在涌現(xiàn)，例如以不同類型吸附材料為基礎(chǔ)的吸附分離法[3-12]、超臨界萃取法[13-16]等。但超臨界萃取等新技術(shù)要求高、設(shè)備昂貴，距離工廠化生產(chǎn)應(yīng)用尚待時日。另外，目前茶多酚的制備研究主要集中在提高多酚純度，較少關(guān)注其中酯型或非酯型兒茶素的比例。大孔樹脂作為一種吸附材料，具有價格適宜、可再生、熱及化學(xué)穩(wěn)定性較優(yōu)、選擇性較好等優(yōu)點(diǎn)，研究表明適宜的大孔樹脂可以實(shí)現(xiàn)分離制備茶多酚[3-4,17-20]，且使用的溶劑以水和/或乙醇為主；因此大孔樹脂具備工廠化、綠色化生產(chǎn)茶多酚的可行性。本實(shí)驗(yàn)所用的LP-8大孔樹脂為自制材料，基于對茶多酚有特異吸附性的大孔樹脂，通過優(yōu)化樹脂成粒工藝，引入對酚羥基具有較強(qiáng)吸附作用的聚酰胺基吸附基團(tuán)，制得優(yōu)選粒徑樹脂，既提高大孔樹脂對茶多酚的負(fù)載量（提高46.2%），亦不影響常壓下上樣、洗脫流速，實(shí)現(xiàn)酯型兒茶素（表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG））與簡單兒茶素的較好分離[1]。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用LP-8大孔樹脂制備高含量酯型兒茶素茶多酚，探討大孔樹脂制備茶多酚的技術(shù)可行性，以期獲得有別于現(xiàn)市場流通的差異化茶多酚樣品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LP-8大孔樹脂，自制；兒茶素、咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 中國藥品生物制品檢定所；湖北恩施大宗綠茶 杭州遠(yuǎn)圣茶能科技有限公司；無水乙醇、冰醋酸、鹽酸、氫氧化鈉（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純） 天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YF-20型提取罐 北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限公司；YC-015型噴霧干燥機(jī) 上海雅程儀器設(shè)備有限公司；TU1901型紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；1525型高效液相色譜儀 美國Waters公司；φ 4 cm×50 cm玻璃層析柱 華東醫(yī)藥股份有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；ALPHA 1-2 LD plus型冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 綠茶水提取物的制備

準(zhǔn)確稱取0.5 kg碾碎的綠茶，按固液比1∶15（m/V）加去離子水，置于提取罐中混勻。設(shè)定浸提溫度85 ℃，浸提時間30 min，收集濾液。保留濾渣，同一條件進(jìn)行二次浸提，收集濾液。合并濾液，濃縮、干燥，得綠茶水提取物固體粉末。

1.3.2 茶多酚、兒茶素、咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測方法》對茶多酚、兒茶素、咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定，該方法中兒茶素類質(zhì)量分?jǐn)?shù)＝表兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)+表沒食子兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)+沒食子兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)+EGCG質(zhì)量分?jǐn)?shù)+ECG質(zhì)量分?jǐn)?shù)，因此本實(shí)驗(yàn)所述酯型兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)是指：EGCG質(zhì)量分?jǐn)?shù)+ECG質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 LP-8大孔樹脂對茶多酚的吸附及洗脫能力測定

準(zhǔn)確稱取濕質(zhì)量2.0 g的LP-8大孔樹脂，裝入100 mL錐形瓶中，加入6 mg/mL綠茶水提取物溶液200 mL，室溫下振蕩12 h進(jìn)行充分吸附后測定溶液中茶多酚、酯型兒茶素（EGCG、ECG）及咖啡堿含量，并計(jì)算LP-8大孔樹脂對茶多酚的吸附量（式（1））。同時，在吸附結(jié)束時，取出大孔樹脂，用濾紙吸干表面水后置于錐形瓶中，加入100 mL的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液，室溫下恒溫振蕩12 h進(jìn)行洗脫，洗脫結(jié)束后測定溶液中的茶多酚、酯型兒茶素（EGCG、ECG）及咖啡堿含量，并計(jì)算LP-8大孔樹脂的洗脫率（式（2））。

1.3.4 LP-8大孔樹脂靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 靜態(tài)吸附動力學(xué)實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取濕質(zhì)量2 g的LP-8大孔樹脂，裝入500 mL錐形瓶中，加入240 mL的10 mg/mL綠茶水提取物溶液，室溫下恒溫振蕩。在吸附2、6、10、20、30、40、50、60、90、120 min時測定大孔樹脂對茶多酚的吸附量，并繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。

1.3.4.2 LP-8大孔樹脂靜態(tài)吸附等溫線

準(zhǔn)確稱取濕質(zhì)量2 g的LP-8大孔樹脂6 份，裝入錐形瓶中。分別添加質(zhì)量濃度為4、5、6、7、8、9 mg/mL的綠茶水提取物溶液各100 mL。25 ℃下恒溫振蕩。待平衡后，測定溶液中茶多酚含量，并計(jì)算吸附量，繪制25 ℃吸附等溫線，并進(jìn)行Langmuir方程擬合。

1.3.5 LP-8大孔樹脂動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

當(dāng)吸附過程中層析柱流出液內(nèi)的茶多酚質(zhì)量濃度達(dá)到上樣樣品中茶多酚質(zhì)量濃度的10%時視為泄漏點(diǎn)[21-22]，判定為吸附飽和。

1.3.5.1 吸附流速對吸附泄漏點(diǎn)的影響

準(zhǔn)確量取50 mL濕樹脂，進(jìn)行濕法裝柱。綠茶水提取物上樣質(zhì)量濃度為10 mg/mL，控制吸附流速分別為1、2 BV/h以及3 BV/h。收集每一床層體積流出液，并對流出液中的茶多酚含量進(jìn)行測定。以流出液體積為橫坐標(biāo)，流出液中茶多酚質(zhì)量濃度占上樣樣品中茶多酚質(zhì)量濃度的比例為縱坐標(biāo)，作動態(tài)吸附曲線。

1.3.5.2 上樣質(zhì)量濃度對吸附泄漏點(diǎn)對應(yīng)的吸附量的影響

準(zhǔn)確量取50 mL濕樹脂，進(jìn)行濕法裝柱。配制上樣質(zhì)量濃度分別為10、20、30 mg/mL以及40 mg/mL的溶液，控制吸附流速為1 BV/h。收集每一床層體積流出液，并對流出液中的茶多酚含量進(jìn)行測定。計(jì)算達(dá)到泄漏點(diǎn)時，不同上樣質(zhì)量濃度下的吸附量。

1.3.6 LP-8大孔樹脂動態(tài)洗脫實(shí)驗(yàn)

采用濕法裝柱。配制0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%系列體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，各2 BV。以1 BV/h的流速進(jìn)行梯度洗脫。每0.5 BV收集洗脫液，并測定茶多酚、酯型兒茶素、EGCG及咖啡堿的含量，繪制動態(tài)洗脫曲線。以酯型兒茶素含量為指標(biāo)，確定適宜的乙醇洗脫體積分?jǐn)?shù)梯度，以制得高含量酯型兒茶素茶多酚。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)處理采用SAS 9.1軟件，進(jìn)行單因素方差分析（One-way analysis of variance，One-way ANOVA）和Tukey多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料茶中茶多酚、咖啡堿、兒茶素類物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

經(jīng)測定，本實(shí)驗(yàn)中的原料茶——湖北恩施大宗綠茶中茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.7%，咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.1%，兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.6%，EGCG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.3%，ECG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6%。

2.2 LP-8大孔樹脂對茶多酚的吸附及洗脫能力

從圖1可以看出，LP-8大孔樹脂對茶多酚具有極好的吸附效果，吸附量為64.6 mg/g，且對咖啡堿的吸附作用較弱，吸附量為2.3 mg/g。此外，吸附的茶多酚中，酯型兒茶素占了較大的比例，為69%。

圖1 LP-8大孔樹脂對茶多酚、酯型兒茶素、EGCG、ECG及咖啡堿的吸附能力Fig. 1 Adsorption capacity of resin LP-8 for tea polyphenols, esterified catechins, EGCG, ECG and caffeine

圖2 茶多酚、酯型兒茶素、EGCG、ECG及咖啡堿在LP-8大孔樹脂中的洗脫率Fig. 2 Desorption rates of tea polyphenols, esteri fied catechins, EGCG,ECG and caffeine on resin LP-8

從圖2中可以看出，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液對LP-8大孔樹脂所吸附的茶多酚及酯型兒茶素具有較好的洗脫效果（洗脫率分別為93%、85%）；而對咖啡堿的洗脫效果則較弱，洗脫率約42%。

以上結(jié)果與已有的選擇性吸附洗脫茶多酚的大孔樹脂研究結(jié)果[17-20]類似。因此LP-8大孔樹脂具有用于分離制備綠茶高酯型兒茶素茶多酚的可行性。

2.3 LP-8大孔樹脂對茶多酚的靜態(tài)吸附動力學(xué)

圖3 茶多酚在LP-8大孔樹脂中靜態(tài)吸附量隨時間變化曲線Fig. 3 Static absorption curve for tea polyphenols on resin LP-8

從圖3可以看到，在0～120 min內(nèi)茶多酚在LP-8大孔樹脂中的靜態(tài)吸附量隨著時間的延長而提高，但在60 min后變緩，且60 min與90、120 min時的吸附量無顯著差異。因此判斷60 min時，LP-8大孔樹脂對茶多酚吸附接近飽和，近似平衡。

2.4 LP-8大孔樹脂的靜態(tài)等溫吸附

LP-8大孔樹脂對茶多酚的靜態(tài)等溫吸附曲線（圖4）描述的是茶多酚在LP-8大孔樹脂中的平衡質(zhì)量濃度與平衡吸附量的關(guān)系，可以看出平衡吸附量隨著平衡質(zhì)量濃度的增加而提升，隨后在近50 mg/g時逐漸趨緩。

圖4 LP-8大孔樹對茶多酚的脂靜態(tài)吸附等溫線（25 ℃）Fig. 4 Adsorption isotherm of resin LP-8 at 25 ℃ for tea polyphenols

Langmuir方程模型是一種平衡模型，可用以擬合被吸附物在吸附劑上的等溫平衡吸附情況[23]。該模型有一個假設(shè)，即吸附劑表面均一，為單分子層對被吸附物的等溫吸附，各處的吸附能相等。該方程模型表達(dá)式如式（3）所示。

式中：ρe為被吸附物的平衡質(zhì)量濃度/（mg/mL）；qe為吸附劑的平衡吸附量/（mg/g）；qm為吸附劑的飽和吸附量（假定為單分子層）/（mg/g）；K為能量常數(shù)。

用該模型對實(shí)驗(yàn)得到的吸附等溫線進(jìn)行擬合，得到相應(yīng)的回歸方程，如圖5所示。

圖5 LP-8大孔樹脂吸附茶多酚的Langmuir方程模型（25 ℃）Fig. 5 Linear correlation for adsorption of tea polyphenols on LP-8 resin at 25 ℃ based on the Langmuir model

從擬合方程的R2＝0.991 6可以看出，該模型與LP-8大孔樹脂等溫吸附情況能較好擬合。根據(jù)擬合方程推算出LP-8大孔樹脂在25 ℃下的單分子層飽和吸附量qm為70.9 mg/g，該吸附量進(jìn)一步驗(yàn)證了LP-8大孔樹脂對茶多酚具有較好的吸附效果。

2.5 動態(tài)吸附下不同吸附流速的吸附效果

如圖6所示，在不同流速下，流出液中茶多酚質(zhì)量濃度所占比例隨著流出液體積的增加而升高，且不同流速間有所差異。流速越大，相同流出體積下流出液中茶多酚質(zhì)量濃度所占比例越高，即說明有更多的茶多酚未被LP-8大孔樹脂吸附。以出現(xiàn)所占比例超過10%的體積為泄漏點(diǎn)，由圖6可知，綠茶水提取物在LP-8大孔樹脂中以1 BV/h吸附流速在8 BV時出現(xiàn)泄漏點(diǎn)，以2 BV/h吸附流速在6 BV時出現(xiàn)泄漏點(diǎn)，以3 BV/h吸附流速在5 BV時出現(xiàn)泄漏點(diǎn)，即吸附流速越大，泄漏點(diǎn)越提前出現(xiàn)。在動態(tài)吸附中，以不同吸附流速過柱，茶多酚與大孔樹脂的接觸時間存在差異。流速越小，茶多酚與大孔樹脂的接觸時間越長，大孔樹脂對茶多酚的吸附越充分，即吸附量更高，吸附效果更佳[24]。因此，此后將1 BV/h設(shè)定為上樣流速。

2.6 動態(tài)吸附下不同上樣質(zhì)量濃度的吸附效果

圖7 不同上樣質(zhì)量濃度下LP-8大孔樹脂對茶多酚的飽和吸附質(zhì)量Fig. 7 Saturated adsorption capacity of tea polyphenols onto LP-8 resin at different loading concentrations

如圖7所示，不同上樣質(zhì)量濃度下，LP-8大孔樹脂對茶多酚的飽和吸附質(zhì)量存在差異，且30 mg/mL具有更高的吸附量，為5.25 g。所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)以30 mg/mL的綠茶水提取物水溶液作為最佳上樣質(zhì)量濃度。

2.7 制備高含量酯型兒茶素茶多酚

在上述吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇環(huán)境友好且易獲得的乙醇作為洗脫劑，以實(shí)現(xiàn)高含量酯型兒茶素茶多酚的環(huán)境友好型制備。

圖8 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下茶多酚的梯度洗脫曲線Fig. 8 Dynamic desorption curves of tea polyphenols with different ethanol concentrations

從圖8中可以看出，咖啡堿在乙醇體積分?jǐn)?shù)大于20%的梯度洗脫液中均未檢出，表明其在0～20%體積分?jǐn)?shù)乙醇梯度洗脫時已基本被洗脫完全；酯型兒茶素（EGCG+ECG）在0～30%體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液中幾乎未被洗脫，在乙醇體積分?jǐn)?shù)不小于40%時逐漸被洗脫下來，且洗脫體積分?jǐn)?shù)集中在40%～60%。合并40%～60%的洗脫液，測得其中酯型兒茶素在茶多酚中的比例為78.0%、EGCG為61.0%、ECG為17.0%，與原料相比，酯型兒茶素、EGCG、ECG在茶多酚中的比例分別提高了45.1%、42.2%和56.0%，無咖啡堿檢出。將洗脫液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫乙醇后干燥，得到高含量酯型兒茶素茶多酚樣品。

3 討 論

茶多酚作為茶葉中最主要的功能活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多種功能活性[25-29]。其中EGCG、ECG等酯型兒茶素具有比其他茶多酚組分更強(qiáng)的活性[1]，其含量常作為茶多酚品質(zhì)的評判指標(biāo)。鑒于傳統(tǒng)的制備技術(shù)（金屬離子沉淀法、溶劑萃取法等）無法實(shí)現(xiàn)酯型兒茶素等特異成分的定向富集[2]，有研究者通過吸附分離法等技術(shù)對酯型兒茶素進(jìn)行分離制備[30-31]，但規(guī)?；苽浼夹g(shù)尚未普遍，填料篩選、工藝優(yōu)化等相關(guān)研究仍是當(dāng)前熱點(diǎn)。溫堯林等[32]采用ADS-F8大孔樹脂對茶多酚進(jìn)行富集，制得低咖啡堿、高茶多酚的茶粉，其中茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于85%，兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于60%，EGCG質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于35%，咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)不大于1%；李翠芹等[33]公開了一種無咖啡堿茶多酚分離純化的方法，利用LX-8大孔樹脂制備茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于96%、EGCG質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于60%的茶多酚產(chǎn)品；綜上，有關(guān)大孔樹脂分離茶多酚乃至EGCG的研究相對已成熟，尚缺少針對酯型兒茶素特異吸附相關(guān)的研究，尤其是特異性吸附材料的篩選應(yīng)用研究。

本實(shí)驗(yàn)以便于工業(yè)化生產(chǎn)為目標(biāo)，應(yīng)用LP-8大孔樹脂對綠茶提取物進(jìn)行分離，經(jīng)靜態(tài)、動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)研究LP-8樹脂對茶多酚、咖啡堿、EGCG、ECG、酯型兒茶素的吸附、洗脫特性，結(jié)果表明：LP-8樹脂對茶多酚、咖啡堿、酯型兒茶素有選擇性吸附、洗脫特性，通過工藝優(yōu)化可實(shí)現(xiàn)酯型兒茶素含量高、脫咖啡堿茶多酚的制備。在吸附流速1 BV/h、上樣質(zhì)量濃度30 mg/mL的動態(tài)吸附和40%～60%乙醇梯度動態(tài)洗脫條件下，獲得了酯型兒茶素比例為78.0%的茶多酚，實(shí)現(xiàn)了高含量酯型兒茶素茶多酚的制備，該含量優(yōu)于現(xiàn)有一些相關(guān)研究結(jié)果[23-34]，本方法可獲得有別于目前市場流通的差異化茶多酚樣品，為工業(yè)化推廣提供參考。后續(xù)大量工作仍需繼續(xù)開展，如進(jìn)一步優(yōu)化吸附洗脫條件、干燥方式等。