PI3K/Akt通路在丙泊酚減輕大鼠腦缺血性損傷中的作用

涂獻坤，楊 濱，涂德文，梁日生，石松生

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科，福建省神經(jīng)外科研究所，福建 福州 350001)

炎癥反應(yīng)是介導(dǎo)缺血性腦損傷的病理生理機制之一，藥物通過抗炎癥反應(yīng)，已被證實可減輕缺血性腦損傷，炎癥反應(yīng)已是治療缺血性腦中風(fēng)的重要靶點之一[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可通過抑制腦缺血炎癥反應(yīng)，從而保護缺血性腦損傷[2]。PI3K/Akt信號通路是一種促神經(jīng)細胞生存的信號通路，我們前期還發(fā)現(xiàn)，5-脂氧合酶抑制劑齊留通(zileuton)可通過激活PI3K/Akt信號通路，減輕缺血性腦損傷[3]，但是丙泊酚是否通過激活PI3K/Akt信號通路減輕缺血性腦損傷，目前研究較少，本研究將通過動物實驗闡明，并進一步探討其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 Akt抑制劑LY294002、氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染料，購自Sigma公司；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒，購自南京建成生物公司；p-Akt、Akt抗體，購于Santa Cruz公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白介素1β(interleukin 1β, IL-1β)ELISA檢測試劑盒，購自武漢博士德公司。

1.1.2實驗動物 ♂清潔級SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購自上海斯萊克實驗動物公司，許可證號：SCXK(滬)2003-0003。

1.1.3儀器 立體定向注射儀(深圳瑞奧德公司)；低溫離心機、酶標儀(美國Thermo公司)；紫外分光光度計(美國Amsham公司)；恒壓電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 動物分組、動物模型制備及腦室內(nèi)注射隨機將大鼠分為4組，即對照組、溶媒組、丙泊酚治療組和LY294002干預(yù)組。腦缺血后，丙泊酚50 mg·kg-1腹腔注射給藥，給藥劑量參考課題組前期發(fā)表論文[2]。大鼠腦缺血模型的建立參考既往文獻[3-4]，線栓(直徑0.32 mm)購自深圳瑞沃德公司，10%水合氯醛(1 mL)腹腔注射麻醉，鈍性分離右側(cè)頸總動脈、右側(cè)頸外動脈、右側(cè)頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈。在頸外動脈近分叉處剪一“V’形切口，插入線栓，將栓線送至大腦中動脈起始處，進線約(18.0±2.0)mm，栓塞2 h后退出線栓，血流再灌注。動物手術(shù)全過程使用加熱墊，保持肛溫37 ℃。

用DMSO溶解LY294002，PBS稀釋成10 μmol·L-1。建模前30 min，取10 μL，運用立體定向注射儀行腦室內(nèi)注射。定向儀參數(shù)：以前囟前方0.8 mm，中線外側(cè)1.5 mm為穿刺點，穿刺深度3.5 mm，給藥劑量及方法參考課題組前期工作[5]。

1.3 評估大鼠神經(jīng)功能障礙神經(jīng)功能障礙評分方法參考既往文獻[2]。無神經(jīng)功能障礙者為0分；提起大鼠尾巴，對側(cè)前肢屈曲者為1分；行走時在地上打轉(zhuǎn)，靜止時身體無偏向?qū)?cè)者為2分；行走時地上打轉(zhuǎn)，靜止時身體也偏向?qū)?cè)者為3分；嚴重意識障礙無法運動者為4分。

1.4 計算腦梗死體積腦缺血相應(yīng)時間，取大腦，冷凍10 min后，沿冠狀位將大腦切成每片厚度約2 mm的6片，于2% TTC溶液中避光孵育20 min，每面各10 min。無梗死組織呈鮮紅色，梗死腦組織呈白色。利用軟件測量各腦片梗死面積，并按公式計算腦梗死體積，V=t×(A1+A2+…An)，V梗死體積，t腦片厚度，A梗死面積。以腦梗死比進行統(tǒng)計(梗死體積/對側(cè)腦體積)，計算方法參考既往文獻[2]。

1.5 評估腦水腫程度通過計算腦含水量可以評估腦水腫程度。取大腦，用濾紙吸除腦表面的水珠，并用吹風(fēng)機冷風(fēng)吹干，稱重獲得濕重(wet weight，WW)，放烤箱烤干后，再稱重獲得干重(dry weight，DW)，依據(jù)如下公式計算腦含水量：腦含水量=(WW-DW)/WW×100%，腦含水量和腦水腫程度呈正比，計算方法參考既往文獻[6]。

1.6 檢測中性粒細胞在腦缺血中的浸潤程度通過檢測腦組織MPO可反映中性粒細胞在腦組織的浸潤程度。腦缺血24 h，取大鼠腦組織，按試劑盒說明書步驟操作，計算MPO含量，參考既往文獻[6]。

1.7 ELISA法檢測血漿TNF-α和IL-1β的含量股靜脈取血，4 ℃離心15 min獲得上清，將標準蛋白樣品和待測樣品加入包被好一抗的96孔板，按試劑盒說明書步驟操作，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算各待測樣品的TNF-α和IL-1β含量，參考既往文獻[6]。

1.8 Western blot法檢測大腦p-Akt和Akt的表達用試劑盒提取缺血腦組織的總蛋白，并測定蛋白濃度。經(jīng)分離膠和濃縮膠電泳、轉(zhuǎn)膜后，NC膜用一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，經(jīng)顯影、定影獲得蛋白條帶，用Quantity One軟件分析蛋白條帶，參考既往文獻[6]。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚減輕神經(jīng)功能障礙和腦梗死體積的作用被LY294002抑制腦缺血24 h，大鼠神經(jīng)功能障礙評分增高(P<0.01)，丙泊酚可減輕大鼠腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)功能損傷(P<0.01)，丙泊酚的這種作用被腦室內(nèi)注射LY294002所抑制(P<0.01)，見Tab 1。腦缺血24 h，大鼠腦梗死比增大(P<0.01)，丙泊酚可減輕大鼠腦缺血的腦梗死比(P<0.05)，丙泊酚的這種作用被腦室內(nèi)注射LY294002抑制(P<0.05)，見Tab 1、Fig 1。

Tab 1 Propofol reduced neurological deficit scores and cerebral infarct size in rats of cerebral ischemia, which were inhibited by LY294002 n=6)

**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsMCAO;△P<0.05,△△P<0.01vspropofol

Fig 1 Representative TTC staining images from sham, MCAO, propofol-treated and LY294002-treated groups

2.2 丙泊酚減輕缺血性腦水腫的作用被LY294002抑制腦缺血24 h大鼠腦組織含水量明顯升高(P<0.01)，丙泊酚明顯降低大鼠腦含水量(P<0.01)，丙泊酚的這種作用被腦室內(nèi)注射LY294002抑制(P<0.05)，見Tab 2。

2.3 丙泊酚抑制MPO活性的作用被LY294002抑制腦缺血24 h，缺血側(cè)腦組織MPO活性明顯增高(P<0.01)，表明缺血腦組織炎性細胞浸潤增加，丙泊酚可降低缺血腦組織MPO的活性(P<0.01)，即抑制炎癥反應(yīng)，丙泊酚的抗炎癥作用被腦室內(nèi)注射LY294002抑制(P<0.05)，見Tab 2。

Tab 2 Propofol reduced cerebral water content and MPO activity in rats of cerebral ischemia, which were inhibited by LY294002 n=6)

**P<0.01vssham;##P<0.01vsMCAO;△P<0.05vspropofol

2.4 丙泊酚降低TNF-α和IL-1β水平的作用被LY294002抑制如Fig 2所示，腦缺血24 h，血漿TNF-α和IL-1β的表達明顯增高(P<0.01)，丙泊酚可明顯降低TNF-α和IL-1β的水平(P<0.01)，丙泊酚抑制TNF-α和IL-1β的作用被腦室內(nèi)注射LY294002抑制(P<0.05)。

Fig 2 Propofol decreased expression of TNF-α and IL-1β after cerebral ischemia in rats, which were inhibited by LY294002 n=6)

**P<0.01vssham;##P<0.01vsMCAO;△P<0.05,△△P<0.01vspropofol

2.5 丙泊酚激活PI3K/Akt信號通路的作用被LY294002抑制如Fig 3所示，腦缺血24 h，缺血側(cè)腦組織p-Akt的蛋白表達明顯降低(P<0.01)，丙泊酚上調(diào)腦缺血p-Akt的蛋白表達水平(P<0.01)，丙泊酚調(diào)節(jié)Akt磷酸化表達的作用被LY294002抑制(P<0.01)，而總Akt的蛋白表達水平各組之間差異無顯著性。

Fig 3 Propofol increased expression of p-Akt after cerebral ischemia in rats, which was inhibited by LY294002 n=6)

*P<0.05,**P<0.01vssham;##P<0.01vsMCAO;△△P<0.01vspropofol

3 討論

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可以減輕大鼠腦缺血損傷，進一步的研究表明，丙泊酚可抑制大鼠缺血腦組織的中性粒細胞浸潤，這表明丙泊酚可抑制腦缺血炎癥反應(yīng)，丙泊酚的神經(jīng)保護作用與其抗炎癥反應(yīng)作用有關(guān)。此外，丙泊酚抑制NF-κB和TNF-α的表達，這可能是其抑制腦缺血炎癥反應(yīng)和神經(jīng)保護作用的機制[2]，但其深入的分子機制仍未被全部闡明。

本研究借助腦立體定向儀，將Akt抑制劑LY294002注入已建立腦缺血模型的大鼠側(cè)腦室內(nèi)，并通過Western blot實驗證實，LY294002可以成功干預(yù)Akt通路活性[7]。實驗結(jié)果顯示，丙泊酚可減輕大鼠腦缺血后的神經(jīng)功能障礙、腦梗死體積和腦水腫，這些結(jié)果表明丙泊酚對缺血性腦損傷具有腦保護作用。而腦室內(nèi)注射LY294002可抑制丙泊酚對缺血性腦損傷的神經(jīng)保護作用，證實PI3K/Akt信號通路在丙泊酚對腦缺血的神經(jīng)保護作用中起重要的調(diào)節(jié)作用。

檢測大鼠腦MPO可判定腦組織中性粒細胞的浸潤程度，也反映了腦組織的局部炎癥反應(yīng)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可抑制大鼠缺血腦組織炎性細胞的浸潤，而這一作用被腦室內(nèi)注射LY294002所抑制，說明丙泊酚通過激活PI3K/Akt信號通路減輕腦缺血誘導(dǎo)的局部炎癥反應(yīng)，PI3K/Akt信號通路在丙泊酚減輕腦缺血炎癥反應(yīng)過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

我們進一步用Western blot方法檢測了信號通路關(guān)鍵蛋白p-Akt和Akt的表達，結(jié)果顯示，大鼠腦缺血24 h缺血腦組織p-Akt的表達下降，丙泊酚上調(diào)p-Akt的表達，丙泊酚對p-Akt的上調(diào)作用被腦室內(nèi)注射LY294002抑制；但是各實驗組之間總Akt的蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以上實驗數(shù)據(jù)表明，腦室內(nèi)注射LY294002可抑制大鼠缺血性腦損傷PI3K/Akt信號通路的活化，PI3K/Akt信號通路在丙泊酚對腦缺血的抗炎癥作用和神經(jīng)保護作用過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

TNF-α和IL-1β是促炎癥細胞因子，可通過促進炎癥反應(yīng)，加重缺血性腦損傷的病理生理過程[9-10]。在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血腦損傷中，丙泊酚被證實可抑制TNF-α和IL-1β的表達，從而抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血性腦損傷，起神經(jīng)保護作用[11]。在本實驗中，大鼠腦缺血24 h血漿中TNF-α和IL-1β的水平升高，丙泊酚抑制TNF-α和IL-1β的表達，丙泊酚的這種作用被腦室內(nèi)注射LY294002所抑制，表明丙泊酚通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗炎癥作用。綜上所述，PI3K/Akt信號通路在丙泊酚減輕缺血性腦損傷和腦缺血炎癥反應(yīng)過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。