小麥乙烯合成通路關(guān)鍵基因TaACS2在抗赤霉病中的功能分析

柯裴蓓，劉 玉，張 婷，孫宇欣，何立強(qiáng)，肖 進(jìn)，王秀娥*

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095；2 江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，南通 226541)

小麥赤霉病(Fusariumhead blight，F(xiàn)HB)亦稱麥穗枯、穗枯病、爛麥頭、紅麥頭，是小麥的重要病害之一，主要發(fā)生在溫暖潮濕和半潮濕地區(qū)[1]，是一種由亞洲鐮刀菌(Fusariumasiaticum)和禾谷鐮刀菌(F.graminearium)引起的世界性流行真菌病害。其中，禾谷鐮刀菌為半活體寄生型病原菌，在侵染植物的早期為活體營(yíng)養(yǎng)階段，需要寄生于活體組織，后期為腐生營(yíng)養(yǎng)階段，不需活體組織[2]，從活體寄生到腐生的轉(zhuǎn)換約在侵染后48h[3]。小麥赤霉病可以引起穗腐、莖腐、苗腐和稈腐，其中穗腐帶來(lái)的損失最大。感病麥粒的粗蛋白含量低，面粉濕面筋含量少，種用和工業(yè)價(jià)值降低；感病的麥粒中還含有多種真菌毒素，如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)毒素，可以引起人和動(dòng)物中毒[4]。近年來(lái)，小麥赤霉病呈加重發(fā)生趨勢(shì)[5]。

乙烯是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的植物激素，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用[6-7]。植物體對(duì)于乙烯信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)一般通過(guò)調(diào)節(jié)乙烯的合成來(lái)進(jìn)行，乙烯合成途徑已在擬南芥中研究得較為清楚[8-9]。乙烯合成途徑中1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(l-aminocyclopropane-1-carboxlic acid，ACC)合成酶(ACC synthase，ACS)催化S-腺苷蛋氨酸向ACC轉(zhuǎn)化，合成最重要的代謝中間體ACC，是關(guān)鍵的限速步驟。因此，ACS被認(rèn)為是ACC和乙烯生物合成的限速酶。有研究表明，單個(gè)ACS基因的突變，可能會(huì)對(duì)整個(gè)ACS基因家族的表達(dá)水平產(chǎn)生影響[10]。

目前的研究表明，植物受病原菌侵染后，植物體內(nèi)的乙烯釋放量明顯增加，由此判斷乙烯在植物抗病反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[11]。Arnaud等[12]研究指出，乙烯是植物防御反應(yīng)的報(bào)警信號(hào)，促使寄主植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，同時(shí)，乙烯本身也參與到防御反應(yīng)中。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)，抗病品種‘蘇麥3號(hào)’接種赤霉菌后，乙烯信號(hào)途徑關(guān)鍵基因1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC oxidase，ACO)基因上調(diào)表達(dá)；外施乙烯利可提高感病小麥品種‘Y1193-6’的赤霉病抗性，認(rèn)為乙烯信號(hào)通路能提高小麥對(duì)赤霉病的抗性。Gottwald等[14]利用基因芯片技術(shù)分析抗病品種‘Dream’和感病品種‘Lynx’接種赤霉菌32h和72h后的表達(dá)譜差異，發(fā)現(xiàn)增加乙烯信號(hào)產(chǎn)物可以提高赤霉病抗性。Gillespie等[15]利用表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，在禾谷鐮刀菌接種6h后，乙烯信號(hào)的增強(qiáng)與赤霉病抗性提高呈正相關(guān)。

病毒誘導(dǎo)基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)是通過(guò)攜帶目的基因片段的病毒侵染植物，誘導(dǎo)植物內(nèi)源基因沉默，從而引起植物表型變化[16]。與傳統(tǒng)的植物基因功能研究方法相比，VIGS技術(shù)周期短、不需要遺傳轉(zhuǎn)化，且具有快速、高效、高通量等優(yōu)點(diǎn)[17-20]。目前，VIGS技術(shù)已經(jīng)作為反向遺傳學(xué)新技術(shù)應(yīng)用于多種植物，如煙草、擬南芥大麥、小麥、水稻等的抗病抗逆、生長(zhǎng)發(fā)育以及代謝調(diào)控等相關(guān)基因的功能研究中[21-26]。

本試驗(yàn)以抗赤霉病小麥品種‘望水白’和‘蘇麥3號(hào)’以及來(lái)源于墨西哥的感赤霉病品種‘Alondra’s’為研究材料，克隆乙烯合成通路的關(guān)鍵基因TaACS2，對(duì)其進(jìn)行序列分析和結(jié)構(gòu)分析，并利用VIGS技術(shù)探究該基因與小麥抗赤霉病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥地方品種‘望水白’：來(lái)自江蘇溧陽(yáng)，高抗赤霉?。恍←溒贩N‘蘇麥3號(hào)’：由阿夫(原產(chǎn)于阿爾巴尼亞)和臺(tái)灣小麥雜交育成，高抗赤霉病，是公認(rèn)的抗性最好的赤霉病抗源材料；‘Alondra’s’：來(lái)源于墨西哥，高感赤霉??；赤霉菌菌株Fg0609，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所張旭研究員提供。

1.2 序列分析

1.3 小麥乙烯合成關(guān)鍵基因TaACS2的克隆

在URGI公布的小麥品種‘中國(guó)春’的基因信息中進(jìn)行比對(duì)，得到TaACS2 基因在小麥中的序列全長(zhǎng)(GenBank：AAB18416.1)。根據(jù)搜索到的序列信息設(shè)計(jì)克隆引物(表1)，在抗赤霉病材料‘望水白’中克隆獲得TaACS2 基因全長(zhǎng)(GenBank：MK432607)。

表1 引物信息

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR

反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScriptII QRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)R223-01購(gòu)于南京諾唯贊公司。cDNA稀釋10—20倍后作為qRT-PCR的模板使用。用南京諾唯贊公司的AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix試劑進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，以微管蛋白基因Tubulin作為內(nèi)參基因分析基因的表達(dá)情況。試驗(yàn)在RochePCR480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。一次平行試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 大麥條斑花葉病毒誘導(dǎo)的基因沉默

參照Wang等[27]方法進(jìn)行大麥條斑花葉病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)試驗(yàn)。BSMV是大麥病毒家族的一個(gè)成員，它是包含有α、β、γ 3個(gè)部分基因組的RNA病毒。目前BSMV載體最常用的主要是利用修飾過(guò)的γ作為重組的載體[28]。VIGS試驗(yàn)中，以接種BSMV(α、β、γ病毒載體)的植株作為對(duì)照，若侵染成功，接種BSMV：PDS(α、β、γ-PDS病毒載體)的植株會(huì)出現(xiàn)葉片漂白失綠現(xiàn)象。

根據(jù)已經(jīng)克隆到的候選基因序列，選擇相對(duì)保守的區(qū)段設(shè)計(jì)引物構(gòu)建載體(表1)?？寺aACS2基因的特異序列，用T4 DNA連接酶與γ載體片段連接，最終獲得正確的質(zhì)粒載體γ-TaACS2，對(duì)載體進(jìn)行線性化處理，利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)線性化產(chǎn)物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

將α、β病毒載體的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別和γ、γ-PDS、γ-TaACS2的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物混合，從小麥基部第一個(gè)小穗開始進(jìn)行涂抹至旗葉頂端。接種大麥條斑花葉病毒后8—10d，對(duì)接種BSMV(α、β、γ病毒載體，對(duì)照)、BSMV：PDS(α、β、γ-PDS病毒載體)、BSMV：TaACS2(α、β、γ-TaACS2病毒載體)的植株形態(tài)進(jìn)行觀察，并對(duì)赤霉菌接種點(diǎn)取樣，提取RNA，進(jìn)行目的基因表達(dá)分析，檢測(cè)基因沉默效率。

1.6 赤霉菌的接種及抗赤霉病鑒定

在接種大麥條斑花葉病毒后在小麥植株揚(yáng)花期時(shí)，采用單花滴注接種法給麥穗接種赤霉菌，每穗接種1朵小花，噴霧保濕并套袋處理，3d后去套袋，生長(zhǎng)條件不變。接種赤霉菌15d后，統(tǒng)計(jì)平均病小穗率和病穗軸率，對(duì)植株赤霉病抗性進(jìn)行鑒定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaACS2基因序列特征分析

根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)克隆引物，分別在抗赤霉病小麥品種‘望水白’和感病品種‘Alondra’s’中擴(kuò)增得到TaACS2基因的gDNA，全長(zhǎng)2 177bp。序列分析發(fā)現(xiàn)，‘望水白’與‘Alondra’s’僅在476bp處有一個(gè)SNP位點(diǎn)差異(圖1)。該SNP位點(diǎn)未引起氨基酸變化，是一個(gè)同義突變，因此未引起預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)理化性質(zhì)也未改變(圖2)。

圖1 TaACS2基因序列分析Fig.1 Sequence analysis of TaACS2 gene

圖2 TaACS2蛋白三維結(jié)構(gòu)Fig.2 Three-dimensional structure of TaACS2 protein

2.2 TaACS2基因受赤霉菌誘導(dǎo)后的表達(dá)特征分析

利用設(shè)計(jì)的目的基因特異引物(表1)對(duì)赤霉菌侵染后的‘蘇麥3號(hào)’和‘Alondra’s’TaACS2基因表達(dá)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)定量qRT-PCR分析,結(jié)果顯示：TaACS2基因在抗病品種‘蘇麥3號(hào)’中上調(diào)表達(dá)，但在感病品種‘Alondra’s’中不受誘導(dǎo)，甚至下調(diào)表達(dá)(圖3)。

2.3 TaACS2 基因沉默效率分析

在‘蘇麥3號(hào)’穗部分別接種BSMV(對(duì)照，包含α、β、γ載體)和BSMV：PDS(包含α、β、γ-PDS)病毒，7d后觀察，發(fā)現(xiàn)接種BSMV：PDS與對(duì)照相比出現(xiàn)明顯退綠癥狀(圖4)，證明PDS基因被成功沉默，本試驗(yàn)的VIGS系統(tǒng)是可行的。

*表示差異顯著(P<0.05)圖3 小麥TaACS2基因受赤霉菌侵染的表達(dá)變化情況Fig.3 Changes of TaACS2 gene expression in wheat infected by Fusarium graminearium

圖4 BSMV(A)和BSMV：PDS(B)侵染‘蘇麥3號(hào)’ 穗部7d后的表型Fig.4 The spike symptom of ‘Sumai 3’ at 7 days after inoculation of BSMV(A)and BSMV：PDS(B)

分別對(duì)‘蘇麥3號(hào)’(圖5A—D)和‘望水白’(圖5E—H)穗部進(jìn)行TaACS2基因沉默試驗(yàn)，研究其功能。利用BSMV和BSMV：TaACS2接種植株穗部，7 d后在接種點(diǎn)取樣并提取RNA，利用qRT-PCR分析VIGS對(duì)目的基因的沉默效率。結(jié)果表明:與對(duì)照相比，涂抹BSMV：TaACS2后，‘蘇麥3號(hào)’的TaACS2基因表達(dá)量下降至原來(lái)的5%(圖5D)，‘望水白’的TaACS2基因表達(dá)量下降至原來(lái)的21%(圖5H)，表明兩個(gè)抗病材料中的TaACS2基因均被成功沉默。

A和E：接種BSMV；B和F：接種BSMV：TaACS2；C和G：接種BSMV和BSMV：TaACS2后再接種赤霉菌，15d后統(tǒng)計(jì)平均病小穗率和病穗軸率；D和H：接種BSMV和BSMV：TaACS2，7d后檢測(cè)TaACS2基因的表達(dá)情況圖5 利用VIGS在‘蘇麥3號(hào)’(A—D)和‘望水白’(E—H)穗部沉默TaACS2基因Fig.5 Silencing TaACS2 gene in panicles of ‘Sumai 3’(A—D)and ‘Wangshuibai’(E—H)by VIGS

2.4 沉默TaACS2基因后的小麥赤霉病抗性鑒定

為了研究TaACS2基因沉默后小麥的赤霉病抗性是否發(fā)生變化，于小麥揚(yáng)花期分別在BSMV和BSMV：TaACS2侵染后的穗部接種赤霉菌，并于接種后15d調(diào)查植株平均病小穗率和平均病穗軸率。結(jié)果顯示：與對(duì)照(圖5A)相比，TaACS2基因沉默的‘蘇麥3號(hào)’(圖5B)平均病小穗率從7.2%上升到13.3%，病穗軸率從4.6%上升到19.0%(圖5C)，感赤霉病性顯著提高。TaACS2基因沉默的‘望水白’(圖5F)平均病小穗率從10.8%上升到28.4%，病穗軸率從0上升到53.6%(圖5G)，感赤霉病性顯著提高。初步證明TaACS2基因正向調(diào)控小麥對(duì)赤霉病的抗性。

3 討論

目前，小麥抗赤霉病研究工作取得了重大進(jìn)展，2016年Rawat等[29]克隆了小麥抗赤霉病主效位點(diǎn)Fhb1上的關(guān)鍵基因——成孔毒素(PFT)基因。Fhb1位于3BS染色體上，是目前公認(rèn)的、效應(yīng)最大的、抗性表現(xiàn)穩(wěn)定的赤霉病抗性QTL[30]，F(xiàn)hb1能解釋20%—60%的表型變異[31]，是小麥赤霉病中最佳的抗擴(kuò)展基因的資源[32]。但前人研究發(fā)現(xiàn)，一些具有PFT基因的材料并不抗赤霉病，而沒(méi)有PFT基因的材料也能抗赤霉病[33-34]。目前已知的抗赤霉病QTL很多，幾乎遍布小麥全部染色體[5]，所以Fhb1并不能完全解釋小麥赤霉病抗性問(wèn)題，對(duì)小麥赤霉病還需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

植物激素在調(diào)節(jié)植物發(fā)育進(jìn)程和通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)參與植物對(duì)眾多生物和非生物脅迫的響應(yīng)中起著重要作用，其中水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)在生物脅迫響應(yīng)中起著重要作用[35]。植物激素乙烯，不僅在調(diào)節(jié)植株的生長(zhǎng)和發(fā)育中起作用，而且是環(huán)境脅迫和生物脅迫反應(yīng)的重要調(diào)控因子。目前，關(guān)于乙烯通路在小麥抗赤霉病反應(yīng)中所起的作用仍存在分歧，機(jī)制并未完全清楚。如Arnaud等[12-15]認(rèn)為乙烯信號(hào)在小麥抗赤霉病中發(fā)揮作用，Ding等[36]認(rèn)為乙烯和茉莉酸兩個(gè)信號(hào)通路協(xié)同參與赤霉病抗性，而Chen等[37]認(rèn)為乙烯信號(hào)通路與感赤霉病性相關(guān)。本研究利用大麥條斑花葉病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)將抗赤霉病材料‘蘇麥3號(hào)’和‘望水白’中的TaACS2基因沉默后，抗病材料‘蘇麥3號(hào)’和‘望水白’的病小穗率和病穗軸率均上升，抗赤霉病性降低，表明TaACS2基因參與抗赤霉病反應(yīng)，同時(shí)也間接證明乙烯信號(hào)通路正向調(diào)節(jié)小麥對(duì)赤霉病的抗性。Gillespie[38]研究發(fā)現(xiàn)，利用病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)沉默乙烯響應(yīng)元件轉(zhuǎn)錄因子ERF后，降低了抗病品種‘寧7840’的赤霉病抗性，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，表明乙烯合成或信號(hào)傳導(dǎo)途徑的破壞或受阻均可影響乙烯通路發(fā)揮赤霉病抗性。因此，本試驗(yàn)鑒定的TaACS2基因?yàn)檠芯恳蚁┬盘?hào)通路參與抗赤霉病反應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)打開了一個(gè)突破口，并有助于解析小麥抗赤霉病分子機(jī)理。