青蒿虎酯對大鼠睪丸扭轉復位后缺血再灌注損傷的影響

王磊 翁小東 陳志遠 劉修恒

[摘要] 目的 探討青蒿虎酯對大鼠睪丸扭轉復位后缺血再灌注損傷的影響。 方法 采用隨機數(shù)字表法將18只成年健康雄性SD大鼠分為對照組、缺血組和青蒿虎酯組，每組6只，建立睪丸扭轉復位動物模型（720°維持2 h）。青蒿虎酯組于術前3 d灌胃青蒿琥酯25 mg/（kg·d），對照組和缺血組灌胃同體積蒸餾水。復位后4 h處死大鼠并獲取睪丸組織，分別檢測組織丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）含量，采用HE染色和TUNEL染色檢測組織病理學參數(shù)和生精細胞凋亡指數(shù)（AI）。Western blot檢測各組睪丸組織多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）-1和凋亡誘導因子（AIF）的表達。 結果 與對照組比較，缺血組和青蒿虎酯組SOD活性和曲細精管直徑明顯降低，而MDA含量、凋亡指數(shù)、PARP-1和AIF表達則顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;與缺血組比較，青蒿虎酯組SOD活性和曲細精管直徑顯著升高，MDA含量、凋亡指數(shù)、PARP-1和AIF表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結論 青蒿虎酯對睪丸扭轉復位后的缺血再灌注損傷具有保護作用，其機制可能是通過抑制細胞凋亡和氧化應激表達而實現(xiàn)。

[關鍵詞] 青蒿虎酯;睪丸;扭轉;缺血

[中圖分類號] R697.22? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（b）-0018-04

睪丸扭轉是泌尿外科的常見急癥之一，多發(fā)生于青少年[1]。發(fā)生扭轉的睪丸必須在6 h內復位恢復血供，否則發(fā)生扭轉的睪丸生精細胞會發(fā)生不可逆性的細胞損傷[2-3]。手術復位及時的患者，術后仍有可能出現(xiàn)扭轉側睪丸的生精功能下降，有的患者還會出現(xiàn)扭轉側睪丸萎縮、精子活力下降、數(shù)量減少等[4]，其機制與扭轉側睪丸復位后的缺血再灌注損傷密切相關[5]。青蒿琥酯是具有β-倍半帖內酯類青蒿素的衍生物，具有抗瘧、抗病毒、抗腫瘤、調節(jié)免疫功能等多種藥理作用[6-8]。近年來研究表明青蒿琥酯還具有減輕腎臟缺血再灌注損傷的作用，但對于睪丸缺血再灌注損傷是否有保護作用，目前報道較少。本研究旨在觀察青蒿琥酯對睪丸缺血再灌注后的睪丸細胞損傷是否具有保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠18只（250～300 g），8～10周齡，SPF級，購自于武漢大學醫(yī)學院實驗動物中心（合格證號：42009800001176），造模前適應性喂養(yǎng)1周，室溫19～23℃室內飼養(yǎng)，相對濕度60%，每日12 h光照，自由飲水、進食。動物實驗方案經(jīng)過武漢大學人民醫(yī)院動物實驗倫理委員會的批準。

1.2 試劑

青蒿琥酯：廣西桂林南藥股份有限公司（純度 >99%，批號：ZA080203）;多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）-1（sc-53643）、凋亡誘導因子（AIF）（sc-55519）抗體購于santacruz公司;BCA蛋白濃度試劑盒（P0012）購于碧云天生物技術研究所;超氧化物歧化酶（SOD）（A001-3）、丙二醛（MDA）（A003-1）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3 模型的建立與分組

采用隨機數(shù)字表法將實驗大鼠分為對照組、缺血組和青蒿虎酯組，每組6只。各組大鼠麻醉成功后取下腹切口，游離左側睪丸并切斷睪丸引帶，分離至附睪頭。對照組：將睪丸順時針扭轉720°后立即復位固定，關閉切口。缺血組和青蒿琥酯組：順時針扭轉720°并維持2 h，其間夾閉切口，后將睪丸復位固定，睪丸由暗紅色變鮮紅色代表造模成功。術前3 d灌胃青蒿琥酯25 mg/（kg·d），單次給藥。對照組和缺血組灌胃同體積蒸餾水。

1.4 樣本采集和處理

1.4.1 標本采集? 各組大鼠復位4 h后處死，獲取的睪丸組織一部分置于液氮中保存，另一部分用固定液固定，常規(guī)石蠟包埋后檢測組織病理學改變和生精細胞凋亡指數(shù)。

1.4.2 SOD活力和MDA含量檢測? 獲取各組大鼠睪丸組織后，取50 mg組織，加入0.9 mL生理鹽水制成10%的組織勻漿。采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，鄰苯三酚法測定SOD活性，具體操作步驟按照南京建成生物工程研究所的操作步驟進行檢測[9]。

1.4.3 組織病理學檢查? 造模成功后，取各組大鼠的睪丸組織，用多聚甲醛固定后，依次脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟，行HE染色后，在200×光鏡下觀察其病理改變。通過檢測曲細精管直徑和生精細胞層數(shù)評價睪丸生精功能。曲細精管直徑通過顯微測微器檢測;生精細胞層數(shù)通過90°、180°、270°和360° 4個方向計數(shù)生精細胞層數(shù)后得出平均值。

1.4.4 TUNEL法檢測細胞凋亡? TUNEL染色后光鏡下觀察，胞核呈棕黃色者為凋亡陽性細胞，隨機選取5個視野，在200×光鏡下計數(shù)凋亡陽性細胞，凋亡指數(shù)為凋亡陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比。

1.4.5 Western blot檢測PARP-1、AIF的表達? 從-80℃冰箱中取出保存后的睪丸組織，BCA試劑盒計算各組蛋白濃度，取40 μg蛋白上樣，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳、轉膜、封閉后，后加入1∶1000稀釋的PARP-1、AIF抗體，4℃下孵育過夜。之后與相應二抗（1∶2000稀釋）結合，洗膜后ECL法顯色、照相。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠睪丸SOD活性、MDA含量比較

缺血組和青蒿虎酯組睪丸SOD活性顯著低于對照組，而MDA含量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;青蒿虎酯組SOD活性明顯高于缺血組，MDA含量則明顯低于缺血組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

2.2 各組大鼠睪丸血清曲細精管直徑、生精細胞層數(shù)和凋亡指數(shù)比較

與對照組比較，缺血組和青蒿虎酯組睪丸曲細精管直徑變小，生精細胞細胞排列紊亂，細胞層數(shù)及數(shù)量減少，生精阻滯，凋亡指數(shù)升高（P < 0.05）。與缺血組比較，青蒿虎酯組睪丸曲細精管直徑變大，生精細胞細胞層數(shù)增多，凋亡指數(shù)下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），青蒿虎酯可改善睪丸缺血再灌注所致的曲細精管和生精上皮細胞的病理學損害

2.3 各組大鼠PARP-1、AIF表達比較

缺血組、青蒿虎酯組PARP-1、AIF表達明顯高于對照組，青蒿虎酯組PARP-1、AIF表達顯著低于缺血組，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

3 討論

睪丸扭轉造成的損傷是不可逆的、最終會導致不育[10]。睪丸扭轉后的復位過程是典型的缺血再灌注損傷過程，期間發(fā)生生精細胞能量代謝障礙、氧自由基損傷、炎癥遞質和基因轉錄異常[11]。正常機體的活細胞中均可產生氧自由基，而氧自由基的過量釋放會對機體產生危害。正常情況下機體存在的抗氧化防御系統(tǒng)可以清除氧自由基及其代謝產物，而當氧自由基過量生成時，體內平衡就會被破壞[12-13]。睪丸扭轉后抗氧化酶系統(tǒng)遭受損傷，而再灌注過程會產生大量的氧自由基，其通過直接損害或者一系列過氧化鏈式反應，會引起睪丸細胞結構的廣泛破壞[11]，因此，清除睪丸內的氧自由基對減輕氧化損傷至關重要。

使用藥物清除活性氧可以作為睪丸外科手術的有效補充[14-15]。之前的研究結果已證實多種抗氧化劑在動物睪丸扭轉復位模型中具有減輕缺血再灌注損傷的作用，但是真正能用于臨床的卻并不多[16-18]。青蒿琥酯是具有β-倍半帖內酯類青蒿素的衍生物，具有治療瘧疾、病毒、腫瘤以及調節(jié)機體免疫功能等藥理作用[19]。本研究沿順時針方向扭轉大鼠左側睪丸720°，2 h后復位，建立睪丸缺血再灌注損傷。與對照組比較，缺血組睪丸SOD活性明顯降低，MDA含量顯著升高，而應用青蒿虎酯可以升高因缺血降低的SOD水平，降低因扭轉缺血升高的MDA含量，提示青蒿虎酯可通過清除氧自由基及增加抗氧化能力而有效改善睪丸扭轉造成的生殖細胞損傷。

本研究利用睪丸扭轉復位模型來研究青蒿虎酯對睪丸缺血再灌注損傷的保護作用。筆者發(fā)現(xiàn)睪丸扭轉復位期間的缺血再灌注損傷會造成生精小管明顯萎縮和生精上皮細胞減少，間質明顯水腫及出血。另外，本研究發(fā)現(xiàn)睪丸扭轉復位后可以誘導生精細胞凋亡，與對照組比較，凋亡指數(shù)明顯升高，而青蒿虎酯可以明顯緩解睪丸缺血再灌注后的生精細胞形態(tài)學改變，并顯著降低凋亡指數(shù)。在凋亡過程中，PARP-1被切割為兩個片段，使細胞內的ATP不會被PARP-1的功能活動所耗竭，保證能量供應[20]。但是，PARP-1并非被動參與細胞凋亡過程，其過度激活可促進AIF的釋放，引起Caspase途徑依賴的細胞凋亡過程。本研究結果顯示，與對照組比較，缺血組和青蒿虎酯組PARP-1和AIF表達顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。而與缺血組比較，青蒿虎酯組上述指標的表達又顯著下降（P < 0.05）。提示青蒿虎酯預處理可通過調節(jié)PARP-1/AIF通路的表達，從而抑制睪丸細胞凋亡，這與本研究TUNEL實驗的檢測結果相一致，提示青蒿虎酯預處理具有保護睪丸缺血再灌注損傷的作用。

綜上所述，青蒿虎酯對睪丸缺血再灌注后的生精能力具有保護作用，其機制可能是通過抑制PARP-1/AIF通路表達而實現(xiàn)的，提示青蒿虎酯可作為一種治療睪丸缺血再灌注損傷的有效藥物實際運用于臨床。

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（收稿日期：2018-07-26? 本文編輯：張瑜杰）