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    實時熒光定量PCR檢測人感染狂犬病病毒的分析報告

    2019-04-29 00:00:00何芝菲
    大科技·C版 2019年1期

    摘 " "要:狂犬病是一種由狂犬病病毒引起的烈性傳染病。本試驗通過實時熒光定量PCR技術對一例疑似人感染狂犬病病毒的病例分7個時段采集其尿液及唾液標本進行實驗室檢測。結果顯示,7個唾液樣本狂犬病病毒均為陽性,7個尿液樣本中5個樣本為陽性,2個樣本為陰性,唾液樣本Ct值明顯優(yōu)于尿液樣本。本試驗對實時熒光定量PCR技術應用到臨床檢測狂犬病病毒具有重要的參考價值。

    關鍵詞:狂犬病病毒;實時熒光定量PCR;檢測

    中圖分類號:S852.65 " " " " " "文獻標識碼:A " " " " " " " 文章編號:1004-7344(2019)03-0272-02

    狂犬?。╮abies)是由狂犬病毒(rabiesvirus,RABV)所致的人獸共患急性傳染病,發(fā)病后死亡率接近100%。全球每年約有5.5萬人死于狂犬病,我國是狂犬病高發(fā)地區(qū),因感染狂犬病死亡的人數(shù)居世界第二[1]。在我國,狂犬病是國家重點防控的乙類傳染病。近年來,由于我國養(yǎng)犬、貓等寵物的家庭日漸增多,該病的發(fā)病率呈上升趨勢[2]。據(jù)中國疾病預防控制中心2017年的最新統(tǒng)計,2017年全國狂犬病發(fā)病數(shù)為516人,死亡502人。

    狂犬病毒屬于彈狀病毒(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬,是單股負鏈RNA病毒,基因組長度為11928~11932nt,編碼5種蛋白結構,5種蛋白對應5種結構基因編碼,其中N基因具有毒株間的相對保守性和高拷貝復制性,是分子診斷的目標序列[3]。近年來,隨著分子生物技術的迅猛發(fā)展,核酸診斷技術被應用到狂犬病的診斷中。實時熒光定量PCR(Real-TimePCR)是基于傳統(tǒng)PCR上發(fā)展起來的新技術,具有實時監(jiān)測核算拷貝數(shù)量、靈敏度高、檢測速度快等優(yōu)點,被廣泛應用于病毒性病原體的快速檢測中[4]。目前,國內鮮有采用實時熒光定量PCR技術對人體感染狂犬病病毒樣本進行檢測的報道。本試驗通過實時熒光定量PCR技術對一例人感染狂犬病病毒的病例進行取樣檢測,旨在為實時熒光定量PCR技術應用到臨床檢測狂犬病病毒提供參考。

    1 "材料與方法

    1.1 "標本信息

    患者劉某,男,53歲,重慶市潼南區(qū)人。該患者于2018年7月被犬咬傷手臂,暴露程度Ⅲ度,傷口未處理。劉某于2018年11月28日出現(xiàn)煩躁、恐水、怕風、抽出等癥狀,并于12月1日入院。2018年12月3日晚間19點至4日早上7點期間,時隔2h對患者中段尿及唾液進行采集,共計14個樣本(1~7號為尿液樣本,8~14號為唾液樣本),采集后的樣品于-20℃下保存。

    1.2 "試劑與儀器

    病毒核酸提取試劑盒(磁珠法)和狂犬病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)均購自江蘇碩世生物科技有限公司,Real-TimePCRSystem(stepone),全自動核酸提取儀(SSNP-2000A)。

    1.3 "方 法

    1.3.1 "核酸提取

    將樣品于室溫條件下融凍,向病毒核酸提取試劑盒對應孔位分別加入樣品200μl,置于全自動核酸提取儀中進行核酸提取,具體操作見說明書。提取完成后吸出樣品核酸于保存管中,-20℃下保存。

    1.3.2 "實時熒光定量PCR反應

    ①反應體系:每人份PT-PCR反應液7.5μl,酶混合液5μl,狂犬病反應液4μl,去RNA酶水3.5μl,樣品5μl,總體積25μl。②反應條件:逆轉錄反應50℃30min,預變性95℃5min,變性95℃10s,退火、延伸及檢測熒光55℃40s45個循環(huán)。

    1.3.3 "結果判定方法

    (1)陽性對照:Ct≤30且擴增曲線呈典型S型顯示。

    (2)陰性對照:無典型S型擴增曲線顯示。

    (3)樣本陽性:Ct≤35且曲線呈S型。若樣本檢測結果35

    (4)樣本陰性:Ct>38或者未檢出。

    2 "結 果

    2.1 "實時熒光PCR對尿液樣品檢測結果

    對7個時段采集的病人中段尿樣品進行實時熒光定量PCR檢測,結果見圖1,由圖可知2號和6號樣本為陰性,其余樣本實時熒光定量PCR的Ct值分別為1號:35.68,3號:35.77,4號:36.63,5號:36.12,7號:35.92。

    2.2 "實時熒光PCR對唾液樣品檢測結果

    對7個時段采集的病人唾液樣品進行實時熒光定量PCR檢測,結果見圖2,由圖可知7個唾液樣本均含有狂犬病病毒,各樣本實時熒光定量PCR的Ct值分別為8號:30.12,9號:31.22,10號:30.91,11號31.75,12號:29.33,13號:29.89:14號29.78。

    3 "討 論

    本試驗采用實時熒光定量PCR方法對以一例真實發(fā)病的病人7個時段唾液及尿液為樣本進行檢測。由結果可知尿液樣本中2號和6號樣本結果為陰性,其余時段尿液均有病毒檢出,而7個唾液樣本所有時均為陽性,且曲線的CT值明顯優(yōu)于尿液樣本。這是由于狂犬病的最主要傳染源是發(fā)病和攜帶病毒的動物,這些動物的唾液中含有大量病毒[5],并通過咬傷、抓傷進行傳染,因此唾液樣本的病毒含量遠高于尿液樣本。而狂犬病毒的分泌量由一定的波動性[6],因此在尿液樣本中出現(xiàn)兩個陰性。

    目前,對狂犬病毒的實驗室診斷方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、熒光抗體技術(FAT)、環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)、逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)及實時熒光定量PCR(Real-TimePCR)等。目前FAT技術是WHO和OIE推薦的黃金標準方法,但此方法需要異硫氰酸熒光素鹽為熒光標記物標記抗體以定位抗原,同時還需要使用熒光顯微鏡,操作較繁瑣,對試驗操作人員專業(yè)素質要求較高。實時熒光定量PCR技術以其快速、靈敏、重復性好的特點已被廣泛應用于高通量的病毒檢測,目前,國內外已經(jīng)應用這一技術建立了多種檢測RABV的熒光定量PCR方法,針對我國狂犬病的流行特征,許運斌[7]等均成功合成引物和探針建立了熒光定量PCR檢測RABV的方法。但實時熒光定量PCR技術在試驗過程中容易造成樣本的污染導致假陽性的出現(xiàn),這一情況有待進一步研究改善。

    狂犬病是一種嚴重危害人類生命安全的疫病,急需一種快速、準確、靈敏的診斷方法。本試驗通過實時熒光定量PCR檢測了一例人感染狂犬病病毒的尿液及唾液樣本,一定程度上填補了國內使用此方法用于臨床檢測報道的空白,對未來實時熒光定量PCR用于臨床檢測人感染狂犬病病毒的檢測及推廣有一定的參考價值。

    參考文獻

    [1]Blanton J D,Palmer D,Dyer J,etal.Rabies surveillance in the United States during[J].J Am Vet Med Asso,2011,239:773~783.

    [2]王 科,葉 峰,趙英仁.狂犬病的研究進展[J].臨床內科雜志,2010,5(27):298~301.

    [3]Bourhy H,Tordo N,Kissi B.Molecular diversity of the Lyssa-virus genns[J]. Virology,1993,194:70~91.

    [4]高 鑫,朱武洋,盧學新.實時熒光定量PCR在病毒檢測中的應用[J].中國人獸共患病學報,2018,34(7):660~666.

    [5]羅 明.我國狂犬病流行狀況分析及防治對策[J].中國人獸共患病雜志,2005,02.

    [6]Zaidman G W,Billingsley A.Corneal impression for the diagnosis of acute rabies encephatilis[J].Ophthalmology,1998,105(2):249~251.

    [7]許遠斌,邵明富,范金紅,等.基因I型狂犬病毒一步熒光定量PT-PCR檢測方法的建立[J].中國人獸共患病學報,2011,27(4):297~310.

    收稿日期:2018-12-7

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