乳腺癌的多層螺旋CT征象與VEGF和CD34表達水平相關(guān)性研究

孔丹青 司 文 王 坤

乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，但由于乳腺并不承擔維持機體正常運轉(zhuǎn)的生理功能，原位乳腺癌不會構(gòu)成生命威脅，但若原位癌細胞脫落成為游離癌細胞，則可隨距離乳腺最近的淋巴循環(huán)傳播，感染機體其他健康器官組織，對患者構(gòu)成生命威脅[1]。

近年來，由于生活壓力和環(huán)境污染，越來越多的女性罹患乳腺癌，且患者的首次發(fā)病年齡有年輕化的趨勢[2]。目前，對于乳腺癌的根治性治療方法迄今仍首推外科治療。為了提高患者的預后，早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療十分重要。

目前，多層螺旋CT成像已被廣泛運用到對腫瘤良惡性判斷、肺癌分期、腫瘤診斷等多個領(lǐng)域中。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平作為機體內(nèi)重要的血管生長調(diào)節(jié)因子，參與到癌細胞的生長、分化和增殖中[3]。VEGF對于促進新血管的生成有著重要作用?？缒ぬ堑鞍證D34特異性地表達于血管內(nèi)皮細胞，也參與到腫瘤新血管的生成過程當中。VEGF和CD34均與腫瘤細胞的增殖生長有關(guān)，同時對兩者在乳腺癌組織中的表達進行研究，將有助于了解兩者之間的關(guān)系[4-5]。本研究旨在探討VEGF和CD34的表達與乳腺癌CT征象的相關(guān)性，從而揭示乳腺癌發(fā)生發(fā)展的生物學機制。

1 資料和方法

1.1 一般資料

采用前瞻性研究模式，選取2013年2月至2016年2月解放軍第307醫(yī)院進行手術(shù)治療的120例乳腺癌患者，將其納入觀察組，其年齡25～54歲，平均年齡(39.8±3.6)歲；84例為浸潤性導管癌，27例為浸潤性小葉癌，13例為勃液腺癌；已婚93例，未婚27例；根據(jù)乳腺癌(tumor node metastasis，TNM)分期，120例患者中Ⅰ期34例、Ⅱ期54例、Ⅲ期32例；120例患者由個人意愿和臨床治療最優(yōu)方案選擇，均自愿接受乳腺癌根治術(shù)。另選64例經(jīng)病理檢查確定為非乳腺癌患者，并將其納入對照組，其年齡24～57歲，平均年齡(38.4±3.9)歲；已婚89例，未婚31例。兩組患者基本情況無顯著差異，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準，所有患者均對研究內(nèi)容知情并簽署同意書。

1.2 納入與排除標準

(1)納入標準：①所有入院患者均因乳腺增生、腫塊等經(jīng)穿刺活檢確診為乳腺癌或非乳腺癌；②神智清晰，能做出自主判斷；③治療依從性好，可以配合完成各項檢查；④年滿24周歲。

(2)排除標準：①存在心肝腦腎等其他主要臟器耗損性疾病患者；②精神疾病患者；③其他部位惡性腫瘤患者；④病歷資料不全者；⑤個人意愿不希望接受手術(shù)治療者。

1.3 儀器設(shè)備

CT檢查采用SOMATOM Spirit多層螺旋CT機(德國西門子醫(yī)療有限公司)；本研究所用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購自優(yōu)爾武漢生物科技公司，嚴格按照試劑盒說明書所述步驟操作。

1.4 檢測方法

(1)CT灌注成像。觀察組患者接受CT檢查，取俯臥位，使其雙乳呈自然下垂狀態(tài)，囑其平靜呼吸，在聽到相應(yīng)指令后屏氣進行掃描。首先進行CT平掃找到所見腫瘤的最大層面，以此為中心采用多次且連續(xù)的同層掃描進行動態(tài)掃描，參數(shù)設(shè)置如下：管電壓120 kV、管電流50 mA，重層厚5 mm，探測器寬度24 mm×1.2 mm，掃描間隔1.0 s，Z軸覆蓋4 cm，延遲5 s起掃。對照組患者采用與觀察組一致的檢查方法和參數(shù)設(shè)置。

(2)血液樣本采集和檢測。所有患者均禁食12 h后取靜脈血，離心，收集血清用于血漿VEGF蛋白表達水平測定。采用ELISA測定患者血漿中VEGF蛋白表達水平。

(3)組織樣本采集和檢測。所有患者的活體組織一經(jīng)采集，均放入10%的中性甲醛溶液中進行固定，并進行石蠟包埋，而后將其制成4 μm的組織切片，用于CD34蛋白表達的檢測。CD34抗體購自Santa Cruz公司。檢測方法為免疫組化法，以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)為陰性對照，采用緩沖液對組織切片進行20 min抗原高溫修復，而后用PBS進行沖洗15 min。而后加入相應(yīng)抗體，在4 ℃環(huán)境下放置超過8 h。再用PBS進行沖洗6 min。順序加入聚合物輔助劑pv-9000試劑一和試劑二，分別放置20 min后用PBS進行沖洗6 min。觀察免疫組化檢測結(jié)果，并采用CMIAS真彩色醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對切片進行分析，隨機選擇每張切片的5個視野(×200)，分別檢測積分光密度(integral optical density，IOD)，取平均值作為該染色切片中相應(yīng)蛋白的表達情況。

1.5 觀察與評價指標

觀察統(tǒng)計兩組患者術(shù)前血漿VEGF蛋白表達水平和組織切片中CD34蛋白表達情況，由同一組醫(yī)師對觀察組患者的CT圖像進行檢查，并統(tǒng)計患者CT征象中顯示出的腫塊大小、形態(tài)、邊緣情況、微小鈣化點、血流顯像分級和是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況，并根據(jù)患者不同的CT征象將其分為不同的組別，統(tǒng)計不同CT征象患者血漿VEGF蛋白表達水平和組織CD34蛋白表達差異，并分析血漿VEGF蛋白表達和組織CD34蛋白表達之間的相關(guān)性。

表2 CT征象與血漿VEGF蛋白和組織CD34蛋白表達水平相關(guān)性分析

表2 CT征象與血漿VEGF蛋白和組織CD34蛋白表達水平相關(guān)性分析

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1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件對各項指標之間的差異進行評價。計量資料用(x-±s)表示，使用t檢驗，血漿VEGF蛋白表達和組織CD34蛋白表達之間的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血漿VEGF蛋白和組織CD34蛋白水平比較

兩組患者的血漿VEGF蛋白和組織CD34蛋白水平表達所示，觀察組患者組織CD34蛋白表達水平顯著高于對照組患者，差異有統(tǒng)計學意義(t=21.954，P＜0.05)，而血漿VEGF蛋白表達水平也顯著高于對照組患者，差異有統(tǒng)計學意義(t=18.415，P＜0.05)，見表1。

表1 血漿VEGF蛋白和組織CD34蛋白水平比較

表1 血漿VEGF蛋白和組織CD34蛋白水平比較

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2.2 CT征象與血漿VEGF蛋白和組織CD34蛋白表達的相關(guān)性分析

在觀察組患者CT征象與血漿VEGF蛋白和組織CD34蛋白表達水平的相關(guān)性分析中，血漿VEGF蛋白和組織CD34蛋白表達水平，在不同腫塊大小、邊緣形態(tài)以及微小鈣化點的患者體內(nèi)表達差異無統(tǒng)計學意義[VEGF蛋白(t=0.17，t=1.28，t=2.97；P＞0.05)CD34蛋白(t=0.42，t=1.17，t=0.43；P＞0.05)]；但是腫塊形態(tài)規(guī)則的患者體內(nèi)血漿VEGF蛋白表達和組織CD34蛋白表達水平顯著高于不規(guī)則患者，差異有統(tǒng)計學意義(t=17.46，t=7.98；P＜0.05)；血流顯像分級在2～3級的患者體內(nèi)血漿VEGF蛋白表達和組織CD34蛋白表達水平顯著高于0～1級患者，差異有統(tǒng)計學意義(t=19.68，t=16.86；P＜0.05)；而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者體內(nèi)血漿VEGF蛋白表達和組織CD34蛋白表達水平顯著高于不存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異有統(tǒng)計學意義(t=17.98，t=18.58；P＜0.05)，見表2。

2.3 血漿VEGF蛋白和組織CD34蛋白表達之間的相關(guān)性

根據(jù)文獻查閱，將患者血漿VEGF蛋白表達高于105.00 μg/ml的稱為陽性表達，組織CD34蛋白表達的I0D值＞35.00的稱為陽性表達。血漿VEGF蛋白表達與組織CD34蛋白表達之間的相關(guān)性結(jié)果顯示，在120例乳腺癌患者中，血漿VEGF蛋白表達和組織CD34蛋白表達同時陽性表達的有82例，只有血漿VEGF蛋白表達陽性的有1例，只有組織CD34蛋白表達陽性的有26例，有11例兩種蛋白均為陰性表達。經(jīng)Spearman相關(guān)系數(shù)分析，血漿VEGF蛋白表達與組織CD34蛋白表達之間呈正相關(guān)(r=0.9842，P＜0.05)，見表3。

3 討論

乳腺癌作為嚴重威脅女性健康的一類惡性腫瘤，近年來，其發(fā)病趨勢呈逐年上升的態(tài)勢，且患病人群中年輕人群占比逐年上升，嚴重威脅女性的生命安全和生活質(zhì)量。在乳腺癌的發(fā)病過程中，多種細胞因子均參與其中，對癌細胞的生長、分化、浸潤和轉(zhuǎn)移都起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[6-7]。在本研究中，選擇了兩種與腫瘤新血管生成有密切聯(lián)系的蛋白VEGF和CD34，研究其在乳腺癌發(fā)生過程中的病理變化和作用。對乳腺癌和非乳腺癌患者的血漿和乳腺組織的檢測結(jié)果顯示，乳腺癌患者組織CD34蛋白表達水平和血漿VEGF蛋白表達水平顯著高于非乳腺癌患者。VEGF是機體內(nèi)一種非常重要的血管生長調(diào)節(jié)因子，其具有促進新血管生成的生理作用，血漿VEGF蛋白的高表達提示腫瘤組織周圍血管的生長旺盛，確保腫瘤組織的充足的血氧供應(yīng)[8-10]；CD34是一種跨膜蛋白，屬于鈣黏蛋白家族，其特異性在血管內(nèi)皮細胞的細胞膜表面表達，其表達水平可以反映局部組織的微血管密度，從而反映局部組織的血供情況。乳腺癌患者腫瘤組織中CD34蛋白表達水平高，提示其在腫瘤細胞表面過度表達，促進腫瘤組織周圍新的微血管的形成，保證腫瘤細胞充足的血氧供應(yīng)[11-12]。

表3 血漿VEGF蛋白和組織CD34蛋白表達之間的相關(guān)性

多層螺旋CT是乳腺癌診斷和分期判定的影像學證據(jù)，不同分期和病理情況的乳腺癌患者其CT圖像所顯示出來的征象存在著差異。影像學圖像特征的改變是宏觀變化，這種宏觀變化其實與組織內(nèi)調(diào)控腫瘤細胞生長分化的細胞因子密切相關(guān)。正是因為有這些細胞因子的微觀變化，才能使得腫瘤組織在宏觀上反應(yīng)出各種差異。CT圖像征象提示乳腺癌存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或乳腺癌血流顯像處于2～3級的患者，其CD34和VEGF的表達水平更高。這是因為，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或血流顯像處于2～3級的腫塊都表示該乳腺癌周圍血流豐富，微血管網(wǎng)絡(luò)發(fā)達，侵襲周圍健康組織的可能性大，由此表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血流顯像分級的超聲征象提示的乳腺癌惡變程度與CD34和VEGF不同表達水平提示的乳腺癌惡變程度相一致[13-14]。此外，組織CD34蛋白表達和血漿VEGF蛋白表達還在腫塊形態(tài)規(guī)則的患者體內(nèi)高表達，本研究觀察到，規(guī)則的腫塊形態(tài)主要為圓形或類圓形，這類組織與周圍組織和相互之間的連粘性很少，其內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)往往即為混亂，腫瘤細胞的分化程度也較低，極易隨淋巴發(fā)生轉(zhuǎn)移[15]。本研究進一步分析血漿VEGF蛋白表達和組織CD34蛋白表達的相關(guān)性顯示，這兩種蛋白表達存在正相關(guān)，表明兩者在乳腺癌發(fā)病的病理過程中，可能存在協(xié)同作用。同時，在對疑似乳腺癌患者進行分子生物學物質(zhì)檢查時，將這兩種蛋白聯(lián)合檢查可以對檢查結(jié)果相互印證，并相互補充，有助于為乳腺癌診斷和惡變程度的判斷提供更多的依據(jù)。

乳腺癌的發(fā)病機制多樣，其分子生物學特征也復雜多變，僅僅依靠CT檢測或是分子生物學檢查無法得到完整的結(jié)果。在臨床中對乳腺癌的檢查還需要同時運用多種檢查手段，以發(fā)揮其各自之間的優(yōu)勢。一方面CT圖像可以很好的對病灶位置、癌癥分期和分型進行判斷，但是其無法獲得腫瘤組織內(nèi)部的生物信息；另一方面蛋白質(zhì)大分子產(chǎn)生自腫瘤細胞內(nèi)部，可以很好的反應(yīng)腫瘤組織的增殖分化狀況，但是卻無法直觀的對腫瘤的外在表現(xiàn)進行把握[16-17]。因此，將兩者有機的結(jié)合起來有助于臨床工作者對腫瘤組織進行全面了解。

乳腺癌CT圖像征象與血漿VEGF蛋白表達和組織CD34蛋白表達之間存在相關(guān)性，可以作為無創(chuàng)性預測乳腺癌患者血漿VEGF蛋白表達和組織CD34蛋白表達的方式，為乳腺癌惡變程度和預后的判斷提供更多的依據(jù)。