pH對(duì)水酶法大豆乳狀液穩(wěn)定性影響的機(jī)理研究

胡 淼，齊寶坤，謝鳳英,2，李 楊

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030； 2.哈爾濱市食品產(chǎn)業(yè)研究院，哈爾濱 150028)

我國(guó)現(xiàn)行提取植物油脂的方法主要有壓榨法和溶劑浸提法，但壓榨法存在油脂提取率低的問題，溶劑浸提法存在溶劑殘留問題。水酶法是一種經(jīng)濟(jì)、綠色、安全無污染的油脂提取技術(shù)[1]，同時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物——蛋白和膳食纖維具有較高的功能特性[2]，但在利用水酶法提取油脂的過程中，油脂進(jìn)入水相，油料蛋白作為表面活性劑吸附在油脂表面形成穩(wěn)定的乳狀液[3]，使得大量的油脂存在于乳狀液中，降低了油脂的提取率，因此研究乳狀液的穩(wěn)定性對(duì)于乳狀液的破除，提高油脂提取率至關(guān)重要。

大量研究表明乳狀液的穩(wěn)定性主要受有機(jī)溶劑、酶、溫度、鹽離子強(qiáng)度、pH等影響：遲延娜等[4]研究了水酶法提取油脂過程中由溫度和pH協(xié)同作用形成的頑固乳狀液的破除，發(fā)現(xiàn)50%的乙醇能夠明顯降低乳狀液穩(wěn)定性，使游離油的得率達(dá)到90%；Li等[5]研究了酶解對(duì)生物解離花生乳狀液穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著酶解時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，乳狀液的界面張力增加，穩(wěn)定性逐漸降低；崔健等[6]比較了不同的環(huán)境因素(溫度、鹽離子強(qiáng)度、pH)對(duì)乳清蛋白乳狀液穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明pH是影響乳清蛋白乳狀液穩(wěn)定性的主要因素； Chabrand等[7]采用調(diào)節(jié)pH的方法進(jìn)行破乳，破乳率可達(dá)83%。大量的研究表明pH對(duì)于乳狀液的穩(wěn)定性有顯著的影響，但是鮮少有人進(jìn)行pH對(duì)乳狀液結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性機(jī)理的研究。因此，在前期對(duì)大豆乳狀液組成和相關(guān)性質(zhì)研究的基礎(chǔ)上[8]，本文主要研究不同pH下乳狀液的性質(zhì)及其中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，闡明pH影響乳狀液穩(wěn)定性的機(jī)理，為生物解離技術(shù)破除乳狀液提供理論基礎(chǔ)，推進(jìn)生物解離技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

大豆，東農(nóng)-42；Protex 6L 堿性蛋白酶，杰能科生物工程有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇，美國(guó)Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)G-250，南京生興生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，紹興科宏儀器有限公司；擠壓膨化機(jī)，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)自制；ZNCL-BS電動(dòng)磁力攪拌器；激光共聚焦顯微鏡；LGJ-1冷凍干燥機(jī)；GL-21M高速冷凍離心機(jī)；Mini-PROTEAN Tetra電泳儀，美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司；TNZ1-5700傅里葉紅外光譜儀，英國(guó)Thermo Fisher公司；F2000熒光光譜儀，日本日立(Hitachi)公司；Mastersizer 2000粒度儀、Nano-ZS90Zeta電位儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶解及乳狀液分離

脫皮大豆進(jìn)行擠壓膨化預(yù)處理，按照1∶6的質(zhì)量比與蒸餾水混合均勻后，在60℃恒溫水浴鍋中加熱，2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH保持在9.0左右，加入一定量的Protex 6L 堿性蛋白酶，酶解3 h，90℃下滅酶90 s，在4 500 r/min下離心20 min，離心后吸取游離油，將其余液體部分倒入分液漏斗，靜置24 h分層后，將乳狀液分離。

1.2.2 乳狀液的pH處理

酶解大豆獲得的乳狀液pH為8.25(空白)。稱取20 g原始乳狀液，分別用1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)原始乳狀液的pH至2、4、5、6、8、10，靜置1 h，然后在3 585g下離心10 min，分離乳狀液和水相。

1.2.3 乳狀液粒徑及電位的測(cè)定

采用Mastersizer 2000粒度儀測(cè)定乳狀液體積加權(quán)平均值(D4,3)。將乳狀液稀釋1 000倍，保持粒徑數(shù)值在測(cè)定范圍內(nèi)，設(shè)定大豆油滴的折射指數(shù)(RI)為1.47，分散劑的RI為1.333，吸光值為0.001，在室溫下進(jìn)行測(cè)定。

采用Zeta電位儀測(cè)定乳狀液的Zeta電位。將乳狀液稀釋1 000倍后進(jìn)行測(cè)定，上樣體積為1 mL，測(cè)定溫度為25℃。

1.2.4 乳狀液激光共聚焦分析

大豆乳狀液樣品的激光共聚焦顯微鏡測(cè)定在室溫下進(jìn)行，采用Ar/K和He/Ne雙通道激光模式，激發(fā)光的波長(zhǎng)分別是488 nm和633 nm。分別將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的尼羅紅和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的尼羅藍(lán)溶解在異丙醇中，制成染色液。取1 mL乳狀液樣品，分別加入40 μL尼羅紅染色液和40 μL尼羅藍(lán)染色液，混合均勻后，染色20 min，取染色后的乳狀液樣品1滴放在帶凹槽的載玻片上，蓋上蓋玻片并用甘油密封。采用油鏡進(jìn)行圖像的采集，觀察的分辨率為1 024×1 024，圖像采集的范圍為5～45 μm。

1.2.5 乳狀液中蛋白質(zhì)的提取

乳狀液中蛋白提取方法采用丙酮沉淀法[9]。冰丙酮與乳狀液按照質(zhì)量體積比20 ∶1的比例混合，在-18℃下放置2 h，在4℃、12 000g下離心15 min，除去上清液，沉淀用冰丙酮洗滌至溶劑由黃色變成無色，將沉淀中溶劑揮發(fā)后凍干得到蛋白，放入4℃冰箱備用。

1.2.6 乳狀液中蛋白質(zhì)相關(guān)研究

1.2.6.1 紅外光譜的測(cè)定

利用傅里葉紅外光譜儀對(duì)乳狀液蛋白的紅外吸收光譜進(jìn)行采集。測(cè)定條件：25℃下，掃描范圍400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描信號(hào)累加64次。

1.2.6.2 熒光光譜的測(cè)定

依據(jù)尹壽偉[10]的方法。將蛋白樣品分別分散于0.01 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)中，配制蛋白質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL的溶液。熒光發(fā)散光譜分析以蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的色氨酸熒光基團(tuán)為探針，為了降低酪氨酸的貢獻(xiàn)，熒光光譜的激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，光譜的掃描范圍為300～400 nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫的寬度均為5 nm。

1.2.6.3 SDS-PAGE電泳分析

樣品溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)中，質(zhì)量濃度為15 mg/mL、20 μL的樣品溶液與10 μL上樣緩沖溶液混合均勻后，在100℃下加熱90 s，電泳上樣量為10 μL，濃縮膠和分離膠的濃度分別為5%和15%，初始電壓為80 V，待樣品進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)整為120 V，結(jié)束后取下膠塊，用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色，甲醇、冰乙酸進(jìn)行脫色，利用凝膠成像儀對(duì)其進(jìn)行分析。

1.2.6.4 表面疏水性的測(cè)定

依據(jù)Kato等[11]的方法，即ANS熒光探針法。將一定量的乳狀液蛋白溶于0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)中，室溫?cái)嚢? h，使樣品充分溶解，在10 000g下離心30 min，用Lowry法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，梯度稀釋，使其濃度范圍在0.005～0.5 mol/L，40 μL 8 mmol/L的ANS溶液置于4 mL不同濃度的樣品中，充分混勻后靜置5 min，測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度(FI)，激發(fā)波長(zhǎng)為370 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為490 nm，狹縫寬度為5 nm。以熒光強(qiáng)度和蛋白質(zhì)濃度作圖，初始段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)(S0)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

為保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，每組試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，并將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差分析。采用SPSS 19統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性分析，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同pH條件下乳狀液的粒徑分布和Zeta電位分析

圖1為不同pH條件下乳狀液的粒徑分布。

圖1 不同pH條件下乳狀液的粒徑分布

由圖1可知，乳狀液的粒徑主要呈雙峰粒度分布，主要集中在0.5～10 μm和10～100 μm，其中pH在2、4、5、6時(shí)，乳狀液的粒徑分布主要集中在10～100 μm，而pH在8、10時(shí)，乳狀液的粒徑分布比較廣，在pH 5時(shí)有最大的粒徑。Xiong等[12]探究不同pH下卵清蛋白/殼聚糖混合物在油水界面的乳液穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在pH 5.5時(shí)，乳液的粒徑分布變大，乳液發(fā)生聚集。這一結(jié)論與本文的研究一致，產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是因?yàn)樵趐H 5左右為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，使乳狀液粒徑增大[13]。

圖2為不同pH條件下乳狀液的Zeta電位。

圖2 不同pH條件下乳狀液的Zeta電位

由圖2可知，pH在8、10時(shí)的Zeta電位分別為-23.5 mV和-28.8 mV，表明乳狀液具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，在pH為4.5～4.7的范圍內(nèi)乳狀液的Zeta電位接近于0，說明乳狀液在pH 4.5～4.7的范圍內(nèi)穩(wěn)定性最低， Li等[14]研究了花生乳狀液的電位變化，發(fā)現(xiàn)在pH 8～9時(shí)，花生乳狀液的電位為-36.60 mV，乳狀液具有較好的穩(wěn)定性，而在pH 3～5的范圍內(nèi)乳狀液的電位較低，穩(wěn)定性較差，這一結(jié)果與本文的研究一致。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于乳狀液中的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附件發(fā)生聚合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不能包裹住油滴，使乳狀液的穩(wěn)定性降低。

2.2 不同pH條件下乳狀液微觀結(jié)構(gòu)分析

圖3為不同pH條件下乳狀液的激光共聚焦圖。由圖3可知，pH的變化對(duì)乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)具有顯著影響。隨著pH的增加乳狀液中油滴的尺寸呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在pH為6時(shí)油滴達(dá)到最大，蛋白質(zhì)形成的界面膜完全被破壞，油滴發(fā)生聚集。同酸性條件下的乳狀液相比，堿性條件下油滴尺寸更小，且分布均勻，呈現(xiàn)出均勻穩(wěn)定的外觀。這些結(jié)果說明在pH接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，乳狀液穩(wěn)定性最差，油滴易于聚集形成大油滴。此外，堿性條件下比酸性條件下油滴尺寸更小，且分布更均勻，說明堿性條件下乳狀液的穩(wěn)定性更好。Li等[14]觀察了花生乳狀液的顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在花生蛋白的等電點(diǎn)處油滴尺寸較大，該結(jié)論與本文的結(jié)果相一致。表明乳狀液在等電點(diǎn)處出現(xiàn)失穩(wěn)現(xiàn)象。

注：a.pH 2；b.pH 4；c.pH 5；d.pH 6；e.pH 8；f.pH 10。

圖3 不同pH條件下乳狀液的激光共聚焦圖

2.3 不同pH條件下乳狀液中蛋白質(zhì)的分析

2.3.1 表面疏水性

圖4為不同pH條件下乳狀液中蛋白質(zhì)的表面疏水性。

圖4 不同pH條件下乳狀液中蛋白質(zhì)的表面疏水性

由圖4可知，不同pH條件下乳狀液中蛋白質(zhì)的表面疏水性具有顯著差異，pH為5的乳狀液中蛋白質(zhì)的表面疏水性最低，當(dāng)pH遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，表面疏水性逐漸增加，這是由于pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)會(huì)增加蛋白質(zhì)表面相同的電荷，使分子間靜電排斥作用增強(qiáng)，引起蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)，導(dǎo)致表面疏水性增加[15]。在堿性條件下的乳狀液中蛋白質(zhì)的表面疏水性大于酸性條件下的，這可能是由于在堿性條件下，大豆蛋白中少量的植酸發(fā)生解離[16]，這會(huì)使蛋白質(zhì)具有更高的電負(fù)性，增加了分子間的排斥力，使蛋白質(zhì)分子展開程度增大，暴露出更多的疏水殘基，導(dǎo)致堿性條件下具有更高的表面疏水性。表面疏水性的增加可以使更多的疏水基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)舒展，使得蛋白質(zhì)更容易吸附在油滴的表面增加乳狀液的穩(wěn)定性。

2.3.2 SDS-PAGE

圖5為不同pH條件下乳狀液中蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖。

注：泳道M表示蛋白質(zhì)標(biāo)樣Marker；泳道1～6分別表示pH為2、4、5、6、8、10的乳狀液蛋白。

圖5 不同pH條件下乳狀液中蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖

由圖5可知，乳狀液中蛋白質(zhì)亞基相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在11～63 kDa范圍內(nèi)，此外還有一部分亞基分布在相對(duì)分子質(zhì)量小于11 kDa處。pH為2的乳狀液蛋白質(zhì)亞基相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在11 kDa以下、11 kDa處和35 kDa處；當(dāng)pH為4、5、6時(shí)，乳狀液蛋白質(zhì)電泳圖中所有條帶的顏色均加深，且分布在11 kDa和35 kDa處的亞基顯著增加，這可能是由于在乳狀液蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近，蛋白質(zhì)靜電荷趨于0，使蛋白質(zhì)產(chǎn)生聚集，導(dǎo)致相對(duì)分子質(zhì)量增加[17]。pH為8和10的乳狀液蛋白的電泳條帶具有相似的變化趨勢(shì)，所有的條帶均變淺，且相對(duì)分子質(zhì)量分布與pH為2的乳狀液蛋白相近。以上結(jié)果表明，在pH接近乳狀液蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，由于界面蛋白質(zhì)的靜電荷趨于0，靜電排斥作用較小，使蛋白質(zhì)易于聚集，導(dǎo)致相對(duì)分子質(zhì)量增加。

2.3.3 傅里葉變換紅外光譜

圖6為不同pH條件下乳狀液中蛋白質(zhì)的紅外光譜圖。

圖6 不同pH條件下乳狀液中蛋白質(zhì)的紅外光譜圖

通過對(duì)不同pH條件下的乳狀液中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同pH處理對(duì)乳狀液中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量具有顯著影響(P<0.05)(見表1)。

由表1可見，隨著pH的增加(pH 2～8)，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量呈先降低后增加的趨勢(shì)，而β-折疊和無規(guī)卷曲含量呈先增加后降低的趨勢(shì)。pH為5時(shí)α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量最低，為(10.7±0.11)%，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的含量最高，為(28.6±0.15)%。這說明在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近蛋白質(zhì)發(fā)生變性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分或全部展開，導(dǎo)致有序結(jié)構(gòu)含量降低，無序結(jié)構(gòu)含量增加；β-轉(zhuǎn)角含量降低表明蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域暴露，導(dǎo)致表面疏水性增加[20]，與圖4的研究結(jié)果一致，表明在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近乳狀液的穩(wěn)定性較差。

表1 不同pH條件下乳狀液中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量 %

注：表中不同字母表示同一列數(shù)值存在顯著差異(P<0.05)。

2.3.4 乳狀液中蛋白質(zhì)色氨酸內(nèi)源熒光光譜分析

圖7為不同pH條件下乳狀液中蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度及最大吸收波長(zhǎng)。

圖7 不同pH條件下乳狀液中蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度及最大吸收波長(zhǎng)

由圖7可知，在pH為5時(shí)，乳狀液中蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度最低，這可能與pH 5在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近有關(guān)。由pH 5為起始，無論pH向酸性還是堿性偏移，熒光強(qiáng)度均增加，最大吸收波長(zhǎng)(λmax)與熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)相似，當(dāng)pH為2～5時(shí)，λmax由(345.5±0.15)nm降低到(341.6±0.29)nm，當(dāng)pH為5～10時(shí)，λmax由(341.6±0.29)nm增加到(348.0±0.37)nm，說明pH為5的乳狀液中蛋白質(zhì)的λmax最低，而當(dāng)pH遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，λmax發(fā)生了紅移，這表明蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)變得更加松散，可能是當(dāng)pH遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu)適當(dāng)展開，蛋白質(zhì)的分子柔性增加，使原本包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水殘基暴露到極性環(huán)境中導(dǎo)致的[21]，這在本文pH遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)使蛋白質(zhì)表面疏水性增加的結(jié)果中也可以得到證實(shí)。

3 結(jié) 論

通過考察不同pH下乳狀液的粒徑、Zeta電位、微觀結(jié)構(gòu)及其中蛋白質(zhì)性質(zhì)，研究pH對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響機(jī)理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH主要是通過改變?nèi)闋钜褐械鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)改變?nèi)闋钜旱姆€(wěn)定性。在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近，乳狀液粒徑增大，Zeta電位接近0，乳狀液中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，表面疏水性降低，從而使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，不足以穩(wěn)定乳狀液，使乳狀液穩(wěn)定性降低。