仙鹿健骨湯對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)作用及機(jī)制研究*

袁寶明 馮學(xué)會(huì) 李宇能

（1.北京朝陽急診搶救中心，北京 100000；2.中國人民解放軍第三〇二醫(yī)院，北京 100039；3.北京積水潭醫(yī)院，北京 100000）

膝骨性骨關(guān)節(jié)炎（KOA）臨床表現(xiàn)為疼痛和肌肉骨骼疾病，可導(dǎo)致殘疾，生活質(zhì)量下降和嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。其特征主要為膝關(guān)節(jié)軟骨的退化、滑膜炎、骨重建和肌肉無力［1-3］。盡管已經(jīng)進(jìn)行了大量研究，但KOA的具體原因尚不清楚。目前，KOA關(guān)節(jié)軟骨損傷的機(jī)制被認(rèn)為與炎癥免疫反應(yīng)有關(guān)，p38在識(shí)別內(nèi)源性激動(dòng)劑中起重要作用，如大分子降解產(chǎn)物，熱休克蛋白，蛋白水解物級(jí)聯(lián)產(chǎn)物，破裂細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)成分，以及被炎癥激活的基因產(chǎn)物。有越來越多的證據(jù)證明p38在引發(fā)與關(guān)節(jié)炎中的具有重要作用［4-5］。p38的激活啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，最終激活核因子-κB（NF-κB）轉(zhuǎn)錄因子。作為p38信號(hào)傳導(dǎo)中最重要的下游分子之一通路，NF-κB是許多細(xì)胞因子表達(dá)所需的轉(zhuǎn)錄因子，包括基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的調(diào)節(jié)，這有助于細(xì)胞外基質(zhì)的降解，增加膝關(guān)節(jié)軟骨損傷［6-8］。在各種MMP中，膠原酶如MMP-1和MMP-3通過降解細(xì)胞外基質(zhì)在KOA進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。此外，在炎癥介質(zhì)中，白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）與KOA中的炎癥和軟骨退化中的滑膜有關(guān)［9-10］。仙鹿健骨湯具有抗炎、成骨細(xì)胞修復(fù)的功效。本研究擬探討仙鹿健骨湯對(duì)KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)作用及機(jī)制，為KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療提供理論及臨床依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD（Sprague Dawley）大鼠100只，12 周齡，體質(zhì)量（117.43±13.21） g，湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供 ［許可證號(hào)：SCXK （湘）2011-0003］，動(dòng)物自由攝取飼料、自由飲水，自動(dòng)控制晝夜循環(huán)（12/12 h），室溫（22±1） ℃。

1.2 試藥與儀器 仙鹿健骨湯組成：淫羊藿20 g，鹿角膠 12 g，紫河車 10 g，補(bǔ)骨脂 12 g，白術(shù) 12 g，山藥12 g，雞血藤 15 g，當(dāng)歸 12 g，石菖蒲 12 g。 制作工藝為：仙鹿健骨原藥適度粉碎。按1∶4物液比加入蒸餾水浸泡24 h，70℃水浴加熱回流提取，每次加熱2 h，共4次。提取液趁熱過濾，藥渣按1∶20物液比加入蒸餾水，加熱2 h，提取溫度保持在70℃，回流提取4次，最后將提取液合并濃縮，每克仙鹿健骨湯濃縮液相當(dāng)于生藥5.14 g。將濃縮液溶入蒸餾水，根據(jù)成人劑量公式換算，大鼠用藥量為成人的20.13倍，以10.0 mL/kg體質(zhì)量灌胃，將藥液濃度配制成為10.0 g/mL。p38、NF-κB、MMP-9、MMP-13、IL-1β ELISA 試劑盒購于上海邦奕生物科技有限公司、熱電MK3酶標(biāo)儀。Trizol RNA提取試劑和逆轉(zhuǎn)錄 （RT）試劑盒購自美國的Invitrogen Corporation（City，State，USA），P38、NF-кB RNA 定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng) （qRT-PCR）試劑盒購自上海Gene Pharma有限公司。使用的TePCR熱循環(huán)儀是Ro-che Light Cycler（Kaiseraugst，Rheinfelden，Switzerland）。

1.3 分組與造模 根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分成5組：對(duì)照組、模型組、仙鹿健骨湯低劑量組（10.0 mg/kg）、仙鹿健骨湯中劑量組 （20.0 mg/kg）、仙鹿健骨湯高劑量組（40.0 mg/kg）、每組20只，雌雄各半。模型組、仙鹿健骨湯各劑量組腹腔注射6%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，取仰臥位固定操作臺(tái)上，右側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)備皮，取髕骨內(nèi)側(cè)縱行術(shù)口長約1 cm，逐層暴露，尋找并剪斷大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶，切除內(nèi)側(cè)半月板，剪斷前后交叉韌帶。完成后無菌0.9%氯化鈉注射液沖洗關(guān)節(jié)，縫合術(shù)口，包扎固定。術(shù)后，肌注青霉素連續(xù)3 d（8萬U）。

1.4 給藥方法 仙鹿健骨湯各劑量組于造模成功第1天開始給予相應(yīng)藥物灌胃（灌胃體積1.0 mL/100 g），持續(xù)給予3個(gè)月，對(duì)照組和模型組給予等體積0.9%氯化鈉注射液。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行大鼠KOA軟骨Mankin′s評(píng)分。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）p38、NF-кB在膝關(guān)節(jié)軟骨組織中表達(dá)的測定。根據(jù)制造商的說明，使用Trizol Reagent（Invitrogen，USA）從膝關(guān)節(jié)軟骨組織（癌旁組織）中提取總RNA。使用One Step PrimeScript miRNA cDNA合成試劑盒（TaKaRa）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用 SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa）進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR。使用內(nèi)源性U6小核RNA（U6）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（U6 正向引物 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′； 反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′）。 通過 2-ΔΔCT方法計(jì)算p38、NF-κB在膝關(guān)節(jié)軟骨組織中的相對(duì)表達(dá)水平。PCR引物的序列如下：p38正向引物：5′-AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC-3′， 反向引物：5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3′；NF-κB 正向引物：5′-ATTTCACCAATCTTGTCTCCATCA-3′， 反向引物：5′-CTCCTCCTGTTC GACAGTCAGC-3′。 反應(yīng)體系為：正向引物 10 μL、 反向引物 10 μL、RNA 模版 0.6 μL、超級(jí)酶混合物 0.2 μL、2×μByr一步法 RT-qPCR 緩沖液5 μL、去 RNA 水 3.4 μL。循環(huán)如下：95 ℃持續(xù) 10 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，持續(xù)15 s溫度60℃。2）ELISA測定大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中 p38、NF-κB、MMP-9、MMP-13、IL-1β蛋白水平。按照無菌條件操作，稱取0.1 g膝關(guān)節(jié)軟骨組織組織，加入少量液氮，在研缽中迅速將膝關(guān)節(jié)軟骨組織碾碎至粉末狀；將組織粉末轉(zhuǎn)入2 mL Eppendorf管中，加入 1.2 mL PBS（pH7.4），充分振蕩混勻，2 000 g，4℃，離心20 min。仔細(xì)收集上清液。獲取膝關(guān)節(jié)軟骨組織勻漿后，采用Elisa法檢測膝關(guān)節(jié)軟骨組織中 p38、NF-κB、MMP-9、MMP-13、IL-1β 蛋白水平。3）免疫組化方法測定p38、NF-κB蛋白在大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織的表達(dá)。大鼠取膝關(guān)節(jié)軟骨組織制作常規(guī)石蠟切片，3%H2O2液常溫阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶活性， 微波修復(fù)抗原，PBS常規(guī)沖洗，1%p38、NF-κB抗體工作液，4℃過夜，加入二抗（IgG），室溫 30 min，加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。采用雙盲法統(tǒng)計(jì)結(jié)果，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400）計(jì)數(shù)，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為 3 分，同時(shí)計(jì)數(shù)；＞50%為（+++），26%～50%為（++），6%～25%為（+），陽性細(xì)胞≤5%為（-）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Epidata、SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，分析前進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，若滿足正態(tài)性，采用LSD-q兩兩檢驗(yàn)，若不滿足正態(tài)性，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行LSD-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)比較 見圖1。對(duì)照組膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整，軟骨表面光滑，軟骨細(xì)胞分布均勻且排列整齊，核呈卵圓形位于中央，較為清晰，未見炎癥細(xì)胞浸潤；模型組軟骨組織壞死，呈均質(zhì)紅染，軟骨細(xì)胞疏松紊亂，結(jié)構(gòu)破壞，崩解，結(jié)構(gòu)紊亂，核固縮、大量中性粒細(xì)胞浸潤，纖維組織增生；仙鹿健骨湯組高劑量組軟骨細(xì)胞染色清晰，可見少量壞死軟骨細(xì)胞，伴少量淋巴、中心細(xì)胞浸潤，纖維組織增生減少；仙鹿健骨湯組中、低劑量組較模型組而言，軟骨表面局部粗糙不平、潰瘍形成壞死軟骨細(xì)胞減少，炎癥細(xì)胞浸潤減少，但軟骨結(jié)構(gòu)疏松紊亂，具有明顯的劑量依賴效應(yīng)。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)比較（HE染色，400倍）

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨p38、NF-κB mRNA表達(dá)水平與Mankin′s評(píng)分比較 見表1。與對(duì)照組比較，模型組、仙鹿健骨湯各劑量組p38、NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，仙鹿健骨湯各劑量組 p38、NF-κB mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），且隨著仙鹿健骨湯給藥劑量的增加，p38、NF-κB mR NA表達(dá)水平逐漸降低，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組、仙鹿健骨湯各劑量組KOA軟骨 Mankin′s評(píng)分升高（P＜0.05）；與模型組比較，仙鹿健骨湯各劑量組 Mankin′s評(píng)分顯著降低（P＜0.05），且隨著仙鹿健骨湯組給藥劑量的增加，Mankin′s評(píng)分逐漸降低，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯（P＜0.05）。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨p38、NF-κB mRNA表達(dá)水平與Mankin′s評(píng)分比較（x±s）

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨p38、NF-κB mRNA表達(dá)水平與Mankin′s評(píng)分比較（x±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n Mankin′s評(píng)分（分）對(duì)照組 20 1.30±0.42模型組 20 13.65±1.98*仙鹿健骨湯低劑量組 20 10.05±1.23*△p38 mRNA NF-κB mRNA 0.76±0.17 0.96±0.16 3.98±0.12* 3.78±0.15*3.19±0.17*△ 2.89±0.19*△仙鹿健骨湯中劑量組 20 6.23±1.87*△2.12±0.16*△ 2.10±0.23*△仙鹿健骨湯高劑量組 20 1.13±0.20*△ 1.22±0.15*△ 2.40±1.54*△

2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨p38、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較 見表2，圖2～圖3。與對(duì)照組比較，模型組、仙鹿健骨湯各劑量組p38、NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，仙鹿健骨湯各劑量組p38、NF-κB mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），且隨著仙鹿健骨湯給藥劑量的增加，p38、p38、NF-κB蛋白表達(dá)水平逐漸降低，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯（P＜0.05）。免疫組化法下，p38、NF-κB陽性表達(dá)為棕褐色，各組p38、NF-κB陽性表達(dá)情況與各蛋白表達(dá)水平符合。

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨P38、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較（ng/g，x±s）

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨P38、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較（ng/g，x±s）

組 別 n對(duì)照組 20模型組 20仙鹿健骨湯低劑量組 20 p38 NF-κB 98.77±6.46 45.77±6.46 523.36±8.23* 467.86±6.98*412.69±10.69*△ 329.45±6.98*△仙鹿健骨湯中劑量組 20 263.65±15.69*△ 190.15±10.69*△仙鹿健骨湯高劑量組 20 110.36±22.73*△ 90.63±12.73*△

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨p38表達(dá)比較（免疫組化，1 000倍）

圖3 各組大鼠膝關(guān)節(jié) 軟骨NF-κB表達(dá)比較（免疫組化，1 000倍）

2.4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨 MMP-9、MMP-13、IL-1β蛋白表達(dá)水平比較 見表3。與對(duì)照組比較，模型組、仙鹿健骨湯各劑量組MMP-9、MMP-13、IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，仙鹿健骨湯各劑量組MMP-9、MMP-13、IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯降低 （P＜0.05），且隨著仙鹿健骨湯給藥劑量的增加，MMP-9、MMP-13、IL-1β 蛋白表達(dá)水平逐漸降低，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯（P＜0.05）。

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨MMP-9、MMP-13、IL-1β蛋白表達(dá)水平比較（ng/g，x±s）

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨MMP-9、MMP-13、IL-1β蛋白表達(dá)水平比較（ng/g，x±s）

組 別 n IL-1β對(duì)照組 20 99.36±18.63模型組 20 589.36±18.34*仙鹿健骨湯低劑量組 20 432.39±15.39*△MMP-9 MMP-13 78.98±16.32 123.65±23.21 326.21±19.69* 413.65±13.69*261.36±15.32*△ 302.67±19.32*△仙鹿健骨湯中劑量組 20 269.25±19.99*△196.32±18.32*△ 203.36±17.32*△仙鹿健骨湯高劑量組 20 171.32±24.36*△ 160.68±36.69*△ 1 393.26±26.39*△

3 討 論

目前，臨床上已將非甾體消炎藥，皮質(zhì)類固醇和透明質(zhì)酸用于臨床治療KOA。但是，它們不能逆轉(zhuǎn)軟骨損傷，還導(dǎo)致不良的心血管和胃腸道副作用。因此，需要用于治療KOA的新型更好的藥劑。仙鹿健骨湯是從中草藥鹿角膠、骨碎補(bǔ)、仙茅、黃芪、白術(shù)、仙鶴草、當(dāng)歸中純化的湯劑，據(jù)報(bào)道它在體外和體內(nèi)作為抗氧化劑和抗炎劑起作用［11-12］。仙鹿健骨湯預(yù)處理可以防止成骨細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這種作用可能與其抗氧化潛力有關(guān)，阻斷HIF-1α/SDF-1通路的激活［13］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組、仙鹿健骨湯各劑量組KOA軟骨Mankin′s評(píng)分升高；與模型組比較，仙鹿健骨湯各劑量組Mankin′s評(píng)分顯著降低，且隨著仙鹿健骨湯組給藥劑量的增加，Mankin′s評(píng)分逐漸降低，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯；這說明仙鹿健骨湯能對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷具有一定程度的修復(fù)作用。病理學(xué)結(jié)果顯示對(duì)照組膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整，軟骨表面光滑，軟骨細(xì)胞分布均勻且排列整齊，核呈卵圓形位于中央，較為清晰，未見炎癥細(xì)胞浸潤；模型組軟骨組織壞死，呈均質(zhì)紅染，軟骨細(xì)胞疏松紊亂，結(jié)構(gòu)破壞，崩解，結(jié)構(gòu)紊亂，核固縮、大量中性粒細(xì)胞浸潤，纖維組織增生；仙鹿健骨湯組高劑量組軟骨細(xì)胞染色清晰，可見少量壞死軟骨細(xì)胞，伴少量淋巴、中心細(xì)胞浸潤，纖維組織增生減少；仙鹿健骨湯組中、低劑量組較模型組而言，軟骨表面局部粗糙不平、潰瘍形成壞死軟骨細(xì)胞減少，炎癥細(xì)胞浸潤減少，但軟骨結(jié)構(gòu)疏松紊亂，具有明顯的劑量依賴效應(yīng)。這提示仙鹿健骨湯能減輕明顯減輕軟骨細(xì)胞損傷程度。

p38在控制先天免疫中起關(guān)鍵作用，其能激活先天免疫響應(yīng)多種病原體相關(guān)分子模式［14-15］。p38介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路會(huì)聚以激活NF-κB和c-Jun N末端激酶（JNKs），這些激酶誘導(dǎo)一系列炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，這些細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)或調(diào)節(jié)［16］。已經(jīng)在人類細(xì)胞和其他一些物種的膝關(guān)節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn)了p38。p38家族也可以被許多內(nèi)源性配體激活，如熱休克蛋白，壞死細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)和受損脊髓中的氧化脂質(zhì)［17］。 本次研究同時(shí)提示，NF-κB信號(hào)通路的激活是大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨損傷的核心。通過損傷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，細(xì)菌內(nèi)毒素和細(xì)胞因子，NF-κB可被激活。NF-κB的功能在于其調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子基因啟動(dòng)子的能力［18］。MMP-9和MMP-13由于它們能夠切割細(xì)胞外基質(zhì)而在OA中軟骨降解的進(jìn)展中起重要作用。MMP-9以不可逆轉(zhuǎn)的方式分解纖維狀膠原蛋白，而MMP-13降解多種基質(zhì)底物，包括Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖。許多研究報(bào)道，在KOA患者的滑膜，滑膜液和軟骨中MMP-9水平上調(diào)，表明MMP-9在關(guān)節(jié)軟骨的病理性降解中具有重要作用［19］。MMP-13可用作KOA進(jìn)展的預(yù)后生物標(biāo)志物。近年來，炎癥介質(zhì)IL-1β在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)理中的作用越來越受到關(guān)注。IL-1β與KOA的炎癥和軟骨退化中的滑膜有關(guān)［20］。KOA患者的滑膜液和軟骨中存在升高的IL-1β水平，暗示IL-1β在KOA的發(fā)病機(jī)制中起作用。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組、仙鹿健骨湯各劑量組p38、NF-κB mRNA、蛋白表達(dá)水平明顯升高；與模型組比較，仙鹿健骨湯各劑量組p38、NF-κB mRNA、蛋白表達(dá)水平明顯降低，且隨著仙鹿健骨湯給藥劑量的增加，p38、NF-κB mRNA、蛋白表達(dá)水平逐漸降低，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯；而膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨損傷模型大鼠MMP-9、MMP-13、IL-1β水平明顯上調(diào)，給予仙鹿健骨湯后可以抑制其表達(dá)。這說明仙鹿健骨湯組能通過抑制炎癥信號(hào)通路p384、NF-κB mRNA、蛋白表達(dá)水平的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞因子MMP-9、MMP-13、IL-1β的表達(dá)。

綜上所述，仙鹿健骨湯能減輕明顯減輕軟骨細(xì)胞損傷程度，對(duì)KOA節(jié)軟骨損傷具有一定程度的修復(fù)作用，其機(jī)制與仙鹿健骨湯組能通過抑制炎癥信號(hào)通路p384、NF-κB mRNA、蛋白表達(dá)水平的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞因子 MMP-9、MMP-13、IL-1β 的表達(dá)有關(guān)。