身痛逐瘀湯對(duì)大鼠中重度退變腰椎間盤髓核內(nèi)TNF-α、IL-1β 的影響*

佟德民 孫鳳杰 馮福盈 倪東旭

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東 廣州 510700）

中重度腰椎間盤退變性疾病是中老年人常見病，雖然其病理機(jī)制尚未完全闡明，但退變椎間盤內(nèi)穩(wěn)態(tài)持續(xù)紊亂可能是導(dǎo)致椎間隙狹窄、脊椎骨質(zhì)增生骨贅形成等病變的始發(fā)因素和主要原因。既往研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤退變過程中釋放的大量炎性因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等能促進(jìn)纖維環(huán)周緣致敏疼痛神經(jīng)末梢和新生血管向椎間盤內(nèi)部長入而引發(fā)腰痛，因此抑制退變椎間盤內(nèi)炎性因子的表達(dá)可能成為延緩椎間盤退變、減輕腰痛的有效方法。我們?cè)谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)，應(yīng)用身痛逐瘀湯能顯著改善中重度椎間盤退變性疾病患者腰痛和肢體功能，臨床療效滿意［1］。本研究擬觀察身痛逐瘀湯治療中重度大鼠退變椎間盤髓核內(nèi)TNF-α、IL-1β表達(dá)變化，進(jìn)一步揭示其可能的止痛機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡清潔級(jí)雄性SD大鼠128只，體質(zhì)量250～300 g，由廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SGXK（粵）2008-0002。 飼養(yǎng)室溫度 20～25 ℃，相對(duì)濕度為56%～64%。動(dòng)物自由進(jìn)食，自由飲水。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境7 d。

1.2 試藥與儀器 1）實(shí)驗(yàn)試劑及藥物：TNF-α ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒（R&D，美國）。身痛逐瘀湯出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，藥方組成：秦艽3 g，桃仁9 g，紅花9 g，當(dāng)歸 9 g，川芎 6 g，沒藥 6 g，五靈脂 6 g，羌活 3 g，地龍6 g，香附3 g，牛膝9 g，甘草6 g。飲片購買于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院。身痛逐瘀湯煎煮方法：加水500 mL，浸泡 30 min，煮沸后文水煎煮 30 min，取汁300 mL；再加水400 mL，煮沸后文水煎煮20 min取汁200 mL，兩次煎液混合后濃度為1.5 g/mL，保存于恒溫冰箱中備用。尼美舒利分散片（海南康芝藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào) 160503，規(guī)格為 50 mg/粒）。 2）儀器：CM1900冰凍切片機(jī)、RM2015石蠟切片機(jī)、ASP200S自動(dòng)組織脫水機(jī)（Leica公司，德國），CT15ER高速冷凍離心機(jī) （日立公司，日本），KH-BL石蠟包埋機(jī)（Olympus公司，日本）。

1.3 造模與分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法將128只SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、西藥組和中藥組，每組32只。模型組、西藥組和中藥組接受手術(shù)造模，假手術(shù)組接受假手術(shù)。手術(shù)造模方法［2］：隔夜禁食后，予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射。動(dòng)物麻醉后，仰臥位四肢固定，術(shù)區(qū)剃毛，碘伏消毒，取右側(cè)旁正中切口長約3～4 cm，依次切開各層組織，向前側(cè)、對(duì)側(cè)推開腸管及大網(wǎng)膜，鈍性分離椎體旁側(cè)束帶狀腰大肌，顯露L4/5～L5/6椎間盤，選擇16 G針頭針刺椎體右前側(cè)纖維環(huán)（3點(diǎn)位置），朝向椎間盤中心，限制損傷深度為纖維環(huán)全層（約為2～3 mm），損傷后持續(xù)留置10 s，術(shù)后逐層縫合創(chuàng)口。假手術(shù)組依照上述入路操作，但不進(jìn)行椎間盤針刺操作。術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素8×105U/d以預(yù)防感染。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。術(shù)后第8周，每組各隨機(jī)選取8只予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射，麻醉后行腰椎側(cè)位X線檢查。耳源靜脈注射空氣處死，獲取大鼠手術(shù)椎間盤后，ELISA檢測TNF-α和IL-1β含量。腰椎側(cè)位DR檢查示造模后大鼠腰椎間隙高度降低，椎體前緣骨贅形成，部分終板硬化，參照UCLA［3］分級(jí)系統(tǒng)評(píng)價(jià)椎間盤退變程度為Ⅲ°～Ⅳ°，確定造模成功。

1.4 干預(yù)方法 參照不同動(dòng)物等效劑量的折算系數(shù)，身痛逐瘀湯藥方內(nèi)單劑含生藥75 g，計(jì)算得出中藥組大鼠灌胃量為4.5 mL/kg，假手術(shù)組和模型組予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，西藥組予尼美舒利分散片灌胃，量為0.18 mg/kg，每日1次，連續(xù)喂養(yǎng)20 d。分別于喂養(yǎng)后、喂養(yǎng)后2周和喂養(yǎng)后4周每組各隨機(jī)選取8只大鼠處死，獲取椎間盤髓核組織。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 各組大鼠髓核組織采用PIPA裂解液裂解，離心半徑13.5 cm、2 500 r/min離心20 min。取上清液，參照試劑盒說明書測定TNF-α和IL-1β含量，結(jié)果以ng/L來表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，與假手術(shù)組比較用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組不同時(shí)間大鼠椎間盤髓核組織TNF-α水平比較 見表1。喂養(yǎng)前，模型組、西藥組及中藥組與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），該3組互相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。喂養(yǎng)后，模型組、西藥組及中藥組與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），西藥組和中藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），西藥組和中藥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。喂養(yǎng)后2周，模型組、西藥組及中藥組與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），西藥組和中藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），西藥組和中藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。喂養(yǎng)后4周，模型組、西藥組及中藥組與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），西藥組和中藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），西藥組和中藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。假手術(shù)組喂養(yǎng)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與喂養(yǎng)前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組喂養(yǎng)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與喂養(yǎng)前比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），西藥組喂養(yǎng)后2周與喂養(yǎng)前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），中藥組喂養(yǎng)后各時(shí)間點(diǎn)與喂養(yǎng)前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組不同時(shí)間大鼠椎間盤髓核組織TNF-α水平比較（ng/L，x±s）

表1 各組不同時(shí)間大鼠椎間盤髓核組織TNF-α水平比較（ng/L，x±s）

與本組喂養(yǎng)前比較，*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與模型組比較，◇P＜0.01；.與西藥組比較，☆P＜0.05。 下同

組 別 n 喂養(yǎng)前 喂養(yǎng)后 喂養(yǎng)后2周 喂養(yǎng)后4周假手術(shù)組 8模型組 8西藥組 8 4.09±0.72 4.13±0.70 4.47±0.64 4.58±0.66 10.29±0.84△ 13.04±0.34*△ 13.8±0.40*△ 14.73±0.53*△10.31±0.85△ 7.62±0.87*△◇ 9.73±0.67△◇ 11.77±0.85*△◇中藥組 810.23±0.89△ 7.73±0.93*△◇ 8.86±0.94*△◇☆ 9.23±0.93*△◇☆

2.2 各組不同時(shí)間大鼠椎間盤髓核組織IL-1β含量比較 見表2。在喂養(yǎng)前后各時(shí)間點(diǎn)，模型組、西藥組及中藥組與假手術(shù)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。喂養(yǎng)前，模型組、西藥組及中藥組互相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。喂養(yǎng)后，西藥組及中藥組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。喂養(yǎng)后，西藥組和中藥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05）。喂養(yǎng)后2周和4周，西藥組和中藥組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。假手術(shù)組喂養(yǎng)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與喂養(yǎng)前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組喂養(yǎng)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與喂養(yǎng)前比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），西藥組喂養(yǎng)后及喂養(yǎng)后4周與喂養(yǎng)前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），喂養(yǎng)后2周與喂養(yǎng)前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），中藥組喂養(yǎng)后各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)椎間盤髓核IL-1β含量呈緩慢增高趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但喂養(yǎng)后各時(shí)間點(diǎn)與喂養(yǎng)前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組不同時(shí)間大鼠椎間盤髓核組織IL-1β水平比較（ng/L，x±s）

表2 各組不同時(shí)間大鼠椎間盤髓核組織IL-1β水平比較（ng/L，x±s）

組 別 n 喂養(yǎng)前 喂養(yǎng)后 喂養(yǎng)后2周 喂養(yǎng)后4周假手術(shù)組 8模型組 8西藥組 8 2.29±0.38 2.34±0.41 2.35±0.40 2.41±0.44 7.37±0.71△ 9.73±0.55*△ 10.11±0.62*△ 12.23±0.77*△7.38±0.81△ 5.87±0.54*△◇ 7.13±0.67△◇ 8.26±0.61*△◇中藥組 87.34±0.78△ 5.85±0.52*△◇ 6.03±0.47*△◇☆ 6.57±0.61*△◇☆

3 討 論

椎間盤內(nèi)環(huán)境紊亂是誘導(dǎo)致敏神經(jīng)纖維末梢和伴行新生血管沿著纖維環(huán)裂隙長入退變椎間盤內(nèi)部而引起椎間盤退變性腰痛的基本病理機(jī)制［4-5］，雖然椎間盤退變是多因子及通路協(xié)同作用的復(fù)雜過程，但炎性因子發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)侵入椎間盤內(nèi)的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放大量炎性因子［6］，包括白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）及TNF-α等能調(diào)節(jié)椎間盤退變的啟動(dòng)和發(fā)展［7］。動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)老化和退變性椎間盤內(nèi)IL-1和TNF-α水平升高，TNF-α與椎間盤的突出和神經(jīng)激惹相關(guān)，TNF-α抑制劑是下腰痛重要的調(diào)節(jié)因子［8-9］，而IL-1的調(diào)控直接促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成下降和基質(zhì)降解增加而加速椎間盤退變［10］。Krock等研究發(fā)現(xiàn)退變椎間盤內(nèi)含有高表達(dá)的IL-1β、TNF-α、神經(jīng)生長因子（NGF）及腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）［11］。 Binch 等對(duì)術(shù)中切除的病變椎間盤和對(duì)照正常間盤內(nèi)的神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體、神經(jīng)肽及血管源性因子基因檢測后發(fā)現(xiàn)，椎間盤退變過程中細(xì)胞因子釋放尤其是IL-1β能顯著增加NGF和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，推測炎性因子可能通過刺激退變椎間盤細(xì)胞釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)遞質(zhì)的方式誘導(dǎo)致敏神經(jīng)纖維末梢及新生血管的長入以促進(jìn)椎間盤退變和腰痛發(fā)生［12］。因此，抑制椎間盤內(nèi)炎性因子的表達(dá)可能成為延緩椎間盤退變、緩解腰痛的有效方法之一［13-14］。

腰椎椎管狹窄癥、退變性腰椎滑脫癥及腰椎骨質(zhì)增生癥等椎間盤退變性疾病是中老年患者的常見多發(fā)病，共同病理基礎(chǔ)是中重度椎間盤退變及繼發(fā)生物力學(xué)變化，主要表現(xiàn)為腰腿部疼痛麻木及肢體功能障礙［15］，嚴(yán)重影響中老年日常生活，增加了醫(yī)療和社會(huì)負(fù)擔(dān)。非甾體類消炎止痛藥是目前治療椎間盤退變性疾病的常用藥，限于其消化道及心血管系統(tǒng)等不良反應(yīng)［16］，臨床應(yīng)用受到限制。身痛逐瘀湯是王清任以“瘀血致痹”理論基礎(chǔ)設(shè)立的活血化瘀法代表方劑，功用為行氣活血、祛瘀通絡(luò)、通痹止痛，多用于瘀血痹阻、經(jīng)絡(luò)失和所致的局部或周身疼痛，在脊柱退變性疾病治療上取得了滿意的臨床效果。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)身痛逐瘀湯能改善組織氧供和局部缺血、增加神經(jīng)血運(yùn)以促進(jìn)變性神經(jīng)纖維恢復(fù)及減輕結(jié)締組織形成，具有顯著抗炎止痛作用。王志福等研究發(fā)現(xiàn)身痛逐瘀湯可抑制神經(jīng)痛大鼠的痛敏反應(yīng)，改善患側(cè)后肢運(yùn)動(dòng)功能，推測可能與降低脊髓神經(jīng)炎癥反應(yīng)有關(guān)［17］。馮宇等對(duì)延遲性肌肉酸痛癥大鼠研究后發(fā)現(xiàn)身痛逐瘀湯可以降低模型大鼠骨骼肌微損傷程度并抑制炎癥因子的釋放［18］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)西藥組、中藥組與模型組比較喂養(yǎng)后各時(shí)間點(diǎn)TNF-α和IL-1β含量均明顯下降，說明西藥和中藥均有明顯抗炎作用。喂養(yǎng)后2周和喂養(yǎng)后4周，西藥組和中藥組內(nèi)TNF-α和IL-1β含量均呈緩慢增高趨勢，西藥組喂養(yǎng)后2周與喂養(yǎng)前比較TNF-α和IL-1β含量未見明顯差異，喂養(yǎng)4周與喂養(yǎng)前差異明顯，表明西藥組停止喂養(yǎng)2周后髓核內(nèi)炎癥水平已經(jīng)恢復(fù)至喂養(yǎng)前狀態(tài)，停止喂養(yǎng)后4周炎癥水平呈顯著升高趨勢，但與模型組比較髓核內(nèi)炎癥因子水平仍顯著降低，表明非甾體類消炎止痛藥僅能在一定程度上減輕退變椎間盤的炎癥狀態(tài)，短期療效滿意。中藥組在喂養(yǎng)后各時(shí)間點(diǎn)與喂養(yǎng)前比較炎癥因子表達(dá)均顯著降低，與西藥組比較停止喂養(yǎng)后2周和4周中藥組髓核炎癥因子降低更為明顯。李繼超等研究發(fā)現(xiàn)身痛逐瘀湯和非甾體類消炎止痛藥均能顯著降低膝骨性關(guān)節(jié)炎（痰瘀互結(jié)證）患者關(guān)節(jié)液和血清中IL-1β水平，但身痛逐瘀湯在改善IL-1β水平、血液流變學(xué)指標(biāo)及膝關(guān)節(jié)功能評(píng)定方面明顯優(yōu)于西藥組［19］。這與我們實(shí)驗(yàn)結(jié)論是一致的，證明身痛逐瘀湯發(fā)揮了更穩(wěn)定更持久的抗炎效果。

身痛逐瘀湯在內(nèi)環(huán)境紊亂和外部力學(xué)趨于穩(wěn)定的椎間盤退變末期明顯降低了中重度退變椎間盤髓核內(nèi)TNF-α和IL-1β的表達(dá)，表現(xiàn)出穩(wěn)定可靠的抗炎止痛作用，但具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。