逆電針少陽經(jīng)特定穴對偏頭痛大鼠50%縮足閾值及血清中CGRP、SP含量的影響*

劉秋佳 葉意紅 王乾娜 劉未艾△ 陳建宏 賀新民

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二中醫(yī)臨床學(xué)院，湖南 長沙 410005；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬衡陽醫(yī)院，湖南 衡陽 421000）

“逆針灸”是指在無病或?qū)⒉∥床≈畷r，預(yù)先應(yīng)用電針方法激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣，以增強抗病能力的針灸方法，屬于中醫(yī)治未病范疇。明·高武《針灸聚英》提出“無病而先針灸曰逆，逆，未至而迎之也”。欲病救萌，防微杜漸，“逆電針”即循用逆針灸配合電針的方法。

偏頭痛是一種反復(fù)發(fā)作的頭痛疾患，呈一側(cè)或雙側(cè)疼痛，常伴有惡心、嘔吐，少數(shù)病例發(fā)作前可伴有視覺、感覺先兆，致殘率高，疾病負擔(dān)重?！度蚣膊∝摀?dān)（GBD）研究報告》顯示，偏頭痛的全球患病率高達14.7%，是世界三大常見疾病之一，且高居世界致殘性疾病第6位［1-2］。目前臨床上的治療手段如西藥或外科手術(shù)可取得一定的療效，但不良反應(yīng)較多［3］。針刺具有良好的即時鎮(zhèn)痛和遠期效應(yīng)，在防治偏頭痛中不可或缺；近年來，國內(nèi)外的多中心、大樣本的臨床隨機對照試驗證實，針刺防治偏頭痛發(fā)作療效確切［4-5］。研究表明，偏頭痛發(fā)作時患者外周血中降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、P物質(zhì)（SP）等神經(jīng)遞質(zhì)的水平會發(fā)生不同的變化，而且這些變化可能與偏頭痛的發(fā)生、持續(xù)等有關(guān)［6-7］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)電針少陽經(jīng)特定穴可以有效改善偏頭痛癥狀及頭痛程度［8-10］。然而，逆電針治療是否可以有效預(yù)防偏頭痛的發(fā)生或緩解急性偏頭痛發(fā)作時的疼痛程度，目前尚未見相關(guān)報道。本研究通過觀察逆電針少陽經(jīng)特定穴對偏頭痛模型大鼠的50%PWT及血清中CGRP、SP含量的影響，探討預(yù)防性給予電針少陽經(jīng)特定穴對改善偏頭痛程度和促進偏頭痛癥狀恢復(fù)的作用及其可能機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄各半，月齡 3～4 月，購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，許可證編號：SCXK（湘）2013-0005。飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度50%～70%，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進行實驗。

1.2 藥劑與儀器 硝酸甘油注射液（規(guī)格5 mg/mL，批號國藥準(zhǔn)字H20057216，河南潤弘制藥有限公司）；降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）試劑盒（生產(chǎn)批號201708，武漢華美生物工程有限公司）；P物質(zhì)（SP）試劑盒（生產(chǎn)批號201708，武漢華美生物工程有限公司）；臺式高速冷凍離心機（貨號H1650R，湖南湘儀儀器有限公司）；全自動酶標(biāo)洗板機（貨號PW-812，深圳匯松科技發(fā)展有限公司）；多功能酶標(biāo)分析儀（貨號MB-530，深圳匯松科技發(fā)展有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（貨號DHP-500，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；自動平衡離心機（貨號L530，湖南湘儀儀器有限公司）；華佗牌電針儀（型號SDZ-Ⅱ，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；華佗牌針灸針（φ0.25×13 mm，生產(chǎn)批號 160230，蘇州醫(yī)療用品有限公司）；Von Frey針刺痛覺測試儀套件（型號Aesthesio，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；37450-045大型多孔金屬平臺測試架（規(guī)格90 cm×38 cm×40 cm，底部網(wǎng)孔5 mm×5 mm，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；多配置動物圍欄（型號37000-006，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.3 分組與造模 按隨機數(shù)字表法將60只大鼠隨機分為空白組（n=20）、模型組（n=20）、逆電針組（n=20），其中每組又分為造模后30 min組、造模后90 min組，每組各10只。空白組、模型組正常飼養(yǎng)并同電針組同時段捆綁30 min×7 d，逆電針組正常飼養(yǎng)并捆綁行電針治療30 min×7 d。空白組第8天皮下注射等量0.9%氯化鈉注射液，模型組、逆電針組第8天皮下注射硝酸甘油造模，實驗動物處置均符合科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》要求?？瞻捉M臀部皮下注射0.9%氯化鈉注射液10 mg/kg，其余組參照TASSORELL C等方法按10 mg/kg臀部皮下注射硝酸甘油注射劑造模［11］。模型評價：造模約10 min后，大鼠出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、撓頭、爬籠次數(shù)增多、咬尾等活動增加表現(xiàn)，出現(xiàn)以上現(xiàn)象為造模成功。50%PWT評價：使用Von Frey針刺痛覺測試儀［12］，記錄引起大鼠四肢縮足反應(yīng)顯示的刺激力，推算50%PWT，以判斷偏頭痛大鼠的疼痛程度。每組大鼠造模前后對比，如果造模后50%PWT較造模前明顯降低，則說明大鼠造模后痛閾降低，對疼痛更敏感，造模成功。電針治療方法：在捆綁下，參照新世紀(jì)全國高等中醫(yī)院校規(guī)劃教材《實驗針灸學(xué)》及華興邦的大鼠穴位圖譜［13］，以華佗牌0.25 mm×13 mm一次性無菌針灸針分別刺入大鼠的雙側(cè)“風(fēng)池”“外關(guān)”“陽陵泉”穴，進針1～6 mm之間，行平補平瀉手法，捻轉(zhuǎn)角度為180°，頻率為120次/min；持續(xù)捻轉(zhuǎn)0.5～2 min，行針結(jié)束后，電針少陽經(jīng)特定穴組選取“外關(guān)”“陽陵泉”穴，同側(cè)兩針柄分別連接電針儀導(dǎo)線的正負極，采用疏密波進行刺激，強度0.5～1.0 mA，頻率10/50 Hz，每次 30 min。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 1）血液樣品的收集與處理：50%PWT測定結(jié)束后，以20%烏拉坦4 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，予腹主動脈采血，常溫放置2～3 h，4℃3 000 r/min，離心15 min，取上清液，-20℃保存待測。2）行為學(xué)評分：通過觀察并記錄偏頭痛模型大鼠的行為癥狀進行評分，包括撓頭、爬籠、往返、咬尾等，出現(xiàn)1次計1分。治療前0～30 min第1次評分（治療前），造模后0～30 min第2次評分，造模后30～60 min第3次評分，造模后60～90 min第4次評分，造模后90～120 min第5次評分。3）50%PWT測定：參照Chapland等方法，將大鼠置于穿孔金屬平臺上，以標(biāo)準(zhǔn)動物圍欄分籠隔開，使后足底充分暴露［14］。使用Von Frey針刺痛覺測試儀，刺激大鼠同側(cè)后爪趾面的中間區(qū)域，觀察其后肢縮足反射，記錄引起大鼠縮足反應(yīng)的刺激力及陽性陰性反應(yīng)序列，通過 Up and Down 法［dixon 法］［12］推算 50%PWT。4）血清中CGRP、SP的測定：采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測大鼠血清中CGRP、SP的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，所有數(shù)據(jù)都進行正態(tài)性和方差齊性檢驗。滿足正態(tài)性時，兩組計量資料采用兩獨立樣本t檢驗（Two-sample t-test），多組計量資料采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間比較若方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時用Dunnett T3法檢驗；不滿足正態(tài)性時選擇秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學(xué)評分比較 見表1。治療前，兩組大鼠行為學(xué)評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。造模后，與空白組對比，模型組行為學(xué)評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；且與治療前對比，模型組造模后行為學(xué)評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示造模成功。模型組造模后各組對比，從造模后30～120 min行為學(xué)評分呈遞減趨勢，其中造模后0～30 min與造模后30～60 min對比、造模后60～90 min與造模后90～120 min對比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其余各組對比均有顯著差異（P＜0.01），提示大鼠具有一定的自愈性，且模型組大鼠0～60 min處于較活躍狀態(tài)，60 min后大鼠趨于安靜，分別以造模后30 min及造模后90 min 2個時間點大鼠行為學(xué)評分較穩(wěn)定。

表1 各組大鼠行為學(xué)比較（分，x±s）

表1 各組大鼠行為學(xué)比較（分，x±s）

與空白組同時間比較，**P＜0.01；與本組造模后0～30 min比較，##P＜0.01；與本組造模后 30～60 min 比較，△△P＜0.01

治療前 造模后 0～30 min 5.20±1.03 5.70±0.95 5.80±1.14 34.8±2.53**組 別 n 造模后30～60 min造模后60～90 min 造模后90～120 min空白組 10 5.1±1.45 5.50±1.08 5.4±0.84模型組 10 33.70±2.50** 27.2±3.08**##△△ 26.90±3.87**##△△

2.2 各組大鼠50%PWT比較 見表2。治療前，各組大鼠50%PWT差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。造模后，與空白組對比，模型組、逆電針組50%PWT均降低（P＜0.01），提示造模成功；與模型組對比，逆電針組50%PWT均升高（P＜0.01），提示預(yù)防性治療有效。與造模后30 min對比，模型組50%PWT造模后90 min升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示大鼠具有一定的自愈性；逆電針組50%PWT造模后90 min升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示逆電針治療可以緩解大鼠偏頭痛程度，尤以造模后90 min最為顯著。

表 2 各組大鼠 50%PWT比較（g，x±s）

表 2 各組大鼠 50%PWT比較（g，x±s）

與空白組同時間比較，**P＜0.01；與模型組同時間比較，##P＜0.01；與本組造模后30 min比較，△P＜0.05

組 別 n 造模后30 min n造模后90 min空白組 20 6.35±1.41 10 6.64±1.04治療前 n 6.46±1.36 10模型組 20 2.59±0.67** 10 3.18±0.49**△6.35±0.65 10逆電針組 20 6.58±0.86 10 3.60±0.52**## 10 4.22±0.61**##△

2.3 各組大鼠血清中CGRP、SP含量比較 見表3。與空白組比較，模型組CGRP、SP含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明造模后大鼠 CGRP、SP 含量是升高的。與模型組比較，逆電針組CGRP、SP含量呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），尤其在造模后90 min顯著降低。與造模后30 min對比，模型組CGRP、SP含量略有下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）；逆電針組CGRP、SP含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠不同時間點血清中CGRP、SP含量比較（ng/L，x±s）

表3 各組大鼠不同時間點血清中CGRP、SP含量比較（ng/L，x±s）

與空白組同時間比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組同時間比較，##P＜0.01；與本組造模后 30 min比較，△P＜0.05

組別 時間 CGRP SP空白組 造模后 30 min 13.48±0.89 54.84±3.38（n=10） 造模后 90 min 13.57±0.90 55.08±0.59模型組 造模后 30 min 19.34±1.25** 66.72±4.03**（n=10） 造模后 90 min 19.24±1.33** 65.92±2.35**逆電針組 造模后30 min 16.37±1.26**## 60.67±3.70**##（n=10） 造模后 90 min 14.74±0.94*##△ 57.30±2.04*##△

3 討 論

頭痛與六經(jīng)密切相關(guān)，《冷廬醫(yī)話·頭痛》曰“屬少陽者，上至兩角，痛在頭角”，而偏頭痛好發(fā)在側(cè)頭部，為少陽經(jīng)循行區(qū)域，與手足少陽經(jīng)密切相關(guān)，故治療的關(guān)鍵在于通利少陽經(jīng)脈氣血，針刺取穴時應(yīng)以少陽經(jīng)為主。

在偏頭痛的發(fā)病機制中，三叉神經(jīng)血管源性學(xué)說是目前解釋偏頭痛的主流學(xué)說，該學(xué)說認為偏頭痛與三叉神經(jīng)系統(tǒng)的激活有關(guān)。當(dāng)三叉神經(jīng)末梢受到有害刺激后，釋放神經(jīng)遞質(zhì)如CGRP、SP等，血管擴張、通透性增加，血漿蛋白等滲出、誘發(fā)肥大細胞釋放組胺等物質(zhì)引起神經(jīng)源性炎癥，最終導(dǎo)致頭痛的發(fā)生［15］。神經(jīng)肽，主要是降鈣素基因相關(guān)肽、P物質(zhì)的釋放及神經(jīng)源性炎癥，被認為是偏頭痛發(fā)生的病理生理學(xué)基礎(chǔ)［16］。CGRP是一種舒血管神經(jīng)肽，主要由三叉神經(jīng)傳入纖維產(chǎn)生，具有強烈的擴張血管的作用，是目前公認的偏頭痛神經(jīng)生物學(xué)標(biāo)志物［17］。有研究表明偏頭痛發(fā)作與三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)的CGRP含量變化有關(guān)［18］。SP是第一級傷害性傳入纖維末梢釋放的神經(jīng)遞質(zhì)，其直接作用于組織，可有效傳遞痛覺，引起疼痛［19］。在偏頭痛發(fā)作初始，神經(jīng)末梢大量釋放SP，血中濃度升高［20］。

通過本實驗，我們發(fā)現(xiàn)模型組大鼠50%PWT明顯降低，行為學(xué)評分及CGRP、SP含量均顯著高于空白組，與現(xiàn)有結(jié)果一致［21-22］。造模后，模型組各組對比，從造模后30～120 min行為學(xué)評分大致呈遞減趨勢，提示大鼠具有一定的自愈性，且分別以造模后30 min及造模后90 min兩個時間點行為學(xué)評分較為穩(wěn)定；造模后，逆電針組50%PWT明顯高于模型組，提示電針少陽經(jīng)穴預(yù)防性治療有效，可以一定程度上降低造模后大鼠偏頭痛的疼痛程度，其作用機制可能為減少三叉神經(jīng)末梢對CGRP、SP等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而抑制三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)的激活，減輕疼痛程度。與造模后30 min對比，模型組造模后90 min行為學(xué)評分明顯下降，50%PWT有所升高，CGRP、SP無明顯差異，提示大鼠具有一定的疼痛緩解能力，但短時間內(nèi)不能有效調(diào)節(jié)血中神經(jīng)遞質(zhì)的濃度；逆電針組造模后90 min 50%PWT較造模后30 min亦升高，且CGRP、SP含量均低于造模后30 min，提示逆電針少陽經(jīng)特定穴減輕大鼠偏頭痛不依賴于大鼠自愈能力，其可有效調(diào)節(jié)CGRP、SP的表達，抑制神經(jīng)源性炎癥，從而緩解疼痛。

綜上，逆電針少陽經(jīng)特定穴可以下調(diào)血清中CGRP、SP的表達，減輕大鼠偏頭痛，可能是通過減少三叉神經(jīng)末梢對CGRP、SP等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，抑制三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)的激活，預(yù)防性治療偏頭痛。