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    馬病毒性動脈炎病毒中和試驗的建立以及與ELISA方法的比較研究

    2013-08-24 13:16:26張海明鄭麗蘭段曉冬相文華梁卓粵彭南秀
    中國動物檢疫 2013年6期
    關鍵詞:動脈炎病毒性抗體

    張海明,鄭麗蘭,段曉冬,相文華,沈 丹,薛 紅,梁卓粵,彭南秀,程 忠,彭 聰

    (1.廣州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 廣州市動物疫病預防控制中心,廣東廣州 510440;2.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所,黑龍江哈爾濱 150001)

    馬病毒性動脈炎(equine viral arteritis,EVA)是由馬動脈炎病毒(equine arteritis virus,EAV)所引起的馬屬動物的一種接觸性傳染性病毒病[1]。該病早先發(fā)現于美國俄亥俄州,并由Doll等人從馬流產胎兒中首次分離出馬動脈炎病毒[2]。目前,馬病毒性動脈炎存在于世界各地的馬群中[3]。該病多呈亞臨床感染,也可引發(fā)不同程度的癥狀,比如發(fā)燒、精神沉郁、食欲減退、四肢以及陰囊和包皮墜性水腫、結膜炎、皮膚麻疹塊和流產等。在幼駒,雖然不多見,但可暴發(fā)肺炎或肺腸炎。除了馬駒之外,其他日齡馬感染后病死率通常都很低,感染馬幾乎毫無例外都能完全臨床康復,但很大一部分種公馬會長期帶毒,而母馬、去勢馬和性未成熟的小馬尚未發(fā)現有帶毒現象。

    馬病毒性動脈炎是我國的二類動物疫病,也是全世界各國進出口檢疫非常重視的馬屬動物疫病之一。該病的診斷方法主要有補體結合試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、間接免疫熒光試驗、瓊擴試驗、病毒中和試驗、聚合酶鏈氏反應技術和病毒分離等。其中,病毒中和試驗由于其敏感性高、特異性強等特點,被公認是馬病毒性動脈炎抗體檢測的“金標準”[4],同時也是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的馬病毒性動脈炎診斷方法。但是由于ELISA方法具有操作簡單、便于大規(guī)模篩查和靈敏度高等特點,目前已有較多ELISA方法成功建立和應用的報道[5-7]。為了解這兩種方法檢測結果的符合性,筆者建立了馬病毒性動脈炎病毒中和試驗,并與ELISA方法進行比較,以期為我國馬病毒性動脈炎檢測工作特別是廣東從化無規(guī)定馬屬動物疫病區(qū)維護工作中馬病毒性動脈炎檢測方法的選擇提供借鑒。

    1 材料

    1.1 RK-13細胞系

    兔腎細胞(RK-13細胞)系由廣東省出入境檢驗檢疫局惠贈。

    1.2 細胞培養(yǎng)用試劑

    MEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶EDTA購自美國Invitrogen公司。

    1.3 病毒和血清

    馬病毒性動脈炎病毒標準毒株(Bucyrus株)由廣東省出入境檢驗檢疫局惠贈;標準陽性血清購自美國NVSL;馬病毒性動脈炎標準陰性血清批號為372EDV0201,中等抗體效價標準陽性血清批號為370EDV1101,高抗體效價標準陽性血清批號為999-EOS-EVA;馬鼻肺炎陽性血清、馬傳染性貧血陽性血清和馬流感陽性血清由中國農科院哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈。

    馬血清來自廣東省部分地區(qū)馬場,由本實驗室采集并保存。

    1.4 豚鼠補體

    豚鼠補體購自美國Rockland公司,批號為22049。

    1.5 ELISA試劑盒

    馬病毒性動脈炎抗體ELISA商品化試劑盒為西班牙INGENASA公司產品,試劑盒批號為200612。

    2 方法

    2.1 病毒制備與病毒TCID50的測定

    取馬動脈炎病毒標準毒株1 mL接種于剛長滿單層的RK-13細胞上,37 ℃感作1 h后倒去病毒液,再加入含2%胎牛血清的MEM維持液,37 ℃培養(yǎng)30~40 h,每天進行觀察,待大部分細胞出現細胞病變(CPE)時,反復凍融3次后收集培養(yǎng)液,用Reed-Muench法進行病毒TCID50的測定。

    2.2 病毒中和試驗操作

    將待檢馬血清和標準陰陽性血清于56℃水浴中滅活1 h待用。將待檢馬血清用2%MEM維持液進行1:2和1:4稀釋后加入到滅菌V型96孔板中相應位置中,并設置好血清空白對照。于另一塊滅菌V型96孔板中設標準陽性對照,用2%MEM對馬病毒性動脈炎標準陽性血清從1:2開始進行倍比稀釋。并設立病毒對照。

    于所有除血清空白對照外的孔中加入含有10%補體的工作濃度的EAV,37 ℃細胞培養(yǎng)箱中作用1 h后,將所有液體轉移到已準備好的含有RK-13細胞的細胞板的相應位置中,每天觀察,48 h后讀取結果。

    2.3 EVA病毒中和試驗特異性試驗

    將馬病毒性動脈炎標準陰陽性血清、馬鼻肺炎陽性血清、馬傳染性貧血陽性血清、馬流感陽性血清用EVA微量血清中和試驗方法進行檢測,每個樣品設3個重復,取平均值比較結果。

    2.4 EVA病毒中和試驗重復性試驗

    對馬病毒性動脈炎標準陽性血清(高抗體效價和中抗體效價)進行三次EVA病毒中和試驗,記錄檢測得到的抗體效價。

    2.5 EVA ELISA操作

    按照試劑盒說明書進行操作,血清樣品OD值大于cut off值(陰性血清對照OD450+0.2)的判定為陽性,即樣品中存在馬病毒性動脈炎抗體;否則為陰性。

    3 結果

    3.1 EAV在接種RK-13細胞約30~40 h即出現50%~75%左右的細胞出現病變,病變以細胞大量呈團狀、拉絲狀聚集,嚴重的出現細胞破碎和脫落。

    3.2 根據Reed-Muench法對制備的EAV進行TCID50的測定,該批病毒的TCID50為10-6.5/0.1 mL。

    3.3 該中和試驗用EAV標準陰陽性血清作為對照,1:2和1:4稀釋的標準陽性血清能完全中和工作濃度的馬病毒性動脈炎病毒,而1:2和1:4稀釋的標準陰性血清不能中和該病毒。

    3.4 用馬傳貧、馬流感和馬鼻肺炎陽性血清進行交叉中和試驗,均不能中和EAV,說明本試驗方法具有較好的特異性。

    3.5 用馬病毒性動脈炎標準陽性血清(高抗體效價和中抗體效價)進行三次EVA病毒中和試驗,檢測得到的抗體效價在±1個滴度以內,說明本試驗方法具有較好的重復性。

    4 EVA病毒中和試驗的初步應用以及與ELISA方法的比較

    4.1 兩種方法的結果

    本實驗對189份馬血清分別進行了EVA病毒中和試驗和ELISA的檢測,結果在VNT檢測中,陽性數為7份,陰性數為182份;在ELISA檢測中,陽性數為16份,陰性數為173份,具體見表1。

    表 1 馬病毒性動脈炎VNT和ELISA檢測結果

    4.2 兩種方法的比較分析

    在ELISA檢測的16份陽性血清中,VNT檢測有5份陽性,陽性符合數為5份,陽性符合率為43.48%(5+5/16+7);陰性符合數為171份,陰性符合率為96.34%(171+171/173+182),總符合率為93.12%(5+171/189),具體見表2、3。

    表 2 馬病毒性動脈炎VNT和ELISA檢測結果比較

    表 3 馬病毒性動脈炎VNT和ELISA檢測結果符合率

    4.3 ELISA的敏感性與特異性

    如果將我們建立的馬病毒性動脈炎VNT作為EVA抗體檢測的“金標準”,試驗中所用ELISA的敏感性和特異性分別為71.43%和93.96%。

    5 討論

    目前,除了對馬精子進行病毒分離外,馬病毒性動脈炎的檢測主要依靠血清學方法。雖然病毒中和試驗是OIE推薦的馬病毒性動脈炎的檢測方法,但由于病毒中和試驗需要較高的實驗條件和操作能力,以及檢測結果的出具需要較長的時間,各種馬病毒性動脈炎抗體ELISA商品化試劑盒應運而生。但是在過去幾年的廣東從化無規(guī)定馬屬動物疫病區(qū)馬病監(jiān)測工作中[8],我們發(fā)現馬病毒性動脈炎ELISA的檢測結果與VNT的檢測結果存在較大的差異,因此,我們建立了適合本實驗室的馬病毒性動脈炎病毒中和試驗,并與商品化的EVA ELISA試劑盒進行比較。

    根據我們的比較結果,ELISA方法能檢出更多的陽性結果,這可能與ELISA方法本身可能產生較多的假陽性有關[9]。另外,EVA VNT檢測到的是中和抗體,而ELISA檢測到的一般情況下是非中和抗體,這也可能是兩者檢測結果不同的原因之一。而對于ELISA無法檢出部分VNT檢測陽性的血清,另一個可能的原因是,對于那些包被GP5蛋白的ELISA方法,目前已發(fā)現有部分EVA毒株編碼GP5的基因發(fā)生一定的改變而導致ELISA無法檢出這些毒株所誘發(fā)的抗體[1]。

    我們通過兩種檢測方法的比較和分析發(fā)現,馬病毒性動脈炎VNT和ELISA檢測馬血清的陰性符合率較高,而陽性符合率較低,因此,如果用ELISA作為EVA檢測的篩查甚至替代VNT進行檢測,可能會導致部分陽性血清的漏檢。另外,以我們建立的VNT作為馬病毒性動脈炎抗體檢測的“金標準”,試驗中所用的ELISA方法的敏感性和特異性分別為71.43%和93.96%,與Duthie等[5]的試驗結果一致,說明ELISA方法在檢測馬病毒性動脈炎抗體時,特異性較高,但也存在敏感性不夠的問題。

    綜上所述,我們認為在馬病毒性動脈炎抗體檢測中,不能以ELISA替代病毒中和試驗,也不能采用以抗體ELISA進行篩檢然后對陽性樣品用病毒中和試驗進行確診的方法。

    致謝:在本實驗完成過程中得到了愛爾蘭馬病中心、廣東省出入境檢驗檢疫中心、山東出入境檢驗檢疫中心等單位的大力支持和幫助,在此表示真誠的感謝。

    [1]OIE. Manual of Diagnosis Tests and Vaccines for Terrestrial Animals [M]. Paris:OIE,2008:904-918.

    [2]Jones T C,Doll E R,Bryans J T. The lesions of equine viral arteritis [J]. Cornell Vet,1956,47(1):52-68.

    [3]黃從平,梁成珠,朱來華. 馬病毒性動脈炎的研究進展[J].河南畜牧獸醫(yī),1999,20(5):25-27.

    [4]Cho H J,Entz S C,Deregt D,et al. Detection of antibodies to equine arteritis virus by a monoclonal antibody-based blocking ELISA [J]. Can J Vet Res,2000,64(l):38-43.

    [5]Duthie S,Mills H,Burr P.The efficacy of a commercial ELISA as an alternative to virus neutralisation test for the detection of antibodies to EAV [J]. Equine Vet J,2008,40(2):182-183.

    [6]梁成珠,曹瑞兵,魏建超,等. 馬動脈炎病毒GL 蛋白主要抗原域的表達及間接ELISA 的初步建立[J]. 微生物學報,2006,46(3):436-440.

    [7]彭聰,王奕青,周彩信,等. 廣州亞運無規(guī)定馬屬動物疫病區(qū)建設與探討[J]. 中國動物檢疫,2011,28(8):9-18.

    [8]彭聰,沈丹,彭南秀,等. 廣州亞運無疫區(qū)動物疫病監(jiān)測與凈化[J]. 中國動物檢疫,2012,29(7):47-52.

    [9]Cook R F,Gann S J,Mumford J A. The effects of vaccination with tissue culture-derived viral vaccines on detection of antibodies to equine arteritis virus by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA)[J]. Vet Microbiol,1989,20(2),181-189.

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