斑馬魚(yú)作為骨骼疾病模型的研究進(jìn)展

彭偉，張文娟，薛鈺,2*

(1. 閩南師范大學(xué)福建省菌類(lèi)活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，福建 漳州 363000； 2. 膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101)

斑馬魚(yú)(zebrafish)是一種源自于印度東部的淡水硬骨魚(yú)，體長(zhǎng)約3 ～ 4 cm，屬輻鰭亞綱(Actinopterygii)，鯉科(Cyprinidae)，短擔(dān)尼魚(yú)屬(Daniorerio)[1]。由于其體表具有如斑馬一樣的縱向相間條紋，因此得名斑馬魚(yú)。斑馬魚(yú)與人類(lèi)基因組相似度高達(dá)87%[2]，其組織器官發(fā)育與哺乳動(dòng)物在發(fā)育起源及過(guò)程等方面都有較高同源性。斑馬魚(yú)以其體型小巧、易于飼養(yǎng)、胚胎透明、發(fā)育周期短且繁殖能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)被作為重要的脊椎動(dòng)物模型進(jìn)行科學(xué)研究。目前，基因編輯、轉(zhuǎn)基因、遺傳誘導(dǎo)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)已成功在斑馬魚(yú)模型中得以應(yīng)用，學(xué)者們通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)手段發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千計(jì)的基因，并且證明了其基因功能。這些研究發(fā)現(xiàn)使得斑馬魚(yú)不僅在生物學(xué)，在臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)及心理學(xué)領(lǐng)域都得以廣泛應(yīng)用[3]。

1 斑馬魚(yú)的骨骼發(fā)育

斑馬魚(yú)的骨骼發(fā)育與其他脊椎動(dòng)物骨骼發(fā)育過(guò)程極其相似，骨骼都是由軟骨和硬骨兩種不同的組織所組成，是由三種不同的胚胎細(xì)胞系分化而來(lái)。顱面骨骼由顱神經(jīng)嵴細(xì)胞分化形成，中軸骨骼從中軸中胚層(體節(jié))衍生而來(lái)，四肢骨骼則是側(cè)板中胚層細(xì)胞的產(chǎn)物[4]。軟骨由軟骨細(xì)胞形成，硬骨由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞組成。軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞具有共同的起源，即間充質(zhì)細(xì)胞，而破骨細(xì)胞則起源于髓單核細(xì)胞系[5]。

間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchymal cells)在特定的骨化部位聚集是骨骼發(fā)育起始的標(biāo)志，這一現(xiàn)象被稱(chēng)為骨骼的形態(tài)發(fā)生(skeletal morphogenesis)，骨骼發(fā)育的命運(yùn)由其決定。當(dāng)滿(mǎn)足骨骼發(fā)育所需條件時(shí)，聚集的間充質(zhì)細(xì)胞由于骨化作用而成為骨骼。膜內(nèi)骨化(intramembranous ossification)和軟骨內(nèi)骨化(endochondral ossification)是脊椎動(dòng)物成骨的兩種方式。膜內(nèi)骨化的代表是顱骨的形成，其成骨細(xì)胞由間充質(zhì)細(xì)胞直接分化而成，并形成骨骼；軟骨內(nèi)骨化成骨必須先形成軟骨模板，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞隨后會(huì)將其替代而成熟[6]。

注：A：腹面觀(guān)；B：側(cè)面觀(guān)。(bh)舌骨體；(ch)角舌骨；(co)對(duì)肩胛骨喙突；(cb)角鰓骨；(c)匙骨；(e)篩骨板；(hs)舌骨下頜弓；(m)麥克爾軟骨；(oa)枕弓；(pp)腭方蝶突骨；(pq)腭方骨。圖1 斑馬魚(yú)頭部骨骼結(jié)構(gòu)Note. A, Ventral view. B, Lateral view. (bh) basihyal. (ch) ceratohyal. (co) coracoids of pectoral girdle. (cb) ceratobranchial. (c) cleithrum. (e) ethmoid plate. (hs) hyosymplectic. (m) Meckel’s cartilage. (oa) occipital arch. (pp) pterygoid process of the palatoquadrate. (pq) palatoquadrate.Figure 1 Structure of the zebrafish head bone

1.1 斑馬魚(yú)的頭骨發(fā)育

斑馬魚(yú)與多數(shù)高等脊椎動(dòng)物一樣，也存在軟骨內(nèi)骨化和膜內(nèi)骨化兩種骨化方式[7]。其中，斑馬魚(yú)大部分的頭部骨骼是由軟骨內(nèi)骨化發(fā)育產(chǎn)生。斑馬魚(yú)頭部的骨骼結(jié)構(gòu)如圖1所示，一般5d的幼魚(yú)頭部骨骼(腦顱)由軟骨、腦顱、咽骨架構(gòu)成，圍繞著感覺(jué)器官；大腦則是由篩骨板塊(e)、骨小梁(t)、附脊索(pc)和枕拱門(mén)(oa)組成(圖1)。咽骨架是由下頜和鰓連接的咽拱門(mén)等組成。第一個(gè)咽弓(下頜弓)來(lái)自于下頜，由兩個(gè)元素組成，腭方骨(pq)代表上頜，麥克爾軟骨(m)形成下頜(圖1)。第二個(gè)(舌)弓是由舌骨下頜弓(hs)和角舌骨(ch)組成，角舌骨(ceratohyal)不是直接與舌骨下頜弓連接的，而是與莖舌骨(ih)直接連接起來(lái)。鰓連接的拱門(mén)是由角鰓骨(cb)和鰓下骨組成(圖1B)。鰓下骨位于角鰓骨的中間，連接腹側(cè)中線(xiàn)的基鰓軟骨(圖1B)。頭部骨骼骨化的一般順序?yàn)?角鰓骨(cb)，孔蓋(op)，副蝶骨(ps)，鰓條骨(br)，脊索(nc)，其中孔蓋骨骨化開(kāi)始于受精后第3天的未來(lái)球窩附近的間充質(zhì)和舌頜軟骨銜接處，副蝶骨從第4天開(kāi)始骨化[8-9]。頭蓋骨通過(guò)膜內(nèi)骨化的方式進(jìn)行鈣化，雖然頭部骨骼會(huì)大面積的形成，但是軟骨在軟骨內(nèi)骨化的作用下發(fā)育成骨骼這一過(guò)程，要一直延續(xù)到斑馬魚(yú)的成年階段，成年斑馬魚(yú)的頭蓋骨由74塊顱骨組成，至少需要70 d才能發(fā)育完成[10-11]。

1.2 斑馬魚(yú)的脊柱及魚(yú)鰭的發(fā)育

斑馬魚(yú)的脊椎骨骼是通過(guò)軟骨內(nèi)骨化的方式形成，即脊椎內(nèi)的骨骼先形成軟骨，隨后再發(fā)生骨化，此發(fā)育過(guò)程也是按照從頭到尾的順序分體節(jié)形成的[12]。斑馬魚(yú)的脊椎骨分為尾椎和尾前椎，其脊椎是由很多的椎間盤(pán)和椎體組成，每一節(jié)脊椎骨都呈兩凹型， 其結(jié)構(gòu)又可細(xì)分為脊椎、神經(jīng)弧和血管弧。斑馬魚(yú)的脊椎是由位于中間體節(jié)的韋伯爾發(fā)生器起始發(fā)生，然后骨化的范圍分別向頭部和尾部?jī)蓚€(gè)方向延伸。最初的脊椎在7 d形成，是在脊索之上，作為礦物質(zhì)的沉淀而存在，開(kāi)始于背部的區(qū)域并且向腹部延伸。最早形成的是第3、4、5、6 脊錐，之后是第1、2脊椎，到了第23天，所有脊椎形成。除了最后端形成urostile的脊椎，所有結(jié)構(gòu)均已鈣化。斑馬魚(yú)的鰭由背鰭、腹鰭、胸鰭、臀鰭和尾鰭組成。當(dāng)斑馬魚(yú)發(fā)育到第19 天時(shí)，其尾翼已形成所有的輻射條、尾下骨、軟骨尾上骨。背翼和肛翼也已形成并礦化，然而，胸鰭的骨翼形成剛剛開(kāi)始[11-13]。斑馬魚(yú)與爬行動(dòng)物的軟骨內(nèi)骨化方式不同, 最為明顯的區(qū)別是其鱗質(zhì)鰭條的發(fā)育不經(jīng)過(guò)軟骨細(xì)胞而是由膠原基質(zhì)直接礦化而成。由于斑馬魚(yú)具有魚(yú)鰭透明，生長(zhǎng)具有時(shí)空的連續(xù)性和方向性，通過(guò)控溫可減慢生物礦化速度等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，且魚(yú)鰭發(fā)育的分子機(jī)制與哺乳動(dòng)物骨骼極為相似，調(diào)控發(fā)育的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子如包括骨形成蛋白在內(nèi)的TGFβ家族起到關(guān)鍵作用。越來(lái)越多的學(xué)者更偏好于利用魚(yú)鰭尤其是尾鰭再生作為骨骼損傷修復(fù)模型進(jìn)行科學(xué)研究。

2 斑馬魚(yú)骨骼發(fā)育的分子機(jī)制

脊椎動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中骨骼發(fā)育機(jī)制高度保守，斑馬魚(yú)骨骼發(fā)育同樣起始于間充質(zhì)細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞之后，成骨細(xì)胞在形成骨骼過(guò)程中需經(jīng)歷增殖、成熟、礦化和凋亡四個(gè)階段。在整個(gè)骨骼發(fā)育過(guò)程中，涉及眾多的調(diào)控因子包括轉(zhuǎn)錄因子、激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞基質(zhì)因子等的參與，此外還受到一系列細(xì)胞信號(hào)通路的精密調(diào)控[14]。一些眾所周知的調(diào)控哺乳動(dòng)物成骨細(xì)胞分化的相關(guān)基因家族，如：Hedgehog、Runx和Dlx基因家族的成員在斑馬魚(yú)骨形成過(guò)程中也表達(dá)[15-19]。在斑馬魚(yú)成骨細(xì)胞形成分化的早期，Rux2a和Runx2b在分化的最早期表達(dá)，Osx在分化中期表達(dá)，成熟階段分化主要通過(guò)骨基質(zhì)蛋白ColI1a和骨結(jié)合素(osn，osteonectin)的表達(dá)，BMP和Wnt信號(hào)在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中像在哺乳動(dòng)物中一樣也發(fā)揮作用。

研究表明，Sox9家族參與了骨骼發(fā)育調(diào)控，斑馬魚(yú)中有Sox9a和Sox9b，在胚胎的發(fā)育過(guò)程中，它們都在軟骨形成區(qū)域表達(dá)，Sox9在硬骨魚(yú)和四足軟骨形成過(guò)程中的功能是保守的。Sox9基因的上游序列位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)軟骨形成異常而導(dǎo)致短指等骨骼發(fā)育異常的癥狀。Sox9早于間葉細(xì)胞進(jìn)行凝聚，軟骨細(xì)胞發(fā)生分化時(shí)表達(dá)，并能夠直接調(diào)控Col2ala，Colla2等對(duì)軟骨形成有關(guān)鍵作用的膠原蛋白的形成，因此其在軟骨分化的啟動(dòng)階段發(fā)揮重要的作用。有研究證明，Sox9與骨形成發(fā)生蛋白(BMP)相互作用，調(diào)控軟骨的形成過(guò)程[20-21]。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Osterix(Osx)是哺乳動(dòng)物骨髓充質(zhì)祖細(xì)胞系的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在硬骨魚(yú)中，膜內(nèi)骨化和軟骨成骨之前Osx開(kāi)始表達(dá)，Osx在成骨細(xì)胞中表達(dá)而不是軟骨細(xì)胞，作為成骨細(xì)胞分化程度的一個(gè)重要標(biāo)志[22-23]。斑馬魚(yú)擁有硬骨魚(yú)家族的8個(gè)Dlx基因，其在斑馬魚(yú)頭部骨骼發(fā)育中有著重要作用，在頭部的副蝶骨，鰓弓及孔蓋等部位有表達(dá)[24-25]。Runx2是成骨細(xì)胞和肥大的軟骨細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在軟骨發(fā)育早期，調(diào)控骨基質(zhì)相關(guān)基因如Col10a1的表達(dá)，Runx2過(guò)量表達(dá)會(huì)影響成骨細(xì)胞成熟并導(dǎo)致骨質(zhì)減少，因此，在骨細(xì)胞分化過(guò)程中起著負(fù)調(diào)控作用[26]。

Hedgehog信號(hào)調(diào)控細(xì)胞分化，增殖和細(xì)胞壽命，其在骨骼形成過(guò)程中的作用是保守的，促進(jìn)骨膜前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。Shh是Hedgehog家族成員，有研究顯示，Shh在斑馬魚(yú)神經(jīng)嵴細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中誘導(dǎo)中線(xiàn)上的前體細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞[9]，Hedgehog信號(hào)通路在鰓蓋早期形成的過(guò)程中調(diào)節(jié)骨形成[20]。Wnt信號(hào)在成骨細(xì)胞分化中起著重要作用，可以阻止成骨細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。有研究表明，Wnt信號(hào)與BMP信號(hào)相互作用共同調(diào)控斑馬魚(yú)背部腹鰭和顱面骨的發(fā)育[27]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGFβ是多功能轉(zhuǎn)化因子，由許多骨骼中的細(xì)胞產(chǎn)生，大量存在于骨基質(zhì)中，TGFβ調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的吸收活性及破骨細(xì)胞的形成。

3 斑馬魚(yú)骨骼的經(jīng)典染色方法

斑馬魚(yú)作為骨骼研究的模式動(dòng)物已被廣泛的應(yīng)用在骨骼領(lǐng)域，目前對(duì)研究斑馬魚(yú)骨骼模型的方法有經(jīng)典的骨骼染色和醫(yī)學(xué)上的影像學(xué)檢測(cè)等。經(jīng)典的骨骼染色法有：組織固定染色，活體熒光染色，其中活體熒光染色主要用于斑馬魚(yú)幼魚(yú)的骨骼鈣化及成魚(yú)的尾鰭再生研究，而顯微CT及雙能X光吸收法常用于成魚(yú)的骨骼結(jié)構(gòu)、骨密度分析中，以下就這些研究方法及其優(yōu)缺點(diǎn)做一概述：經(jīng)典的骨骼染色方法有茜素紅染色(alizarin red)，阿爾新藍(lán)染色(alcian blue)，鈣黃綠素染色(calcein)等方法，詳情可見(jiàn)參考文獻(xiàn)[28]；其中alizarin red是針對(duì)斑馬魚(yú)的硬骨染色，其原理是利用骨骼中豐富的鈣鹽成分和茜素紅可螯合骨骼中鈣離子的特點(diǎn)，從而可通過(guò)茜素紅與骨中的鈣結(jié)節(jié)引起的明顯顯色現(xiàn)象來(lái)檢測(cè)魚(yú)的骨形態(tài)和骨密度[7]。alcian blue是專(zhuān)用于對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行染色的染料，利用此染色手段可檢測(cè)胚胎的骨骼形成和軟骨的發(fā)育情況，是發(fā)育生物學(xué)研究中常用的一種方法[29]。calcein是利用化合物與骨骼中的鈣化離子結(jié)合在熒光的照射下發(fā)出綠色熒光，以標(biāo)示骨骼鈣化程度[30]。alizarin red在實(shí)驗(yàn)過(guò)程的前期要經(jīng)過(guò)固定、脫色和脫水處理，實(shí)驗(yàn)步驟較多，耗時(shí)較長(zhǎng)。alcian blue在實(shí)驗(yàn)過(guò)程的后期也同樣要經(jīng)過(guò)一系列程序，消化-脫色-漂白等，過(guò)程繁瑣，且每一步都要掌握好時(shí)間，防止消化、漂白時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使實(shí)驗(yàn)樣品損壞。calcein在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，染色時(shí)間短且反應(yīng)靈敏，但染色過(guò)程一定要避光處理，后期要用大量的清水將染色液清洗干凈，防止對(duì)熒光信號(hào)產(chǎn)生影響。顯微CT及雙能X線(xiàn)吸收法用于成魚(yú)的骨骼結(jié)構(gòu)，及骨密度分析中，能夠更精準(zhǔn)的評(píng)價(jià)骨的質(zhì)量，更適用骨質(zhì)疏松癥的早期檢測(cè)。此外，堿性磷酸酶(ALP)染色與抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色可以分別用來(lái)鑒定斑馬魚(yú)的成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞[31]，堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞早期分化的特征指標(biāo)，成纖維細(xì)胞極少有ALP，因此可采用ALP染色來(lái)鑒定成骨細(xì)胞；特異的TRAP染色酶活性部位呈紅色陽(yáng)性顆粒，分布于破骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，核為陰性。

4 斑馬魚(yú)模型在骨骼藥物篩選中的應(yīng)用

利用斑馬魚(yú)作為骨骼模型進(jìn)行骨骼疾病研究時(shí)，首先需要構(gòu)建斑馬魚(yú)骨骼損傷疾病癥狀，如骨質(zhì)疏松癥。有多種類(lèi)型的藥物可誘導(dǎo)構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型，常用的藥物有糖皮質(zhì)激素類(lèi)，如：潑尼松龍，地塞米松；還有藥物如維甲酸，枸櫞酸鐵胺(FAC)等多種藥物，還可以對(duì)斑馬魚(yú)的魚(yú)鰭進(jìn)行機(jī)械性損傷，來(lái)模擬人類(lèi)的骨骼創(chuàng)傷，如：骨折。另外，斑馬魚(yú)的尾鰭再生能力也為骨骼研究帶來(lái)新的方向，本文對(duì)利用藥物脅迫斑馬魚(yú)構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥的研究進(jìn)行總結(jié)和分析。

韋英杰等[32]通過(guò)潑尼松龍構(gòu)建的骨丟失模型對(duì)接骨湯促進(jìn)骨生成的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)；李淼等[33]利用斑馬魚(yú)模型來(lái)評(píng)價(jià)地塞米松磷酸鈉的毒性及其對(duì)斑馬魚(yú)骨骼的影響；陳斌等利用高鐵脅迫誘導(dǎo)斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松癥；此外，還可以通過(guò)控制營(yíng)養(yǎng)的攝取等方法來(lái)構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型[34-38]。就上述各種方法構(gòu)建的模型而言，評(píng)價(jià)指標(biāo)一般是一致的，有骨密度的測(cè)定，骨形態(tài)的計(jì)量學(xué)等。潑尼松龍和地塞米松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥更接近與人類(lèi)長(zhǎng)期或者在年輕時(shí)期長(zhǎng)時(shí)間使用激素來(lái)治療疾病時(shí)，后期就會(huì)引發(fā)無(wú)菌性股骨頭壞死，但在使用糖皮質(zhì)激素造模時(shí)應(yīng)把握好劑量，合適的劑量既可以有效引起骨量丟失，又不會(huì)因免疫抑制過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致斑馬魚(yú)死亡。而FAC所誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥更接近與在過(guò)度失血的情況下補(bǔ)血過(guò)盛，導(dǎo)致鐵過(guò)載的病人，F(xiàn)AC藥物在使用時(shí)，要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)有沉淀產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)死亡。

上述藥物誘導(dǎo)的模型已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于篩選治療骨質(zhì)疏松的藥物，王長(zhǎng)梅等[39]以潑尼松龍誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨質(zhì)疏松模型考察川續(xù)斷皂苷V和川續(xù)斷皂苷VI抗骨質(zhì)疏松活性；韋英杰等[40]以地塞米松誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨質(zhì)疏松模型對(duì)西藥依替膦酸二鈉的抗骨質(zhì)疏松活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，王晗課題組以FAC引發(fā)的骨質(zhì)疏松癥去評(píng)價(jià)去鐵胺對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療作用。前期本課題組的研究結(jié)果也表明，在高鐵環(huán)境下能成功構(gòu)建斑馬魚(yú)成魚(yú)骨質(zhì)疏松模型，并證實(shí)了臨床藥物阿侖膦酸鈉通過(guò)Bmp信號(hào)修復(fù)骨骼的損傷[41]。由上述的報(bào)道可知，藥物誘導(dǎo)斑馬魚(yú)的骨質(zhì)疏松癥模型已成功應(yīng)用于藥物篩選中。

5 結(jié)語(yǔ)

目前，斑馬魚(yú)以其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，成為日益受重視的一種模式生物，尤其在藥物的高通量篩選中的應(yīng)用。隨著斑馬魚(yú)骨骼發(fā)育機(jī)理的不斷探索，斑馬魚(yú)骨骼研究相關(guān)方法和技術(shù)日益完善，進(jìn)一步促使斑馬魚(yú)作為骨骼疾病模型被研究者所使用。斑馬魚(yú)骨骼模型能高效、快速、低成本、高通量的對(duì)治療骨骼疾病相關(guān)藥物進(jìn)行篩選，并且結(jié)果可信度高。雖然斑馬魚(yú)作為新興的模式生物，還有許多發(fā)育和遺傳機(jī)理尚未研究透徹，但對(duì)于研究骨骼發(fā)育和其相關(guān)疾病，斑馬魚(yú)骨骼模型是研究者的優(yōu)選之一，斑馬魚(yú)骨骼模型具有廣闊的科研和商業(yè)前景。