二苯乙烯苷抑制NADPH氧化酶對小鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用

薛威，唐虹，孫雨倩，江勤，黃大可，董六一*

(1. 安徽醫(yī)科大學藥理學教研室 抗炎免疫藥理學教育部重點實驗室 國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級實驗室； 2. 安徽醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院； 3. 安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，合肥 230032)

腦卒中是具有高發(fā)病率和死亡率的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，嚴重威脅人類健康，80%的腦卒中是缺血性的[1-2]。腦缺血后，再灌注會進一步加重腦組織損傷，據(jù)報道，缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)損傷的一個關鍵機制是氧化應激[3-4]。氧化應激的主要原因是ROS的積累，過度的ROS誘導細胞膜和線粒體膜的損傷，以及DNA的降解，最終促使細胞凋亡[5]。NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)是腦I/R損傷中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的主要來源。中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達的NOX有 NOX1、NOX2、NOX4，而NOX4在腦I/R損傷中扮演著最為重要的角色[6]。參與氧化應激的主要ROS包括超氧陰離子、過氧化氫和羥基自由基，而NOX4主要產(chǎn)生過氧化氫[7]。因此，降低NOX4的水平對于腦I/R損傷具有很大的治療意義。

二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glucoside，TSG)是中藥何首烏中特有的具有顯著藥理活性的水溶性有效成分，研究表明其具有抑制粥樣硬化、防治老年性癡呆、抗腫瘤、保護腦組織等多種功能[8-10]。吳曉玲等[11]研究發(fā)現(xiàn)：TSG可以提高大鼠體內(nèi)SOD含量和降低MDA含量減輕腦組織氧化應激損傷。梅勁春等[12]發(fā)現(xiàn)：用TSG治療大鼠糖尿病腎病后，氧化應激指標ROS及MDA水平降低，SOD水平升高，腎間質(zhì)纖維化減輕。這些研究結果提示，TSG可清除氧自由基，可有效對抗氧化應激損傷，具體的作用機制有待進一步闡明。本研究主要探討TSG是否通過抑制NOX4的活性從而減輕小鼠腦I/R后的氧化應激損傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

5周齡SPF級雄性KM小鼠，體重22 ～ 24 g，購于安徽醫(yī)科大學省級實驗動物中心【SCXK(皖)2011-002】，飼養(yǎng)與實驗均在安徽醫(yī)科大學實驗動物中心屏障環(huán)境中進行【SYXK(皖)2011-007】，并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。溫度范圍22 ± 3℃，濕度范圍：40% ～ 70%，照明周期：12 h明/12 h暗，自由攝水進食。

1.1.2 藥品與試劑

二苯乙烯苷(純度：98%，批號：20170502，南京道斯夫生物科技有限公司，中國)，水合氯醛(批號：T20150610，國藥集團化學試劑有限公司，中國)，0.9%氯化鈉注射液(批號：170705074，上海華源制藥股份有限公司，中國)，RIPA蛋白裂解液(Beyotime Institute of Biotechnology，中國)，PMSF(Sigma公司，美國)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime Institute of Biotechnology，中國)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(Beyotime Institute of Biotechnology，中國)，預染蛋白marker(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，兔來源NOX4一抗、兔來源cleaved caspase-3/9 一抗、內(nèi)參β-actin(CST公司，美國)，辣根酶標記山羊抗小鼠lgG二抗和山羊抗兔lgG二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司，中國)，SuperSignal West Femto高靈敏度發(fā)光試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司，美國)。

1.1.3 儀器設備

超低溫冰箱(Sanyo Electric CO. Ltd，日本)，TGL-16H高速離心機(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司產(chǎn)品，中國)，DIAX-900內(nèi)切式組織勻漿機(Heidolph公司，德國)，TE300 型倒置顯微鏡(Nikon 公司，日本)，SpectraMax190酶標儀(Molecular Devices，USA)，石蠟切片機(Leica，德國)，WD-9405B水平搖床(北京市六一儀器廠，中國)，Bioshine ChemiQ4600熒光及化學發(fā)光成像系統(tǒng)(上海歐翔科學儀器公司，中國)，JES-FA20000 spectrometer(JEOL)型ESR波譜儀(日本電子，日本)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性腦缺血再灌注損傷模型建立

將100只實驗小鼠隨機分成5組：假手術組、模型組、二苯乙烯苷劑量組(3、6、12 mg/kg)，每組20只，給藥體積為0.01 mL/g。適應性喂養(yǎng)5 d后，進行手術造模。所有小鼠術前禁食不禁水12 h。小鼠放入麻醉箱中給予1.33%(一個肺泡濃度)的異氟烷麻醉15 min后固定，分離雙側頸總動脈，并穿以6號線。在結扎之前將給藥組小鼠通過尾靜脈注射TSG一次，隨即結扎雙側頸總動脈30 min后再經(jīng)尾靜脈注射給藥一次，結扎2 h后，松開絲線進行再灌，24 h后處死小鼠。假手術組僅做頸動脈分離，不做結扎處理，且假手術組和模型組僅給予等量的生理鹽水。

1.2.2 病理組織學檢查

小鼠腦缺血再灌注后，處死取腦，每組取4個小鼠腦組織置于4%多聚甲醛中固定。經(jīng)石蠟包埋制成切片，進行蘇木精-伊紅(HE)染色，BX-51型正置顯微鏡觀察小鼠腦組織病理變化。

1.2.3 腦組織氧自由基檢測

小鼠造模成功后，頸椎脫臼處死，取出大腦(去除小腦和腦干，每組8個小鼠大腦)，迅速將缺血區(qū)腦組織裝入內(nèi)徑2 mm的薄壁聚乙烯塑料管中，并迅速放入液氮中待測。將JES-FA20000 spectrometer(JEOL)型ESR波譜儀諧振腔溫度調(diào)整到130 K，從液氮中取出腦組織標本迅速放入ESR諧振腔內(nèi)，測試ESR波譜，利用專用軟件分析氧自由基信號情況。

1.2.4 DHE染色法檢測腦組織中ROS水平

實驗開始前，將-20℃保存的染色液(reagent B)放入冰槽里融化，稀釋液(reagent C)置于室溫預熱。移出10 μL染色液(reagent B)到新的1.5 mL離心管，加入990 μL稀釋液(reagent C)，混勻后，配成染色工作液，避光待用。小鼠缺血再灌注后，斷頭取腦(每組4個小鼠大腦)，用冰凍切片機切制成10 μm的冰凍切片，小心加上500 μL預冷的清理液(reagent A)，鋪滿整個切片表面。移去切片上的清理液(reagent A)后，加上200 μL室溫預熱的染色工作液，在37℃濕潤培養(yǎng)箱里，孵育20 min。避光除去染色工作液后，在整個切片表面加上500 μL清理液(reagent A)，除去切片上的清理液(reagent A)后封片，即刻在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達水平

采用 Western blot分別檢測小鼠缺血側大腦皮層組織中NOX4通路相關蛋白和caspase-3/9 蛋白表達的變化(每組4個小鼠大腦)。利用Bioshine ChemiQ 4600熒光及化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯影后，使用Image J分析軟件計算蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計與分析

2 結果

2.1 TSG對小鼠腦I/R損傷后腦組織病理學變化的影響

在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)(圖1)，假手術組小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞排列整齊，形態(tài)正常且細胞數(shù)較多。模型組小鼠腦皮層神經(jīng)元細胞數(shù)量減少，疏松呈網(wǎng)狀(黃色箭頭所示)，胞核深染(紅色箭頭所示)等病理性改變。TSG高、中劑量治療組能夠明顯減輕小鼠腦皮層神經(jīng)元的病理性損傷，增加神經(jīng)元細胞數(shù)量，改善神經(jīng)元細胞形態(tài)，減輕核固縮。TSG低劑量組神經(jīng)元的病理性損傷未得到明顯改善。

2.2 TSG對小鼠腦I/R損傷后腦組織中氧自由基代謝的影響

結果見表1，與假手術組相比，模型組小鼠腦組織中氧自由基生成明顯增加，其氧自由基信號值與假手術組比較呈顯著性差異(P< 0.01)；與模型組比較，TSG 12.0、6.0、3.0 mg/kg 可顯著抑制小鼠腦組織氧自由基生成，其氧自由基信號值顯著下降(P< 0.01或P< 0.05)。

注：A.假手術組；B.I/R組；C.TSG(12.0 mg/kg)組；D.TSG(6.0 mg/kg)組；E.TSG(3.0 mg/kg)組。圖1 TSG對小鼠腦I/R損傷后大腦皮層腦組織病理學損傷的影響(×200)Note. A: Sham group. B: I/R group. C: TSG(12.0 mg/kg)group. D: TSG(6.0 mg/kg)group. E: TSG(3.0 mg/kg)group.Figure 1 Effects of TSG on pathological damages in brain tissues after I/R injury in the mice(×200)

表1 二苯乙烯苷對小鼠腦I/R損傷后腦組織氧自由基代謝的影響Table 1 Effects of TSG on metabolism of oxygen free radicals in brain tissue after cerebral I/R injury in the

注：##P< 0.01 vs假手術組；*P< 0.05，**P< 0.01 vs模型組(I/R)。

Note.##P<0.01, vs the sham group.*P< 0.05，**P< 0.01, vs the model (I/R) group.

2.3 TSG對小鼠腦I/R損傷后腦組織中ROS水平的影響

DHE 染色結果顯示，小鼠腦缺血再灌注后，與假手術組相比，模型組小鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)ROS水平顯著增加， TSG (12.0、6.0、3.0 mg/kg) 劑量組小鼠腦皮質(zhì)缺血區(qū)ROS水平較模型組顯著降低。提示TSG 可抑制缺血再灌注損傷小鼠大腦皮質(zhì)ROS的生成。(見圖2)

2.4 TSG對小鼠腦I/R損傷后腦組織中NOX4蛋白表達的影響

小鼠腦缺血再灌注24 h后與假手術組相比，模型組小鼠大腦皮層缺血區(qū)NOX4蛋白表達顯著上調(diào)(P< 0.01)，TSG 12.0 mg/kg和6.0 mg/kg 可顯著抑制小鼠大腦皮層缺血區(qū)NOX4蛋白的表達，減輕小鼠腦缺血再灌注引起的氧化應激損傷。結果提示TSG可抑制缺血再灌注損傷小鼠缺血區(qū)大腦皮質(zhì)NOX4蛋白表達的增高。(見圖3)

注： ##P < 0.01 vs假手術組；*P <0.05，**P < 0.01 vs模型組(I/R)。圖3 TSG對小鼠腦I/R損傷后腦組織中NOX4蛋白表達的影響Note. ##P < 0.01 vs the sham group. *P < 0.05，**P <0.01 vs the model (I/R) group.Figure 3 Effects of TSG on the expression of NOX4 protein in brain tissue after I/R injury in the mice

2.5 TSG對小鼠腦I/R損傷后腦組織中凋亡相關蛋白表達的影響

小鼠腦缺血再灌注24 h后，與假手術組相比，模型組小鼠缺血區(qū)皮層組織凋亡相關蛋白caspase-3/9活化增加，剪切后的caspase-3/9蛋白表達顯著增多(P< 0.01)，TSG 12.0 mg/kg可顯著抑制小鼠缺血區(qū)皮層組織凋亡蛋白caspase-3/9的活化，從而抑制神經(jīng)元細胞的凋亡。(見圖4)

3 討論

二苯乙烯苷(TSG)化學名為2，3，5，4-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，其結構與白藜蘆醇相似，僅二位多一個酚羥基并形成了糖苷，均屬于二苯乙烯類[13]。在心腦血管方面，Liu等[14]發(fā)現(xiàn)TSG的酚羥基通過給出氫原子，自身形成二聚體，從而清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基，進而發(fā)揮抗氧化作用。此外，TSG可以抑制腦I/R所導致的NMDA受體結合力及神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，具有腦保護作用。

大量研究表明，腦缺血后再灌注會進一步加重腦組織損傷，抑制再灌注損傷是治療缺血性腦血管疾病的重要環(huán)節(jié)[15-16]。盡管缺血性損傷的病理生理學是復雜且多因素的，但廣泛的研究表明氧化應激在I/R損傷中起著重要作用。本研究采用小鼠雙側頸動脈結扎模型觀察TSG對腦I/R損傷的作用，結果顯示，TSG可以減輕腦I/R造成的腦組織病理性損傷，同時可減少腦組織中氧自由基含量，提示TSG對小鼠腦I/R損傷有保護作用。

注： ##P <0.01 vs假手術組；*P < 0.05，**P < 0.01 vs模型組(I/R)。圖4 TSG對小鼠腦I/R損傷后腦組織中cleaved caspase-3/9蛋白表達的影響Note.##P< 0.01 vs the sham group. *P < 0.05，**P < 0.01 vs the model (I/R) group.Figure 4 Effects of TSG on the expressions of cleaved caspase-3/9 proteins in brain tissues after I/R injury in the mice

腦缺血再灌注會引發(fā)一系列病理損傷，如興奮性毒性，炎癥反應和氧化應激，最終導致不可逆的神經(jīng)元損傷[17]，在這些病理事件中，氧化應激已經(jīng)成為治療腦血管疾病的主要挑戰(zhàn)[18]。大腦中ROS生成涉及許多生物過程，主要來源包括線粒體呼吸鏈，黃嘌呤氧化酶和環(huán)氧合酶，最近的研究表明，NOX也是重要的ROS生產(chǎn)者。Serrano等[19]研究發(fā)現(xiàn)：NOX表達和活性在缺血性中風后的神經(jīng)組織中升高。Qin 等[20]最近研究發(fā)現(xiàn)：NOX抑制劑可減少缺血區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡、縮小梗塞面積、減輕相應區(qū)域功能損傷。本研究結果顯示，小鼠腦I/R后缺血區(qū)NOX4蛋白表達顯著上調(diào)，TSG可顯著抑制小鼠大腦皮層缺血區(qū)NOX4蛋白的表達，減輕小鼠腦I/R引起的氧化應激損傷。上述研究結果均提示了NOX在腦I/R的發(fā)病機制中起關鍵作用，抑制NOX活性可能是減輕腦I/R的有效途徑。

Caspase 蛋白家族是細胞凋亡的重要參與者, 其中caspase-9是線粒體內(nèi)源性凋亡途徑的啟動者，而caspase-3是凋亡的最終執(zhí)行者[21]。Caspases-9的活性增高并自我剪切形成cleaved caspase-9，激活下游的caspase-3。凋亡早期caspase-3活化為cleaved caspase-3，裂解相應胞質(zhì)胞核底物，切割核小體間的DNA，從而誘導細胞凋亡[22]。本研究結果表明，TSG可以顯著抑制小鼠腦I/R引起的cleaved caspase-3/9 過度表達，其作用機制可能是下調(diào)了NOX4蛋白的表達，抑制ROS爆發(fā)性生成，從而抑制線粒體膜通透性轉換孔(mPTP)開放和線粒體膜電位(MMP)降低，避免線粒體釋放細胞色素C等凋亡因子到胞質(zhì)激活Caspase系列蛋白。

總之，NOX4是腦I/R損傷中ROS的主要來源，下調(diào)NOX4可能是預防氧化應激損傷的有效途徑。本研究結果顯示，TSG對小鼠腦I/R損傷的保護作用可能與下調(diào)NOX4蛋白的表達有關，具體的作用機制我們將做進一步深入研究。