血栓調(diào)節(jié)蛋白在大鼠深靜脈血栓模型中的表達(dá)及其意義

成曦，孫寶蘭，蘇張瑤，張玉泉

(1. 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南通 226001； 2. 南通大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，南通 226001)

深靜脈血栓(deep vein thrombosis，DVT)是一類嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)疾病，因其可引起致命性肺栓塞被臨床醫(yī)師廣泛關(guān)注，科學(xué)合理的 DVT動(dòng)物模型有助于研究深靜脈血栓的作用機(jī)制、診斷及治療[1-3]。深靜脈血栓形成與內(nèi)皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)，內(nèi)皮細(xì)胞具有分隔血小板和凝血因子與促凝的內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)，并具有抗凝血酶和促進(jìn)纖維蛋白溶解的作用[3-4]。血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin, TM)屬于一種跨膜糖蛋白， 存在于所有血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，不僅是重要的抗凝輔助因子，也是血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的特異分子標(biāo)志之一。TM分為膜型TM和可溶性TM(soluble thrombomodulin, sTM)兩種存在形式，膜型TM存在于細(xì)胞表面，sTM 是膜型TM經(jīng)蛋白酶裂解脫落形成的一種可溶形式[5]。在多種內(nèi)皮細(xì)胞損傷性疾病中，可在血漿、尿液、關(guān)節(jié)滑液中檢測(cè)到sTM升高，其表達(dá)水平與內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度、病變血管范圍和病情輕重嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[5-9]。雖然已有研究表明[10]，TM在肺栓塞中表達(dá)明顯增加[10]，但它在DVT中的作用尚不清楚。因此，本研究擬在大鼠DVT模型的基礎(chǔ)上觀察血栓形成和消退過(guò)程中TM的表達(dá)，為臨床DVT的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD雄性大鼠10 ～ 12周齡66只，體重250 ～ 300 g，購(gòu)于南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(蘇)2014-0001】，飼養(yǎng)于南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境中【SYXK(蘇)2017-0046】。飼養(yǎng)期間給予大鼠無(wú)菌飼料飲用水(均由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各12 h交替，濕度恒定，溫度20 ～ 25℃。無(wú)菌手術(shù)在南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施完成【SYXK(蘇)2017-0046】。本實(shí)驗(yàn)由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)(20170930-001)。

1.1.2 試劑與儀器

TM ELISA試劑盒購(gòu)買自美國(guó)AMEKO公司，TRIzol試劑購(gòu)買于美國(guó) Invitroge公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)買于日本TaKaRa公司。熒光定量PCR儀(StepOne)、冷凍離心機(jī)(Fresco 17)、普通PCR儀(2720)、超微量分光光度計(jì)(One Drop)。

1.2 方法

1.2.1 分組

將SD大鼠(66只)隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只，n=10×6只)和對(duì)照組(n=6只)。

1.2.2 模型建立

術(shù)前 12 h 禁食，不限飲水，稱量大鼠體重，將0.3%的戊巴比妥鈉按30 mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉。固定好大鼠，進(jìn)行腹部手術(shù)區(qū)備皮及消毒。在大鼠腹部正中做一2 cm切口，逐一打開(kāi)皮膚層、筋膜層、肌肉層，顯露和分離左腎靜脈以下的下腔靜脈分支至髂靜脈水平。用 5-0 愛(ài)惜康縫線逐一結(jié)扎左腎靜脈以下的下腔靜脈分支至髂靜脈水平。結(jié)扎下腔靜脈分支后，在結(jié)扎點(diǎn)穿過(guò) 5-0 愛(ài)惜康縫線，另取 1 根 4-0 愛(ài)惜康縫線與下腔靜脈主干并排， 5-0 縫線方結(jié)打結(jié)之后，謹(jǐn)慎抽出并排的 4-0 縫線，并開(kāi)始計(jì)時(shí)。逐層關(guān)腹，消毒皮膚。術(shù)后1 h、4 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d后，繼續(xù)上述麻醉、固定、消毒步驟，逐層開(kāi)腹，使用負(fù)壓管進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血2 mL。將大鼠置于冰上，下腔靜脈管壁較薄，透過(guò)管壁可見(jiàn)血栓呈暗紅色，使用游標(biāo)卡尺原位測(cè)定血栓長(zhǎng)度(mm)。剪下左腎靜脈以下的下腔靜脈分支至髂靜脈水平，剝離動(dòng)脈及附屬組織筋膜。肉眼觀察下腔靜脈內(nèi)血栓形成情況，再經(jīng)HE染色確定。將剩余靜脈及血栓使用電子天平進(jìn)行稱重(g)，稱重完成后將下腔靜脈內(nèi)皮與血栓分離。對(duì)照組大鼠采用上述方法開(kāi)腹分離下腔靜脈主干及分支后，僅穿過(guò)縫線，不結(jié)扎血管，其余處理過(guò)程相同。

1.2.3 ELISA檢測(cè)血漿中TM表達(dá)

將負(fù)壓管與含枸櫞酸鈉溶液的抗凝管相連，抽血完畢，將抗凝管上下顛倒混勻，以4000 r/min離心5 min，收集上清液，存入-80℃冰箱待測(cè)。采用ELISA測(cè)定血漿sTM值，嚴(yán)格按照大鼠TM的ELISA試劑盒要求操作。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

在大鼠的內(nèi)皮和血栓樣本中分別加入1 mL TRIzol勻漿，依次經(jīng)氯仿、異丙醇等抽提法提取總RNA，采用分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度及純度。以O(shè)ligo(dT)15為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以β-actin作為內(nèi)參照，PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃ 5 min；變性95℃ 15 s，退火60℃ 60 s，延伸95℃ 15 s，共45個(gè)循環(huán)；60～95℃每上升0.3℃收集熒光繪制熔解曲線。其中引物序列如下：TM上游 5′-GAT TTT CAG ACG CTG CCG ATA G-3′，下游5′-CAG AGT TCG TTG CAC AAT TGA G-3′；β-actin上游：5′-TGT CAC CAA CTG GGA CGA TA-3′；下游5′-GGG GTG T TG AAG GTC TCA AA-3′，2-ΔΔCt計(jì)算TM mRNA相對(duì)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)檢測(cè)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率和成栓率

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，模型組和對(duì)照組均無(wú)大鼠的意外死亡，模型組和對(duì)照組的大鼠存活率為100%。對(duì)照組無(wú)血栓形成，模型組造模后1 h成栓率為33.3%(2/6)，4 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d成栓率為100%(6/6)，21、28 d成栓率分別為66.7%(4/6)，50%(3/6)。大鼠下腔靜脈產(chǎn)生的血栓頭部為白色血栓，中間為混合血栓，尾部為紅色血栓，見(jiàn)圖1。

注：A.肉眼觀下腔靜脈血栓形態(tài)；B.下腔靜脈內(nèi)有血栓形成；C.下腔靜脈內(nèi)無(wú)血栓形成。圖1 典型下腔靜脈血栓形態(tài)及HE染色切片結(jié)果Note. A. Gross appearance of an inferior vena cava thrombus. B. A cross section of the inferior vena cava thrombosis. C. No thrombosis in the inferior vena cava.Figure 1 Typical gross appearance of a thrombus and microscopic image of the inferior vena cava thrombosis(HE staining)

2.2 血栓重量/長(zhǎng)度比值變化

血栓重量/長(zhǎng)度比值在造模后4 h最低[(28.65±1.01)g/mm]，造模后7 d達(dá)高峰[(60.78 ± 0.73)g/mm]。在造模后1、4、6、12 h血栓重量/長(zhǎng)度比值較低，分別為[(29.15 ± 0.56)、(28.65 ± 1.01)、(29.01 ± 0.50)、(28.94 ± 0.89)g/mm]，四組間比較差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。在造模后24 h、3 d、7 d血栓重量/長(zhǎng)度比值達(dá)到高峰，分別為[(59.66 ± 0.64)、(60.73 ± 0.49)、(60.78 ± 0.73)g/mm]，但又穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)，三組間比較差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。造模后14 d開(kāi)始，血栓重量/長(zhǎng)度比值開(kāi)始下降，在21 d已出現(xiàn)部分大鼠下腔靜脈血栓的完全消退，但14、21、28 d血栓重量/長(zhǎng)度比值仍然穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)，分別為[(36.56 ± 0.62)、(35.84 ± 0.42)、(36.49 ± 0.46)g/mm]，三組間比較差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。見(jiàn)圖2。

注：組間比較，#P > 0.05。圖2 造模后不同時(shí)間點(diǎn)血栓重量/長(zhǎng)度比值Note. Comparison between groups,#P> 0.05.Figure 2 Thrombus weight/length ratio at different time points after modeling

2.3 ELISA檢測(cè)結(jié)果

血漿中sTM均較對(duì)照組高，差異有顯著性(P< 0.01)。血漿中sTM在對(duì)照組中濃度最低[(16.26 ± 0.20)μg/L]，在造模后28 d達(dá)高峰[(24.07 ± 0.34)μg/L]。造模后1、4、6、12 h內(nèi)血漿中sTM濃度逐漸增加，分別為[(18.70 ± 0.19)、(18.94 ± 0.37)、(19.00 ± 0.23)、(19.03 ± 0.31)μg/L]，組間比較差異無(wú)顯著性(P> 0.05)；雖然sTM值在24 h、3 d、7 d后仍然有所升高并在小范圍波動(dòng)[(21.88 ± 0.14)、(22.26 ± 0.23)、(21.75 ± 0.14)μg/L]，但三組間比較差異無(wú)顯著性(P> 0.05)；sTM在14、21、28 d穩(wěn)定在最高水平[(24.04 ± 0.21)、(23.97 ± 0.33)、(24.07 ± 0.34)μg/L]，三組間比較差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。見(jiàn)圖3。

注：與對(duì)照組相比，**P< 0.01；組間比較，#P> 0.05。圖3 造模后不同時(shí)間點(diǎn)血漿sTM 濃度Note. Compared with the control group,** P < 0.01. Comparison between groups,#P > 0.05.Figure 3 Plasma sTM concentration at different time points after modeling

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 血栓TM mRNA表達(dá)

血栓TM mRNA隨時(shí)間推移總體呈逐漸升高的趨勢(shì)，造模后1 h表達(dá)量最低(1.02 ± 0.17)，造模后14 d表達(dá)量最高(3.87 ± 0.47)。造模后1、4、6、12 h血栓TM mRNA表達(dá)量穩(wěn)定在一較低水平，分別為(1.02 ± 0.17)、(1.18 ± 0.17)、(1.15 ± 0.14)、(1.20 ± 0.11)，四組間比較差異無(wú)顯著性(P> 0.05)；血栓TM mRNA表達(dá)在24 h快速升高，但其與3、7 d 的TM mRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異[(2.44 ± 0.16)、(2.73 ± 0.39)、(2.70 ± 0.26)，P> 0.05]；14、21、28 d內(nèi)皮TM mRNA表達(dá)進(jìn)一步升高，分別為(3.87 ± 0.47)、(3.80 ± 0.49)、(3.70 ± 0.21)，三組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。見(jiàn)圖4。

注：組間比較，#P > 0.05。圖4 造模后不同時(shí)間點(diǎn)血栓TM mRNA表達(dá)Note. Comparison between groups,#P > 0.05.Figure 4 Thrombus TM mRNA expression at different time points after modeling

2.4.2 內(nèi)皮TM mRNA表達(dá)

對(duì)照組內(nèi)皮TM mRNA也有一定的表達(dá)(1.02 ± 0.15)，在造模后12 h達(dá)到最高峰(2.43 ± 0.40)，TM mRNA表達(dá)在造模后3 d到達(dá)最低水平(0.12 ± 0.02)。造模后1、4、6、12 h內(nèi)皮TM mRNA表達(dá)較對(duì)照組高，分別為(2.29 ± 0.21)、(2.33 ± 0.22)、(2.33 ± 0.30)、(2.43 ± 0.40)，與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P< 0.01)，但四組間比較差異無(wú)顯著性(P> 0.05)；內(nèi)皮TM mRNA表達(dá)在24 h、3 d、7 d較對(duì)照組低(0.13 ± 0.02)、(0.12 ± 0.02)、(0.13 ± 0.01)，與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P< 0.01)，但三組間比較差異無(wú)顯著性(P> 0.05)；14、21、28 d內(nèi)皮TM mRNA值較為穩(wěn)定，分別為(1.10 ± 0.07)、(1.0 ± 0.10)、(0.89 ± 0.17)，與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。見(jiàn)圖5。

注：與對(duì)照組相比，**P< 0.01；組間比較，#P> 0.05。圖5 造模后不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)皮TM mRNA表達(dá)Note. Compared with the control group,** P < 0.01. Comparison between groups,#P > 0.05.Figure 5 Endothelial TM mRNA expression at different time points after modeling

2.5 相關(guān)性分析

由以上結(jié)果可見(jiàn)，血栓重量/長(zhǎng)度比值、血漿sTM、血栓TM mRNA和內(nèi)皮TM mRNA呈現(xiàn)出相同的三個(gè)時(shí)間分期(1 ～ 12 h、24 h ～ 7 d、14 ～ 28 d)。其中，血栓重量/長(zhǎng)度比值和內(nèi)皮TM mRNA變化趨勢(shì)相反，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血栓重量/長(zhǎng)度比值和內(nèi)皮TM mRNA呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.92，P< 0.01)；血漿sTM和血栓TM mRNA總體均呈逐漸升高趨勢(shì)，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血栓TM mRNA和血漿sTM呈正相關(guān)(r=0.96，P< 0.01)。

3 討論

本研究采用“狹窄法”建立大鼠深靜脈血栓模型，選取建模后10個(gè)時(shí)間點(diǎn)模擬血栓形成及穩(wěn)定的整個(gè)過(guò)程。以血栓重量/長(zhǎng)度比值衡量血栓演變過(guò)程，探討DVT自然演變過(guò)程中TM的表達(dá)及意義。

3.1 大鼠DVT模型研究現(xiàn)狀

大鼠血栓模型較多，包括腸系膜上靜脈，下腔靜脈，股總靜脈等[11]。大鼠下腔靜脈屬于大靜脈，便于觀察，且既往研究發(fā)現(xiàn)大鼠下腔靜脈模型成栓率較高，最高可達(dá)100%[12-13]。下腔靜脈血栓的造模方法主要包括“完全結(jié)扎法”、“狹窄法”、“FeCl3注射法”和“電刺激法”[14-15]。由于“狹窄法”操作簡(jiǎn)單且貼近人體自然血栓形成，不影響大鼠存活，故本研究最終選擇采用大鼠下腔靜脈“狹窄法”造模，時(shí)間點(diǎn)的選擇參考白云城[12]、付健等[13]研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明使用“狹窄法”造模，大鼠血栓形成和消退時(shí)間早晚不一；血栓最早在1 h形成，最晚在2 h開(kāi)始形成；血栓最早在造模后21 d消退，造模后28 d仍有大鼠的血栓未完全消退，最晚消退時(shí)間我們將在后期進(jìn)一步研究。建模后大鼠DVT最快在1 h形成，此結(jié)論與Aghouria等[16]研究結(jié)論相符。大鼠DVT開(kāi)始形成與完全消退時(shí)間早晚不一與大鼠個(gè)體差異及對(duì)血栓性疾病遺傳易感性不一相關(guān)。

如果將血栓看成柱體，血栓重量/長(zhǎng)度比值代表血栓密度和橫截面積的乘積，血栓橫截面積與血栓患者病情嚴(yán)重情況密切相關(guān)，而密度與血栓演變過(guò)程中機(jī)化、再通等有關(guān)，血栓重量/長(zhǎng)度比值能更客觀全面衡量血栓病理變化。本研究中使用栓子重量/長(zhǎng)度比值衡量血栓演變過(guò)程，與劉海平等[17]、Sun等[18]衡量血栓形成和消退方法一致。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠造模后血栓重量/長(zhǎng)度比值在造模早期(1、4、6、12 h)較低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為血栓形成期。在造模后24 h、3 d、7 d血栓重量/長(zhǎng)度比值有了較大提高，但又穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)，為血栓穩(wěn)定期。造模后14 d開(kāi)始，血栓重量/長(zhǎng)度比值開(kāi)始下降，在21 d已出現(xiàn)部分大鼠下腔靜脈血栓的完全消退，但14、21、28 d血栓重量/長(zhǎng)度比值差異無(wú)顯著性，為血栓消退期。

3.2 TM與DVT疾病關(guān)系的探討

ELISA結(jié)果顯示，血栓自然演變過(guò)程中，各時(shí)間點(diǎn)的血漿中sTM濃度與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，此結(jié)果說(shuō)明TM作為一種重要的抗凝及抗纖維沉積的因子，在血栓自然演變的整個(gè)過(guò)程中均起著重要作用。深靜脈血栓疾病本身就是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，血栓形成、穩(wěn)定和消退是一個(gè)炎癥與免疫反應(yīng)共同參與的過(guò)程，在此過(guò)程中有多種細(xì)胞因子如：TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等的參與，sTM與這些因子共同作用，影響血栓形成和消退[4,17-18]。

PCR結(jié)果顯示，血栓自然演變過(guò)程中血栓TM mRNA表達(dá)總體呈逐漸升高的趨勢(shì)，與血漿sTM濃度呈正比。TM主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，約99%以上的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TM，此外，胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞、血小板、巨核細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等表面也可以表達(dá)TM。大鼠DVT模型中的下腔靜脈血栓屬于混合血栓，包含血小板、紅細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種成分[4]。膜型TM可以在血小板、中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞表面表達(dá)[5]，sTM 是膜型TM經(jīng)蛋白酶裂解脫落形成的一種可溶形式[8]，血栓TM mRNA表達(dá)和血漿中sTM總體均呈升高趨勢(shì)，血栓當(dāng)中的膜型TM越多，脫落到血漿中的sTM也越多。此外，隨著血栓內(nèi)新生血管增加，內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的膜型TM也逐漸增加。

內(nèi)皮TM mRNA在血栓演變過(guò)程中呈現(xiàn)出與血栓重量/長(zhǎng)度比值相反的變化趨勢(shì)，兩者呈顯著負(fù)相關(guān)。血栓形成期(造模后1～12 h)血管壁周圍少量炎癥因子刺激血管內(nèi)皮，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，內(nèi)皮上膜型TM大量生成，內(nèi)皮TM mRNA表達(dá)明顯增加。血栓穩(wěn)定期(造模后24 h～3 d)腫瘤壞死因子α等多種炎癥因子可以下調(diào)TM mRNA的表達(dá)[19-20]，故內(nèi)皮TM mRNA表達(dá)顯著降低，且肺動(dòng)脈高壓大鼠模型中也觀察到類似的TM mRNA降低現(xiàn)象。血栓消退期(造模后14～28 d)內(nèi)皮TM mRNA表達(dá)水平較低，與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示內(nèi)皮TM具有良好的預(yù)后作用。

分析以上結(jié)果，我們推測(cè)：TM作為內(nèi)皮損傷標(biāo)記物，血栓形成期，血管內(nèi)皮損傷，內(nèi)皮細(xì)胞開(kāi)始合成并釋放TM；血栓穩(wěn)定期，內(nèi)皮TM合成受阻，血栓中大量膜型TM脫落至血漿；血栓消退期，內(nèi)皮細(xì)胞損傷基本恢復(fù)，內(nèi)皮細(xì)胞已不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生少量TM，血栓中產(chǎn)生TM較多。

本研究通過(guò)建立大鼠下腔靜脈血栓模型觀察DVT自然演變過(guò)程中TM的表達(dá)及意義，采用血栓重量/長(zhǎng)度比值衡量血栓演變，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮TM mRNA表達(dá)與血栓重量/長(zhǎng)度比值成反比，其含量隨著血栓的病理進(jìn)展而改變，在形成期較高，穩(wěn)定器達(dá)低峰，消退期穩(wěn)定，說(shuō)明內(nèi)皮TM mRNA的表達(dá)變化可以反映DVT的病情進(jìn)展，具有良好的預(yù)后作用。在后期的研究中，我們將對(duì)TM在DVT演變過(guò)程中的功能作用及其分子機(jī)制做深入探討。