• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    減蛋綜合征病毒在不同品系小鼠體內的組織分布

    2019-04-28 03:39:38范濤梁琳李嘉陽李剛
    中國實驗動物學報 2019年2期
    關鍵詞:腺病毒品系抗原

    范濤,梁琳,李嘉陽,李剛*

    (1. 中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193; 2. 中國食品藥品檢定研究院,北京 102629)

    減蛋綜合征病毒(egg drop syndrome virus, EDSV)屬禽類腺病毒,2005年國際病毒分類委員會(ICTV)新的腺病毒分類標準中將EDSV歸為富AT腺病毒屬[1]。該病毒主要引起禽類(雞、鴨、鵝等)產蛋量急劇下降,可在鴨胚細胞、鴨胚成纖維細胞中良好增殖,而在雞胚成纖維細胞中增殖不良,以鴨為自然宿主[2],也稱為鴨腺病毒A型。

    腺病毒具有宿主范圍廣,致病性低,外源基因承載量大等特點,可作為抗原基因載體制成疫苗,誘導固有免疫反應或在宿主細胞內表達承載基因產物,進而實現(xiàn)免疫預防或治療目的。禽腺病毒憑借種屬的差異,對哺乳動物來說有很好的安全性,已成為重要的疫苗載體并得到廣泛的應用[3-5],研究較早且具有代表性的毒種是雞胚致死孤兒病毒(CELOV),而EDSV是否具備同樣的效果仍需進行實驗證實。本研究選用了3個品系小鼠模型作為對象,通過人工感染,觀察EDSV在小鼠體內增殖情況以及動態(tài)變化規(guī)律,為該病毒構建載體提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物

    免疫系統(tǒng)正常小鼠BALB/c、T細胞免疫缺陷小鼠Nu、高度免疫缺陷小鼠NSG,每個品系32只,SPF級,雌性,5 ~ 6周齡,體重為14 ~ 16 g,由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所保存并提供【SCXK(京)2014-0013】。動物飼養(yǎng)在中國食品藥品檢定研究院動物實驗室屏障環(huán)境隔離器中【SYXK(京)2016-0004】。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度22 ~ 26℃,相對濕度40%~70%,壓差≥50 Pa,換氣次數(shù)≥ 20 次/h,空氣潔凈度5級,明暗交替12/12 h,噪聲≤60 dB。同時本實驗在中檢院實驗動物倫理委員會監(jiān)督與指導下進行【中檢動(福)第2016(B)007號】。

    1.1.2 主要儀器

    隔離器(蘇州馮氏實驗動物設備有限公司軟包隔離器,中國),離心機(Beckman X-22R,德國),超速離心機(Hitachi CP100NX,日本);紫外分光光度儀(Thermo Nano Drop 2000,美國);酶標儀(Thermo Fisher Multiskan Go,美國);恒溫培養(yǎng)箱(上海智城ZXMP-A1230,中國);熒光定量PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司ABI 7500 Fast,美國);單通道(2 ~ 20 μL、20 ~ 200 μL)、八通道(50 ~ 300 μL)微量移液器(Eppendorf,德國)。

    1.1.3 主要試劑耗材

    ELISA 96孔可拆式(8×12)聚苯乙烯酶標板(NUNC公司,丹麥),0.1 mL八聯(lián)排管及八聯(lián)排管超凈光蓋(BIO plastics BV,荷蘭);TaKaRa Premix Ex Taq 試劑、蛋白酶K、RNase A(寶生物工程(大連)有限公司,中國),乙醇、飽和酚、氯仿、異丙醇等(北京化學工業(yè)集團有限公司,中國);蔗糖密度梯度溶液、1×PBS、抗原包被液、封閉液、PBST洗液、抗體稀釋液、酶結合物稀釋液、TMB顯色劑、終止液等由實驗室自行配制。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 小鼠攻毒與樣本采集

    將EDSV病毒液室溫解凍,搖勻。3個品系小鼠,品系內分為實驗組24只,每只小鼠腹腔注射0.1 mL血凝效價為212的病毒液;對照組8只,每只腹腔注射同等劑量的PBS。實驗組與對照組分開放置于不同隔離器內飼養(yǎng)。分別于攻毒后1、3、5、7、14、21、28、35 d,每日選取各品系3只實驗組和1只對照組小鼠,CO2麻醉,摘除眼球取全血約1 mL,置于1.5 mL離心管中,4℃靜置析出血清,用微量移液器吸取上層血清至新離心管中,編號,-20℃凍存?zhèn)溆?。選擇攻毒后1、7、14、21、28 d實驗組與對照組小鼠,剖取心臟、肺、肝、脾、腎、小腸、子宮、氣管、食管、腦10種組織,每種組織取一小塊置于1.5 mL離心管中,用于DNA提取,-80℃凍存。

    1.2.2 間接ELISA抗原包被濃度與抗體稀釋度優(yōu)化

    30% ~ 50%(m/v)5個間隔相等濃度梯度的蔗糖溶液進行超速離心純化抗原;用純化的EDSV抗原包板,抗原稀釋為2、5、7、10 μg/mL 4個濃度,取已知陽性血清、陰性血清各1份,分別做1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600倍的稀釋,“方陣滴定法”確定抗原最佳包被濃度與血清工作稀釋度,P/N值最大時對應的抗原濃度與抗體稀釋度為工作濃度。

    1.2.3 間接ELISA方法小鼠血清抗體監(jiān)測

    用優(yōu)化后濃度的抗原液包板,100 μL/孔,37℃ 1 h后4℃過夜;設置陰性對照、陽性對照、空白對照各2個孔,分別加入工作濃度稀釋后的SPF級小鼠血清、已知EDSV抗體陽性小鼠血清和PBS,待檢血清樣本稀釋后每份平行做2孔,每孔100 μL,用封板膜封板,37℃反應1 h;取出后洗板5次,叩干;山羊抗鼠辣根過氧化物酶(goat anti-mouse IgG-HRP)按1∶5000稀釋為工作濃度,每孔加入100 μL,封板,37℃孵箱反應1 h,取出后洗板5次并叩干;每孔加入100 μL 底物溶液,放入鋁箔袋,37℃避光顯色10 ~ 15 min;取出酶標板,每孔加入50 μL終止液(2 mol/L硫酸);酶標儀設定波長為450 nm,讀取板上各孔OD值。

    1.2.4 TaqMan qPCR檢測EDSV體內組織分布

    將各組織塊解凍,剪碎,飽和酚/氯仿法提取總DNA,紫外分光光度計測定DNA濃度及純度。以EDSV六鄰體蛋白編碼區(qū)基因序列作為目的基因,文獻獲得探針引物[6];NCBI網站公布的小鼠β-actin蛋白(Actb)基因序列(Gene ID:11461)為內參基因,設計探針引物,由寶生物工程(大連)有限公司設計合成。(表1)

    根據(jù)TaKaRa Premix Ex Taq 試劑使用ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀推薦反應體系及條件進行擴增,qPCR反應體系:PremixExTaq(2×buffer) 10 μL、Forward Primer (10 μmol/L) 0.4 μL、Reverse Primer (10 μmol/L) 0.4 μL、Probe (5 μmol/L) 0.8 μL、ROX Reference Dye2 (50×) 0.2 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 6.2 μL,qPCR反應程序:95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 30 s,40 個循環(huán),60℃時收集熒光信號。用比較CT法(△△CT)進行數(shù)據(jù)處理,得出相對定量(RQ)值,再將RQ值取10的對數(shù)(LgRQ),轉換為數(shù)量級的形式來判斷變化量[7]。

    表1 EDSV、Actb 熒光定量PCR引物及探針Table 1 Primers and probes for EDSV, Actb TaqMan qPCR

    2 結果

    2.1 間接ELISA檢測三種小鼠血清抗體變化規(guī)律

    2.1.1 抗原包被濃度與抗體稀釋度優(yōu)化

    “方陣滴定”結果顯示,EDSV抗原包被濃度為2 μg/mL,陰性、陽性血清稀釋度為1∶800倍時,此時的P/N值最高,為23.10,因此,確定使用該濃度的抗原及血清稀釋度進行抗體檢測。(表2)

    表2 EDSV抗原包被濃度及血清工作稀釋度結果Table 2 Results of EDSV coating concentration and serum working dilution

    2.1.2 間接ELISA監(jiān)測三種小鼠血清抗體

    ELISA檢測結果顯示(表3),BALB/c小鼠攻毒3 d即可在血清內檢測到抗體的表達,平均OD值為0.901;至14 d,抗體水平達到最高,至監(jiān)測期內35 d一直維持高水平表達;Nu小鼠也可于攻毒3 d檢測到抗體,但表達水平較BALB/c小鼠有所降低,平均OD值為0.587,攻毒14 d后,Nu小鼠血清中抗體水平出現(xiàn)下降,至35 d抗體一直維持在較低的水平;NSG小鼠在整個監(jiān)測過程中,抗體水平一直處于陰性狀態(tài)。根據(jù)檢測數(shù)據(jù),繪制三品系小鼠血清抗體變化趨勢圖(圖1)。

    表3 三品系小鼠血清抗體ELISA檢測結果Table 3 ELISA test results of serum antibodies in the three mouse strains

    圖1 三品系小鼠血清抗體ELISA檢測結果比較Figure 1 Comparison of ELISA results of serum antibodies in the three mouse strains

    2.2 TaqMan qPCR檢測EDSV組織分布結果

    3個品系小鼠的10種組織樣本,除NSG小鼠7 d和14 d腦組織中未檢測到病毒含量外,其他樣本目的基因與內參基因均可計算出相對表達量(表4)。同時,各品系對照組小鼠在實驗期內,各組織中均未擴增出病毒核酸。

    根據(jù)實驗結果,BALB/c小鼠感染后1 d,肝組織中的病毒表達量最高,達到5.45個數(shù)量級,其次由高到低依次是脾、食管、子宮、小腸、肺、氣管、腎、心臟,腦組織中病毒含量最低,隨感染時間的延長,各組織內病毒表達量較感染1 d均有所下降;至攻毒后28 d,肝、脾病毒表達量依然維持著較高的水平,腦組織中病毒相對含量降至最低,其他各臟器組織中仍可檢測到病毒含量(圖2)。

    Nu小鼠和NSG小鼠略有差異,其感染1 d表現(xiàn)為脾組織中病毒表達量最高,分別為3.95和4.05個數(shù)量級,其次為肝,Nu小鼠1 d肝病毒含量為3.84個數(shù)量級,NSG小鼠為3.82個數(shù)量級。隨后兩品系小鼠各器官內的病毒表達量逐步降低,以Nu小鼠最為明顯,于攻毒28 d,兩種小鼠體內各器官內仍可以檢出陽性信號,肝、脾病毒表達量較高。結果表明,在監(jiān)測期內,EDSV可在部分小鼠組織器官內始終存在,主要集中在肝、脾等組織中(圖3、圖4)。

    表4 三品系小鼠各組織病毒載量相對定量結果Table 4 Relative quantitative results of viral load in tissues of the three mouse strains

    圖2 EDSV在BALB/c小鼠體內組織分布Figure 2 Organ distribution of EDSV in the BALB/c mice

    圖3 EDSV在Nu小鼠體內組織分布Figure 3 Organ distribution of EDSV in the nude mice

    圖4 EDSV在NSG小鼠體內組織分布Figure 4 Organ distribution of EDSV in the NSG mice

    3 討論

    EDSV按原分類屬于禽類腺病毒Ⅲ群,由五鄰體蛋白(penton)、六鄰體蛋白(hexon)與纖維蛋白(fiber)共同構成病毒衣殼。試驗證明,三種結構性蛋白基因經過重組表達鑒定,均具有免疫原性[8-10]。在EDSV感染禽類的研究中,種鴨可在攻毒3 d檢測到血清抗體,HI效價可達8 Log2,并于攻毒后12 d達到最高[11];王曉東[12]對3月齡SPF鴨僅進行基礎免疫后,第1周即可檢測出血清抗體,平均HI效價5.75 Log2,兩周后達到最高6.75 Log2,抗體水平可維持17周在5 Log2以上。以上結果都指示出EDSV可快速刺激禽類機體產生免疫應答反應,并產生持久性的抗體保護。鼠腺病毒(mouse adenovirus, Mad)以小鼠為天然宿主,在實驗鼠群中感染比例約為8.3%[13]。人工感染后15 d ELISA方法可檢測出陽性血清抗體,37 d達到峰值[14]。本實驗是使用禽腺病毒人工感染小鼠,結果顯示,該病毒株可使小鼠在短期內產生較高水平的抗體,并且可維持35 d抗體持續(xù)檢出,相比鼠腺病毒,EDSV能夠較快地刺激小鼠機體產生免疫應答反應,與禽類感染此病毒后的特性相一致。

    通過實驗結果可以看出,動物自身免疫機能對EDSV抗體的表達產生著影響。免疫機能正常的BALB/c小鼠,在抗原刺激后3 d即可檢測出血清抗體,并隨著感染時程延長,抗體水平逐漸增高,監(jiān)測至35 d,仍然保持著較高的抗體含量。裸小鼠較BALB/c而言,缺少胸腺,體內無成熟的T淋巴細胞,而EDSV像大多數(shù)微生物一樣屬胸腺依賴性抗原(TDAg),輔助性T細胞(Th)的缺陷,導致小鼠體內B細胞在免疫應答過程中產生的抗體有所減少,不能持續(xù)產生有效的體液免疫應答。因此,裸鼠的血清抗體產生初期,表達水平較BALB/c小鼠偏低,監(jiān)測至21 d時,血清抗體水平下降明顯。NSG小鼠是在NOD小鼠背景基礎上,DNA修復復合蛋白Prkdc發(fā)生scid突變,致使小鼠B、T淋巴細胞缺失,同時IL2rg缺失突變,阻止了多重受體細胞因子信號傳導,導致功能性NK細胞缺失[15],動物機體無法產生細胞免疫應答與體液免疫應答,因此,在整個抗原刺激過程中,其抗體水平一直維持在陰性,符合該模型特點。

    應用熒光定量PCR相對定量法檢測病毒載量,其優(yōu)勢在于去除了采樣間的誤差,結果用變化倍數(shù)來表示,用于指示病毒在體內含量的變化趨勢。通過比較不同品系小鼠各組織臟器中病毒核酸相對表達量可以看出,三品系小鼠均可在腹腔注射病毒液后1 d于體內各主要臟器中檢測到病毒,這可能與感染途徑有關,病毒液隨血液循環(huán)迅速擴散至全身各臟器中。BALB/c小鼠感染后1 d,肝為病毒相對表達量最高的組織器官,感染至28 d,脾中病毒相對表達量最高,肝較脾中病毒水平略低,但依然顯示有較高的表達量;Nu和NSG兩種免疫缺陷型小鼠表現(xiàn)出攻毒后1 d脾病毒含量最,其次是肝,這可能與其具有的免疫缺陷特性有關,兩種小鼠的脾均小于免疫正常的小鼠,至28 d時,其二者肝中病毒相對表達量是各組織間最高的,由此說明,EDSV對小鼠肝與脾有一定的親嗜性。通過三品系小鼠攻毒全程監(jiān)測結果可以看出,28 d時體內各組織的病毒含量較攻毒1周內(1 ~ 7 d)均有所降低,說明動物機體自身對EDSV有一定的清除作用。病毒在免疫系統(tǒng)正常與免疫缺陷小鼠的體內均沒有引起明顯的組織病變,除了動物機體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用以外還可能與組織細胞表面結合受體有關。腺病毒有嚴格的種屬特異性,而EDSV又是介于禽類腺病毒與哺乳動物腺病毒的中間體[16],推測該病毒在哺乳動物體內可以增殖表達,是否引起組織細胞發(fā)生病變需進一步進行實驗觀察。

    綜上所述,減蛋綜合征病毒可刺激小鼠產生免疫應答,在免疫缺陷小鼠體內抗體水平表達量較低,該病毒在小鼠體內有肝、脾等組織嗜性特點,為EDSV構建新型載體以及在實驗動物模型上的進一步研究與應用提供了理論基礎與數(shù)據(jù)支持。

    猜你喜歡
    腺病毒品系抗原
    貴州黑山羊新品系選育
    10個團豆新品系在綏陽縣的田間性狀及產量表現(xiàn)
    農技服務(2023年2期)2023-03-15 00:43:08
    人腺病毒感染的病原學研究現(xiàn)狀
    傳染病信息(2022年3期)2022-07-15 08:22:14
    4個地被菊新品系對濕熱脅迫的耐受性研究
    園林科技(2020年2期)2020-01-18 03:28:18
    某部腺病毒感染疫情調查分析
    豬乙型腦炎PrM-E重組腺病毒的構建及免疫原性
    載EPO腺病毒的PLGA納米纖維支架在體內促進骨缺損修復作用
    梅毒螺旋體TpN17抗原的表達及純化
    結核分枝桿菌抗原Lppx和MT0322人T細胞抗原表位的多態(tài)性研究
    APOBEC-3F和APOBEC-3G與乙肝核心抗原的相互作用研究
    成年女人毛片免费观看观看9| 丁香欧美五月| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲在线自拍视频| 悠悠久久av| 欧美黑人精品巨大| 免费搜索国产男女视频| 国产激情久久老熟女| 欧美乱色亚洲激情| 国产在线观看jvid| 日韩av在线大香蕉| 午夜成年电影在线免费观看| 欧美精品亚洲一区二区| 两个人免费观看高清视频| 国产黄色小视频在线观看| 午夜老司机福利片| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 搡老岳熟女国产| a级毛片a级免费在线| 一级作爱视频免费观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 91字幕亚洲| 99在线人妻在线中文字幕| av超薄肉色丝袜交足视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 在线观看日韩欧美| 色综合婷婷激情| 18禁观看日本| 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产成人精品久久二区二区免费| 日本五十路高清| 午夜福利免费观看在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 99国产精品一区二区三区| 午夜影院日韩av| 中文字幕熟女人妻在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 精品乱码久久久久久99久播| 毛片女人毛片| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 最近在线观看免费完整版| 久久久精品大字幕| 一区二区三区高清视频在线| 露出奶头的视频| 成人av在线播放网站| 免费观看精品视频网站| 男人舔奶头视频| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 视频区欧美日本亚洲| 黄片大片在线免费观看| 国产激情欧美一区二区| 亚洲全国av大片| 国产一区二区在线观看日韩 | 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 99精品在免费线老司机午夜| 久久精品人妻少妇| 成在线人永久免费视频| 男插女下体视频免费在线播放| 午夜福利成人在线免费观看| 一级毛片高清免费大全| 日本成人三级电影网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久香蕉激情| netflix在线观看网站| 国产三级中文精品| 男女之事视频高清在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 九九热线精品视视频播放| 午夜激情福利司机影院| 不卡av一区二区三区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 级片在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产精品九九99| 精品一区二区三区四区五区乱码| 日韩精品中文字幕看吧| 深夜精品福利| 久久这里只有精品19| 日韩欧美在线乱码| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩av在线大香蕉| 中文字幕久久专区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久久久精品国产欧美久久久| 成人特级黄色片久久久久久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产成人欧美在线观看| www.精华液| 黄色a级毛片大全视频| 成人国产综合亚洲| 免费在线观看影片大全网站| 国产一区二区在线观看日韩 | 国产精品久久电影中文字幕| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲专区字幕在线| 91字幕亚洲| 国产精品九九99| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲成人国产一区在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 国产av一区在线观看免费| 人人妻人人看人人澡| 大型黄色视频在线免费观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲五月天丁香| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产激情欧美一区二区| 男人舔女人的私密视频| 久久久久久大精品| 1024视频免费在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 无遮挡黄片免费观看| 免费看美女性在线毛片视频| 久久久国产成人精品二区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 99久久精品国产亚洲精品| 丁香六月欧美| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产三级在线视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 操出白浆在线播放| 中文字幕av在线有码专区| 国产精品久久久久久久电影 | 国内精品一区二区在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲中文av在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 1024手机看黄色片| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 手机成人av网站| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 在线看三级毛片| 成人永久免费在线观看视频| 搡老岳熟女国产| 日本 欧美在线| 国产人伦9x9x在线观看| 搞女人的毛片| 五月伊人婷婷丁香| 久久精品91无色码中文字幕| 两个人看的免费小视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 黄色视频不卡| 18禁美女被吸乳视频| 桃色一区二区三区在线观看| 国产成人av激情在线播放| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲精品在线观看二区| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 一进一出抽搐动态| 中文在线观看免费www的网站 | 久久人妻福利社区极品人妻图片| av福利片在线| 日韩欧美国产在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 床上黄色一级片| 露出奶头的视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 精品福利观看| 天堂√8在线中文| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲专区国产一区二区| 舔av片在线| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲18禁久久av| 国产区一区二久久| 国产一区二区三区视频了| 免费观看人在逋| 黑人欧美特级aaaaaa片| av欧美777| 99精品久久久久人妻精品| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 1024手机看黄色片| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲九九香蕉| 国产探花在线观看一区二区| av欧美777| 一进一出抽搐动态| 欧美精品亚洲一区二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 可以在线观看毛片的网站| 搡老岳熟女国产| 精品欧美国产一区二区三| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美黑人欧美精品刺激| 美女扒开内裤让男人捅视频| 此物有八面人人有两片| 俺也久久电影网| 91九色精品人成在线观看| 丰满的人妻完整版| 免费在线观看成人毛片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲欧美日韩东京热| 波多野结衣高清作品| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲熟妇熟女久久| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲全国av大片| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久久久免费精品人妻一区二区| av有码第一页| 男女那种视频在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲专区国产一区二区| 欧美zozozo另类| 丁香六月欧美| www.999成人在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲av熟女| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲美女视频黄频| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲专区国产一区二区| 欧美在线一区亚洲| 成人精品一区二区免费| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产久久久一区二区三区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| tocl精华| 免费无遮挡裸体视频| 视频区欧美日本亚洲| 观看免费一级毛片| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲电影在线观看av| 国产高清有码在线观看视频 | 岛国视频午夜一区免费看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 18禁观看日本| 麻豆成人午夜福利视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| a级毛片在线看网站| 亚洲专区字幕在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 黄色a级毛片大全视频| 欧美黑人精品巨大| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美一区二区精品小视频在线| 又大又爽又粗| 国语自产精品视频在线第100页| 听说在线观看完整版免费高清| 久久久久久久久免费视频了| 香蕉av资源在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 不卡一级毛片| 高清毛片免费观看视频网站| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 99国产精品一区二区蜜桃av| 99国产精品一区二区三区| 久久久国产精品麻豆| 制服人妻中文乱码| 久久这里只有精品中国| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久久国产欧美日韩av| x7x7x7水蜜桃| 97碰自拍视频| 热99re8久久精品国产| 国产99白浆流出| 男女视频在线观看网站免费 | 国产亚洲av嫩草精品影院| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲av成人一区二区三| or卡值多少钱| 一级毛片高清免费大全| 色综合站精品国产| 窝窝影院91人妻| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产亚洲欧美98| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 男女之事视频高清在线观看| 男女那种视频在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 女人被狂操c到高潮| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产高清有码在线观看视频 | 身体一侧抽搐| 又大又爽又粗| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品久久久久久精品电影| 国产日本99.免费观看| 在线观看66精品国产| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产精品野战在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 在线播放国产精品三级| 日本五十路高清| 真人一进一出gif抽搐免费| 手机成人av网站| 午夜福利免费观看在线| 一级毛片精品| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美一级毛片孕妇| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 黄色 视频免费看| 岛国在线免费视频观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 99在线人妻在线中文字幕| 国产激情久久老熟女| 亚洲美女黄片视频| 欧美色视频一区免费| 国产精品免费视频内射| 丝袜美腿诱惑在线| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 免费在线观看黄色视频的| 在线a可以看的网站| 国产精品av久久久久免费| 亚洲av成人精品一区久久| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 免费在线观看成人毛片| www.自偷自拍.com| 麻豆成人午夜福利视频| 色哟哟哟哟哟哟| 夜夜爽天天搞| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲成人精品中文字幕电影| 99久久精品国产亚洲精品| 国产高清视频在线播放一区| 成人手机av| 欧美精品啪啪一区二区三区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 中文字幕最新亚洲高清| 免费av毛片视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产精品综合久久久久久久免费| 香蕉国产在线看| 在线a可以看的网站| 国产伦人伦偷精品视频| svipshipincom国产片| 亚洲欧美激情综合另类| 久久久久久九九精品二区国产 | 岛国在线观看网站| 91av网站免费观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产熟女xx| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 精品日产1卡2卡| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久九九热精品免费| 久久国产精品影院| 免费看十八禁软件| 亚洲电影在线观看av| 这个男人来自地球电影免费观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 老鸭窝网址在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 麻豆国产97在线/欧美 | 国产一区二区三区视频了| 桃红色精品国产亚洲av| 波多野结衣巨乳人妻| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲av成人一区二区三| 51午夜福利影视在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 成人午夜高清在线视频| 麻豆成人av在线观看| 欧美黑人巨大hd| 国产精品1区2区在线观看.| 久久久久国内视频| 欧美日韩黄片免| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产区一区二久久| 一a级毛片在线观看| svipshipincom国产片| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日本一本二区三区精品| 九色成人免费人妻av| 一级毛片高清免费大全| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 免费搜索国产男女视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产爱豆传媒在线观看 | 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产高清videossex| 亚洲男人天堂网一区| 怎么达到女性高潮| a级毛片a级免费在线| 亚洲自偷自拍图片 自拍| av视频在线观看入口| 亚洲专区国产一区二区| 最近在线观看免费完整版| 成人国产一区最新在线观看| 精品久久蜜臀av无| 两个人免费观看高清视频| 久久热在线av| 色综合站精品国产| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 后天国语完整版免费观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 欧美av亚洲av综合av国产av| 1024手机看黄色片| av天堂在线播放| 中出人妻视频一区二区| 99久久精品热视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产黄a三级三级三级人| 91在线观看av| 亚洲一码二码三码区别大吗| 在线观看免费视频日本深夜| av福利片在线| 国产成人系列免费观看| 午夜久久久久精精品| 波多野结衣高清作品| 亚洲国产欧美网| 国产高清有码在线观看视频 | 日日干狠狠操夜夜爽| 在线观看66精品国产| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久人人精品亚洲av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久这里只有精品中国| 国产探花在线观看一区二区| 日韩欧美免费精品| 又紧又爽又黄一区二区| 国产成人aa在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产人伦9x9x在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 亚洲av电影在线进入| 老司机深夜福利视频在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 99精品久久久久人妻精品| 午夜免费成人在线视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 麻豆国产97在线/欧美 | 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产精品av久久久久免费| 看黄色毛片网站| 91av网站免费观看| 国产精品免费视频内射| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 男女下面进入的视频免费午夜| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美日韩福利视频一区二区| 五月伊人婷婷丁香| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 极品教师在线免费播放| 亚洲专区国产一区二区| 99久久国产精品久久久| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久中文字幕一级| 中文亚洲av片在线观看爽| 长腿黑丝高跟| 特级一级黄色大片| 91国产中文字幕| 午夜免费成人在线视频| 伦理电影免费视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 丝袜人妻中文字幕| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品日产1卡2卡| 日本精品一区二区三区蜜桃| 无限看片的www在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| www.自偷自拍.com| 国产精品 欧美亚洲| 国产三级黄色录像| 亚洲色图av天堂| 国产欧美日韩一区二区精品| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久久久久久久免费视频了| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久久久性生活片| 99久久精品热视频| 欧美高清成人免费视频www| av超薄肉色丝袜交足视频| 午夜福利高清视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产三级黄色录像| 国产精品98久久久久久宅男小说| 日本一区二区免费在线视频| 久久这里只有精品中国| 精品高清国产在线一区| 老鸭窝网址在线观看| 男人舔女人的私密视频| 国产精品 欧美亚洲| videosex国产| 国产精品国产高清国产av| 青草久久国产| 午夜影院日韩av| 日本一本二区三区精品| 性色av乱码一区二区三区2| 日韩中文字幕欧美一区二区| 最新在线观看一区二区三区| 宅男免费午夜| 国产成+人综合+亚洲专区| 91国产中文字幕| 日韩成人在线观看一区二区三区| 精品久久久久久久久久免费视频| 51午夜福利影视在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 精品日产1卡2卡| 国产午夜精品久久久久久| 免费无遮挡裸体视频| 黄色片一级片一级黄色片| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产精品 国内视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 午夜久久久久精精品| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美日韩黄片免| 成人三级做爰电影| 99在线人妻在线中文字幕| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产av一区二区精品久久| 欧美日本视频| 一本久久中文字幕| 美女大奶头视频| 免费观看精品视频网站| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲 国产 在线| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 99国产综合亚洲精品| 久久精品91蜜桃| www国产在线视频色| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 午夜激情av网站| 午夜老司机福利片| 美女黄网站色视频| 亚洲最大成人中文| 亚洲人与动物交配视频| 午夜免费观看网址| 亚洲午夜理论影院| 日韩av在线大香蕉| 不卡一级毛片| 国产视频内射| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲色图av天堂| 久久久久性生活片| 国产精品一区二区三区四区久久| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美日韩精品网址| 99热6这里只有精品| 99精品欧美一区二区三区四区| 婷婷亚洲欧美| 国产日本99.免费观看| 亚洲18禁久久av| 午夜激情av网站| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲精品美女久久av网站| 久热爱精品视频在线9| 久久久国产成人精品二区| 国产三级黄色录像| 国产精品久久久久久久电影 | 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 长腿黑丝高跟| 日本成人三级电影网站| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲中文av在线|