利用黑斑雙鰭電鰩構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力小鼠模型

李志彬，李毅，金宛霖，楊樹梅，孟環(huán)宇，胡波，徐立群，羅朝輝，楊歡

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，長沙 410008)

重癥肌無力(myasthenia gravis, MG)是一種由于神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction，NMJ)突觸后膜主要以乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor,AchR)被自身抗體破壞，從而引發(fā)NMJ傳遞障礙而產(chǎn)生的自身免疫性疾病[1]。目前公認(rèn)的經(jīng)典MG動(dòng)物模型是用加利福尼亞電鰩(Torpedocalifornica)電器官提取、純化的AchR蛋白來主動(dòng)免疫，建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)模型，進(jìn)行MG發(fā)病機(jī)制研究。由于加利福尼亞電鰩以及用于純化的眼鏡蛇神經(jīng)毒素難以獲得，國內(nèi)目前難以建立符合國際化的臨床前實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的 EAMG動(dòng)物模型[2]。我們參考國內(nèi)外文獻(xiàn)[3-4]，從黑斑雙鰭電鰩的電器官提取、純化的AchR蛋白作為抗原免疫容易致敏的C57BL/6小鼠，建立小鼠EAMG模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 ～ 8周齡SPF級(jí)C57BL/6雌鼠40只，體重16～18g,購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(湘) 2016-0002】，并飼養(yǎng)于中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部屏障設(shè)施內(nèi)【SYXK(湘) 2015-0017】。 飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22 ～ 25℃，濕度50% ～ 60%，晝夜各半交替。實(shí)驗(yàn)操作在中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部屏障設(shè)施進(jìn)行。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號(hào): 201703106)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

免疫動(dòng)物所需的AchR蛋白來自于我們實(shí)驗(yàn)室所提取。α-中華眼鏡蛇神經(jīng)毒素(上海科敏生物科技有限公司，中國)，氨甲酰膽堿(四川省奧克生物技術(shù)有限公司，中國)，H37Ra(BD公司，美國)，CFA(Sigma公司，美國)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Millipore 3000超濾管濃縮(Millipore，德國)，透析帶(上海鼎國生物技術(shù)有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 AchR的提取

黑斑雙鰭電鰩(Narcinemaculate)(圖1)從我國南海海域捕撈，剖取電器官，存于-80℃冰箱。將200 g冰凍的電器官與2倍體積的勻漿緩沖液倒入組織破碎機(jī)中，高速勻漿得到均質(zhì)混合物，287 000 r/min，4℃離心30 min，棄上清液，取3倍于沉淀體積的勻漿緩沖液(含1%的Triton X-100溶液)，4℃低速振蕩過夜。將振蕩后混合物繼續(xù)287 000 r/min，4℃離心30 min，得到含AchR的上清液。

圖1 黑斑雙鰭電鰩Figure 1 Gross image of a Nacrine maculate

1.2.2 中華眼鏡蛇毒親和層析柱制備及純化AchR蛋白

(1)中華眼鏡蛇毒親和層析柱制備

將7.5 g凍干的活化CNBr交聯(lián)凝膠加入30 mL濃度1 mmol/L的鹽酸中，靜置15 min，將凝膠與30 mg α-中華眼鏡蛇神經(jīng)毒素混合，測(cè)量A280吸光度檢測(cè)二者混合狀態(tài)。加入50 mL pH 8.0 的 0.2 mol/L 甘氨酸入凝膠，4℃過夜。依次用4 ～ 5倍量的耦合緩沖液、0.1 mol/L 的醋酸緩沖液(pH=4)/0.5 mol/L 氯化鈉、耦合緩沖液沖洗凝膠，以去除未偶聯(lián)的神經(jīng)毒素，將其倒入1.5 × 20 cm Econo柱中，制備神經(jīng)毒素凝膠柱子。

(2)制備羥基磷灰石柱子

將40 mL生物膠HT羥基磷灰石溶解于100 mL濃度為10 mmol/L Tris緩沖液，輕旋攪拌，靜置5 min。小心倒出混合液上清中的懸浮細(xì)末及沉淀物上部的少許粉末。重復(fù)用100 mL濃度為10 mmol/L Tris緩沖液洗5次，將其倒入1.5 × 20 cm Econo柱中，制備羥基磷灰石柱子。

(3)親和純化AchR蛋白

用1.2.1得到的AchR的上清液與(1)得到的中華眼鏡蛇神經(jīng)毒素凝膠重懸混合，4℃低速振蕩過夜。將振蕩混合液重新裝柱，制備AchR毒素親和柱。用含有0.2%的膽酸鈉緩沖液沖洗AchR毒素親和柱以及羥基磷灰石柱子。用100 mL濃度為1 mol/L 氨甲酰膽堿緩沖液沖洗含有羥基磷灰石柱子。用塑料管連接兩個(gè)柱子和Bio-Rad 蛋白純化系統(tǒng)的蠕動(dòng)泵。以60 mL/h的速度運(yùn)行蠕動(dòng)泵，循環(huán)14 ～ 16 h。用500 mL柱子沖洗液沖洗羥基磷灰石柱子，用洗脫緩沖液沖洗柱子，收集洗脫液。用millipore3000超濾管濃縮，裝入截流范圍3500的透析帶，置于生理鹽水中，4℃下每次透析8 h，更換生理鹽水，共透析3次，得到純化的AchR蛋白溶液。

1.2.3 SDS-PAGE分析

取AchR蛋白溶液，8%丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色呈現(xiàn)5個(gè)條帶(圖2)。利用BCA法測(cè)定純化AchR蛋白濃度為1.8 mg/mL，從200 g濕電器官中共提取21 mg純化AchR蛋白。

注：AchR純化蛋白經(jīng)8%SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮藍(lán)染色呈現(xiàn)5個(gè)條帶。圖2 AchR純化蛋白電泳圖Note. After electrophoresis of the purified AchR protein by 8% SDS-PAGE, Coomassie blue staining showed 5 Bands.Figure 2 Electrophoresis of the purified AchR protein

1.2.4 EAMG 模型制備及評(píng)價(jià)

(1)EAMG 模型制備

6 ～ 8周齡的 C57BL/6雌鼠， 40只，隨機(jī)分為 2 組，佐劑組、模型組, 每組 20 只并編號(hào)。按每只模型組小鼠注射免疫原的劑量：20 μg AchR溶于100 μL PBS，與100 μL的含有10% (m/v) H37Ra的 CFA懸液完全乳化，共200 μL，上述乳劑以50 μL/只皮下注射四個(gè)部位，第一次免疫于雙側(cè)后足墊及雙肩，第二、三次免疫于雙大腿處及雙肩。分別于實(shí)驗(yàn)第 1 天、第30天、第60天，共免疫 3 次，第70天結(jié)束觀察，記錄小鼠的臨床評(píng)分、體重、新斯的明實(shí)驗(yàn)、肌電圖等指標(biāo)，然后處死動(dòng)物測(cè)定血清中抗AchR抗體水平。通過上述指標(biāo)測(cè)定，綜合判定模型成功與否。

(2)EAMG評(píng)價(jià)及檢測(cè)方法

臨床評(píng)分：參照 Lennon等的[5]方法將肌無力嚴(yán)重程度分為四級(jí)；體重：每周記錄小鼠一次體重；新斯的明實(shí)驗(yàn)：按每克體重給予新斯的明2.4×10-4mg肌肉注射，監(jiān)測(cè)小鼠的臨床評(píng)分；肌電圖：按Wu 等[3]的方法；血清中抗AchR抗體：采用ELISA法測(cè)定血清抗AchR抗體總IgG、IgG1、IgG2b和IgG2c[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 臨床評(píng)分

模型組共有11只小鼠臨床評(píng)分高于1分，第3～4周共有兩只發(fā)病，余9只于第二次免疫后發(fā)病，其中2分5只，3分4只。佐劑組動(dòng)作快，無隆起體位； 模型組發(fā)病小鼠表現(xiàn)為呼吸急促，頭部震顫，行走緩慢，豎毛，隆起體位。兩組之間臨床評(píng)分比較，差異有顯著性，P< 0.01(表1，圖3)。

2.2 體重

動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠體重，模型組于免疫接種第三周后食量減少，體重逐漸減輕，佐劑組體重逐漸增加。與佐劑組體重比較，模型組發(fā)病小鼠的體重明顯減輕， 差異有顯著性，P< 0.01(表1)。

表1 小鼠臨床評(píng)分及體重Table 1 Clinical scores and body weight of the

注：與佐劑對(duì)照組比較，**P< 0.01。

Note. Compared with the adjuvant control group,**P< 0.01.

2.3 血清中抗AchR抗體

與佐劑組比較，血清抗AchR抗體總IgG、IgGl、IgG2b和IgG2c含量在EAMG 模型組發(fā)病小鼠中明顯增高，差異有顯著性，P< 0.01(表2)。

2.4 肌電圖

與對(duì)照組比較，模型組發(fā)病小鼠在 3 Hz 低頻電刺激下第五個(gè)反應(yīng)幅度較第一個(gè)衰減顯著大于10%(圖4)。

2.5 新斯的明試驗(yàn)

取EAMG模型組發(fā)病小鼠，按每克體重給新斯的明2.4×10-4mg肌肉注射，5 min后小鼠癥狀出現(xiàn)明顯改善，判定為新斯的明試驗(yàn)陽性。

圖3 對(duì)照組(A)與模型組(B)小鼠Figure 3 Mice of the control (A) and model (B)groups

表2 小鼠血清anti-AchR ab不同亞型含量值)Table 2 Different subtypes of serum anti-AchR ab in the mice OD values)

注: 與佐劑對(duì)照組比較，**P< 0.01。

Note. Compared with the adjuvant control group,**P< 0.01.

圖4 對(duì)照組(A)與模型組(B)小鼠肌電圖Figure 4 Electromyogram of the mice in control group (A) and model group(B)

3 討論

重癥肌無力是一種位于神經(jīng)肌肉接頭處的，針對(duì)突觸后膜不同成分，產(chǎn)生不同自身抗體的自身免疫性疾病，其中80%以上患者血清可檢測(cè)到抗AchR抗體陽性[1]。為了探討MG的發(fā)病機(jī)制及治療方法，1973年 Lindstrom 等[7]從電鰻的電器官中提取AchR免疫兔子首次建立了AchR-EAMG模型。自Lindstrom的研究后，越來越多建模方法被應(yīng)用到MG動(dòng)物模型上。國內(nèi)研究者也利用電鰻乙酰膽堿受體構(gòu)建了重癥肌無力小鼠模型[8]，除了使用AchR作為免疫原得到AchR-EAMG模型，隨后研究者們又首次建立了Musk-EAMG模型[9]和LRP4-EAMG模型[10]。其中AchR-EAMG模型還包括利用雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體構(gòu)建被動(dòng)轉(zhuǎn)移模型[11-12]，重組人AchR建立EAMG模型[13-14]以及人工合成 AchR 多肽構(gòu)建 EAMG 模型[15]，其中最經(jīng)典是利用T-AchR構(gòu)建小鼠及大鼠的EAMG模型[3]。

自2015年美國NIH及MGFA重癥肌無力臨床前實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化指南發(fā)布以來，提取AchR用于構(gòu)建符合國際化臨床前標(biāo)準(zhǔn)的EAMG模型越來越受到科研人員的重視[2]。由于電鰩體內(nèi)AchR含量高、易獲取，因此Torpedo AchR(T-AchR) 成為制備EAMG 模型的最理想抗原，但國內(nèi)難以獲得T- AchR，且用于純化的α銀環(huán)蛇神經(jīng)毒素價(jià)格昂貴。我們依據(jù)Wu等[3]經(jīng)典方法并予以改進(jìn)，從國產(chǎn)電鰩的電器官提取、純化AchR蛋白。主要有以下幾個(gè)方面的改進(jìn)：首先，我們依照沈國光等的文獻(xiàn)報(bào)道，選用容易得到的中國南海海域黑斑雙鰭電鰩作為提取AchR的來源，有利于充分利用我國的自然資源；其次，在方法上，我們選用價(jià)格便宜且容易獲得的國產(chǎn)30 mg α-中華眼鏡蛇神經(jīng)毒素即可構(gòu)建達(dá)到較好效果的親和層析柱，與并在親和純化AchR時(shí)，選用國產(chǎn)的氨甲酰膽堿，并運(yùn)用超濾管濃縮和透析的方法，來獲得純化的蛋白。最后，我們從200 g濕電器官中得到21 mg 純化AchR蛋白，這蛋白得率明顯高于沈國光研究的蛋白得率,且本實(shí)驗(yàn)蛋白電泳圖結(jié)果與其報(bào)道的AchR的電泳圖有一定相似，但顯示為5個(gè)條帶，考慮國內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的純化受體蛋白電泳圖各不相同，這可能與不同實(shí)驗(yàn)室所用的方法、條件不一有關(guān)。且很可能是不同實(shí)驗(yàn)室所用的AchR的種屬來源不同，不同的受體來源，它們的亞基組成存在不同，多肽亞基的數(shù)目從1至4均有報(bào)道，但其中均含有一種分子量在40×103左右的亞基，例如Torpedo AchR的α亞基即由兩個(gè)肽鏈構(gòu)成，我們的AchR的電泳圖中最下面兩條帶可能是同一亞基的兩條肽鏈經(jīng)電泳分離后的圖像。之前也有研究驗(yàn)證該亞基可能是Ach的結(jié)合位點(diǎn)所在，在我們的電泳圖中也存在一條分子量在40×103左右的亞基，這與其他實(shí)驗(yàn)室結(jié)果一致。

有關(guān)從這種國產(chǎn)黑斑雙鰭電鰩中大量提取、純化獲得AchR，并用于構(gòu)建C57BL/6 EAMG小鼠模型的研究在國內(nèi)外尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用純化的國產(chǎn)電鰩乙酰膽堿受體作為抗原免疫動(dòng)物，成功建立了符合國際化的臨床前實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的EAMG小鼠模型。該模型發(fā)病早且重，發(fā)生率達(dá)到50%以上，與經(jīng)典的T- AchR造模接近。綜合動(dòng)物體內(nèi)的各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，用純化的AchR誘導(dǎo)EAMG模型，在發(fā)病機(jī)制、癥狀、電生理及免疫學(xué)改變方面與人 MG 十分相似。由此可見，這種方法造模效果好、原材料易獲得、可行性強(qiáng)、較經(jīng)濟(jì)， 適合我國的國情，可用于批量造模、機(jī)制研究以及MG的臨床前實(shí)驗(yàn)，適合 MG 具體發(fā)病機(jī)制、評(píng)估藥物有效性及治療機(jī)制等方面的研究。它對(duì)我國在EAMG的研究以及MG的臨床前實(shí)驗(yàn)國際化認(rèn)可方面將會(huì)產(chǎn)生積極意義。