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    甜葉菊總黃酮提取條件、成分與抗氧化活性研究

    2019-04-28 08:48:12童紅梅宋巧王保平郭敏彭濤張敏
    中國(guó)糖料 2019年2期
    關(guān)鍵詞:甜葉菊蘆丁黃酮類

    童紅梅,宋巧,王保平,郭敏,彭濤,張敏

    (甘肅醫(yī)學(xué)院,甘肅平?jīng)?744000)

    0 引言

    甜葉菊(Stevia rebaudiana)別名甜菊、糖草,屬菊科(Compositae),斯臺(tái)維亞屬,原產(chǎn)南美亞熱帶地區(qū)。全株都有甜味,其甜度是蔗糖的200~300倍,熱值僅為蔗糖1/300,是一種可替代蔗糖的天然甜味劑[1]。此外,甜葉菊莖葉中還含有大量蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、灰分、無(wú)氮浸出物和生物活性成分,因此,它可作為多種產(chǎn)品綜合開發(fā)利用的資源[2]。許多資料報(bào)道,甜葉菊有一定的藥理作用,有控制血糖,降低血壓,促進(jìn)新陳代謝的作用,亦有治療糖尿病,肥胖癥、調(diào)節(jié)胃酸和恢復(fù)神經(jīng)疲勞之功效[3]。

    近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究人員在甜葉菊中發(fā)現(xiàn)了一些黃酮成分,這些黃酮具有防治心血管疾病、降糖、降脂、鎮(zhèn)靜消炎、抗菌殺蟲、抗氧化延緩衰老、防癌抗腫瘤等作用,并可作為保健功能因子添加到食品、日化以及醫(yī)藥制品中[4-5]。但對(duì)甜葉菊的研究主要集中在甜菊糖苷的提取、研究和應(yīng)用方面,而對(duì)其黃酮類物質(zhì)的提取條件、成分檢測(cè)與抗氧化活性的方法研究報(bào)道不多[6-9]。

    本研究為了探究甜葉菊莖葉中總黃酮含量與其抗氧化活性之間的關(guān)系,以甘肅酒泉產(chǎn)的甜葉菊為原料,通過(guò)對(duì)其總黃酮從提取條件、成分、抗氧化活性的相關(guān)性等方面進(jìn)行分析研究,以期為甜葉菊黃酮類保健產(chǎn)品的開發(fā)研制提供基礎(chǔ)性研究資料。

    1 材料和方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 樣品

    甜葉菊選購(gòu)于酒泉市肅州區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),品種為惠農(nóng)1號(hào),特請(qǐng)肅州區(qū)農(nóng)業(yè)局農(nóng)技科人員進(jìn)行了鑒定。冷藏于0℃的冰箱中備用。

    1.1.2 試劑、儀器

    (1)試劑:圣草枸杞苷、蘆丁、山奈素、槲皮素、橙皮苷和Trolox的標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))。DPPH、TPTZ購(gòu)自Wako化學(xué)試劑公司(美國(guó)),HPLC洗脫的甲醇為色譜純(加拿大)。其他試劑均為分析純。

    (2)儀器:Agilent高效液相色譜儀-1290LC(美國(guó)),色譜柱 ODSC18 柱(4.6 mm×250 mm),中藥超聲提取機(jī)(JBT/C—YCL500T/3P,山東金百特),Heidolp旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)),微孔過(guò)濾器(天津雙吉實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)營(yíng)部),752E分光光度計(jì)(天津)。

    1.2 甜葉菊莖葉中黃酮類物質(zhì)提取條件的優(yōu)化

    1.2.1 樣品提取

    取冷凍樣品3 g,液氮中充分研磨后按照料液比加入80%乙醇。在室溫下用中藥超聲提取機(jī)提?。ū?),提取液過(guò)濾后經(jīng)Heidolp旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó))減壓蒸干,最后用1mL甲醇定容轉(zhuǎn)移至1.5mL的Eppendorf管中離心去掉沉淀,用針頭式微孔過(guò)濾器 (有機(jī)系,孔徑0.30μm)過(guò)濾,接取少量濾液以備HPLC分析和抗氧化活性檢測(cè),重復(fù)3次[10]。

    表1 甜葉菊黃酮提取方法正交因子Table 1 Orthogonal factors for flavonoids extraction from stevia

    1.2.2 正交試驗(yàn)

    按L1644進(jìn)行正交試驗(yàn)。以蘆丁提取率為指標(biāo),確定甜葉菊中黃酮提取最佳條件,并對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)。

    1.3 甜葉菊莖葉中總黃酮含量旳測(cè)定

    1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg,以25 mL甲醇為溶劑,溶解于容量瓶中,定容至刻度,搖勻,即得到濃度為0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液和甜葉菊莖葉中總黃酮樣液以甲醇為空白對(duì)照,在波長(zhǎng)358 nm測(cè)定吸光度[11]。

    準(zhǔn)確吸取0.4、0.8、1.2、1.6mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于10mL的容量瓶中,甲醇定容至刻度,以甲醇作空白,在358 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示,其線性回歸方程為y=30.064x+0.0029(R2=0.9998,y為吸光值,x為總黃酮質(zhì)量濃度mg/mL)。結(jié)果表明,在蘆丁質(zhì)量濃度0.005~0.020mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

    1.3.2 甜葉菊莖葉中總黃酮的提取和得率

    稱取甜葉菊渣在一定的條件下提取后,合并濾液并真空濃縮,干燥得粗總黃酮浸膏。取2~3 g粗黃酮浸膏,置于25mL容量瓶中,甲醇超聲溶解并定容至刻度線[7]。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,計(jì)算總黃酮得率。

    (1)式中m1為黃酮浸膏的質(zhì)量;m2為原料質(zhì)量;X為浸膏得率;(2)式中C為樣品黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL),V為樣品的體積/25mL;m3為測(cè)得率時(shí)稱取的粗黃酮浸膏質(zhì)量;Y為總黃酮得率。

    1.4 HPLC法測(cè)定甜葉菊中黃酮組分含量

    HPLC分析條件為:以0.075mmol檸檬酸緩沖液(含0.025mmol乙酸銨,溶液A)和甲醇(溶液B)為流動(dòng)相,采用甲醇梯度洗脫,洗脫梯度為:0~3min,溶液B≤35%;然后保持35%溶液B不變,洗脫7 min;10~13 min,溶液 B 35%~50%,保持 3min;14~24min,溶液 B 50%~80%,保持 10 min;25~30 min 保持 100%溶液 A 7 min后結(jié)束一個(gè)循環(huán),檢測(cè)波長(zhǎng)為268 nm,柱溫25℃,進(jìn)樣量20μL。按照HPLC保留時(shí)間進(jìn)行樣品定性,峰面積積分法進(jìn)行樣品定量。

    1.5 抗氧化活性分析

    1.5.1 FRAP法

    取100.0μL提取液與900.0μL Fe+-TPTZ反應(yīng)液(包括0.3 mmol/L醋酸鹽緩沖液25.0 mL;10.0 mmol/L TPTZ溶液2.5mL;20.0mmol/L FeCl3溶液2.5mL混勻,反應(yīng)10min,以80%乙醇為對(duì)照,Trolox為標(biāo)準(zhǔn),用分光光度計(jì)測(cè)定595 nm處的吸光值,計(jì)算抗氧化活性,以μg/g DW為單位[7]。重復(fù)3次。

    1.5.2 DPPH法

    取100.0μL提取液與 3.9 mL DPPH(60.0μmol/L)混勻,反應(yīng)6 h,以 VC為對(duì)照,以 Trolox當(dāng)量(TEAC)為標(biāo)準(zhǔn),用分光光度計(jì)測(cè)定515 nm處的吸光值,計(jì)算抗氧化活性(DPPH·清除率)[12],重復(fù)3次。

    DPPH·清除率=(A0-A1)×100/A1(A0代表空白,A1代表樣品檢測(cè)值)

    2 結(jié)果與分析

    2.1 甜葉菊黃酮提取條件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    對(duì)表2、3結(jié)果進(jìn)行直觀分析可知:1)RD>RB>RC>RA,影響甜葉菊黃酮物質(zhì)提取的主次因素為提取功率>提取溫度>提取時(shí)間>料液比;2)從各因素水平對(duì)甜葉菊黃酮物質(zhì)提取的影響來(lái)看,提取功率因素K1D<K2D<K3D<K4D,說(shuō)明提取功率450W對(duì)黃酮提取影響最大;在提取溫度這個(gè)因素中,K2B<K1B<K3B<K4B,說(shuō)明高溫85℃提取率高;在提取時(shí)間因素中 K1C<K3C<K2C<K4C,說(shuō)明提取時(shí)間 150 min 最好;在料液比因素中,K4A<K1A<K3A<K2A,料液比以1∶20為最好;3)由K值可知最佳工藝組合為A2B4C4D4。

    表2 甜葉菊莖葉總黃酮提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Orthogonal test results and analysis of extraction conditions of total flavonoids from stems and leaves of stevia

    2.2 重復(fù)實(shí)驗(yàn)

    用A2B4C4D4組合的工藝進(jìn)行了3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn),其蘆丁提取得率為0.863、0.874和0.885μg/g DW,均值為0.874μg/gDW,總黃酮提取率最高可達(dá)到0.88%。高于處理中的次高組合A3B3C2D4,低于處理中的最高組合A2B4C4D4,進(jìn)一步驗(yàn)證了最佳組合為A2B4C4D4。

    表3 甜葉菊莖葉總黃酮提取條件正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis of extraction conditions of total flavonoids from stem s and leaves of stevia

    2.3 甜葉菊總黃酮類成分的檢測(cè)

    用HPLC法,以檸檬酸-乙酸銨緩沖液和甲醇為流動(dòng)相,梯度洗脫,檢測(cè)了圣草枸杞苷、蘆丁、山奈素、槲皮素和橙皮苷類黃酮組分的標(biāo)準(zhǔn)品。該檢測(cè)體系分離效果好、精密度高,對(duì)類黃酮物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)限(S/N=3)均低于0.05μg/g。利用該體系本研究有效檢測(cè)了甜葉菊莖葉中黃酮的含量。利用峰面積累計(jì)積分法計(jì)算得到甜葉菊莖葉中圣草枸杞苷的含量為57.44μg/g,蘆丁的的含量為701.42μg/g,山奈素的含量為241.21 μg/g,槲皮素的含量為451.55μg/g,橙皮苷的含量為297.54μg/g。以蘆丁的含量為最高,槲皮素的含量其次,山奈素與橙皮苷含量較少,圣草枸杞苷極微。

    2.4 甜葉菊抗氧化活性與總黃酮類成分相關(guān)性分析

    以FRAP和DPPH法檢測(cè)甜葉菊總黃酮的含量與抗氧化活性的相關(guān)性,分光光度法檢測(cè)其抗氧化活性高達(dá)10.02mg/g DW;用甜葉菊中黃酮的總量為橫坐標(biāo),以抗氧化活性為縱坐標(biāo),用抗壞血酸做對(duì)照,結(jié)果顯示,二者呈顯著的正相關(guān)性。說(shuō)明甜葉菊中黃酮類物質(zhì)抗氧化活性隨著黃酮含量的增加而增強(qiáng),見表4。

    表4 甜葉菊抗氧化活性與黃酮類含量相關(guān)性分析Table 4 Correlation between antioxidant activity and flavonoids content in stevia

    3 結(jié)論與討論

    3.1 甜葉菊總黃酮類物質(zhì)提取的條件

    正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:影響甜葉菊中黃酮物質(zhì)提取的主次因素為提取功率、提取溫度、提取時(shí)間、料液比;最佳提取條件為用80%乙醇提取功率450W,料液比1∶20,提取時(shí)間150min,溫度85℃,提取3次,依據(jù)總黃酮得率計(jì)算得到甜葉菊莖葉中黃酮提取率可達(dá)到0.88%。該結(jié)果與王紅玉報(bào)道甜葉菊中黃酮的得率(4.21%)低[8],比方浩斌所測(cè)得率(0.62%)高[9]。這可能與甜葉菊的品種、產(chǎn)地、提取條件不同有關(guān)。提取條件的優(yōu)選可為甘肅酒泉甜葉菊黃酮類保健品的開發(fā)研究提供基礎(chǔ)資料。

    3.2 甜葉菊總黃酮類物質(zhì)的成分

    HPLC法檢測(cè)甜葉菊莖葉中5種黃酮成分,以蘆丁的含量(701.42μg/g)為最高,槲皮素含量(451.55μg/g)居其次,橙皮苷含量(297.54 μg/g)與山奈素含量(241.21 μg/g)較少,圣草枸杞苷含量(57.44 μg/g)極微。甜葉菊作為一種重要的糖料作物,在我國(guó)已經(jīng)有了大面積種植,甘肅酒泉肅州區(qū)氣候干燥、光照充足、晝夜溫差大,積溫高,十分有利于甜葉菊的生長(zhǎng),其甜菊糖苷、總黃酮的含量較高。其栽培條件、生長(zhǎng)環(huán)境、品種特性對(duì)甜葉菊總黃酮含量和成分的相關(guān)性[13],有待進(jìn)一步的探索研究。

    3.3 甜葉菊總黃酮類抗氧化活性與含量相關(guān)性分析

    利用FRPD和DPPH法評(píng)價(jià)甜葉菊莖葉總黃酮類抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)甜葉菊中總黃酮類物質(zhì)抗氧化活性高達(dá)10.02mg/g DW;綜合兩種評(píng)價(jià)方法其黃酮含量與抗氧化活性二者之間呈顯著的正相關(guān)性 (R=0.769~0.792)。在此基礎(chǔ)上,今后研究的重點(diǎn)是開展甜葉菊黃酮的生理功能分子機(jī)理探討,進(jìn)一步闡明甜葉菊黃酮成分的藥理作用,將是甜葉菊黃酮物質(zhì)研究與綜合開發(fā)利用的主要方向[14]。近年來(lái),提取甜葉菊糖苷產(chǎn)生了大量的甜葉菊廢渣,利用廢棄甜葉菊渣提取黃酮類物質(zhì)的研究,既是甜葉菊產(chǎn)業(yè)鏈延伸的有效途徑,又是開發(fā)天然、無(wú)毒、無(wú)副作用植物性功能食品、保健藥品的有益探索,具有廣闊的開發(fā)前景。

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