骨硬化蛋白單克隆抗體單用與聯(lián)合黃芪對(duì)去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松療效比較

孫帥波，陳少敏，林晉體，周呈偉，水小龍

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.骨科；2.康復(fù)科）

骨質(zhì)疏松癥是一種骨密度降低，骨顯微結(jié)構(gòu)改變從而導(dǎo)致骨骼的強(qiáng)度下降，易導(dǎo)致骨折的一種骨骼疾病[1-2]。近年來骨質(zhì)疏松患者逐年增加，骨質(zhì)疏松相關(guān)性骨折已成為一大難題，對(duì)臨床醫(yī)師來說防治骨質(zhì)疏松已經(jīng)是一項(xiàng)艱巨而富有挑戰(zhàn)的任務(wù)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)可以使用骨硬化蛋白單克隆抗體（sclerostin-antibody，Scl-Ab）拮抗骨硬化蛋白引起的骨形成負(fù)向調(diào)節(jié)作用[5]，從而抑制骨丟失來治療骨質(zhì)疏松，其療效較好[6-7]。但大量長(zhǎng)期使用Scl-Ab后可能出現(xiàn)一些并發(fā)癥，還可能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)Scl-Ab的相關(guān)抗體，使藥物療效降低[8]。研究顯示黃芪（Astragalus membranaceus）可以使血清鈣、磷、骨鈣素及堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平顯著升高。黃芪還可以減少雌激素下降所引起的骨質(zhì)疏松癥患者的骨量丟失，其機(jī)制主要是通過減少骨質(zhì)破壞、增加骨形成、抑制骨吸收從而達(dá)到骨量的增加[9-10]。本研究比較Scl-Ab聯(lián)合黃芪與單用Scl-Ab治療去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松的療效。

1 材料和方法

1.1 材料 Scl-Ab（美國MSD公司）、黃芪液（從膜莢黃芪中提取）[11]、手術(shù)操作器械（美國Stryker醫(yī)療器械公司）、Micro-CT（型號(hào)SkyScan1176，荷蘭）。硬組織切片機(jī)（型號(hào)EXAKT300，德國）、鈣黃綠素及四環(huán)素（美國Sigma公司）、Image-Pro Plus圖像分析儀（美國Media Cybernetics公司）、顯微鏡（ZEISS Axio Imager M1，德國）。

1.2 方法

1.2.1 建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型及治療：3～4個(gè)月齡健康雌性SD大鼠30只，體質(zhì)量200～240 g。從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司購入，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-005。30只大鼠隨機(jī)分為手術(shù)組（OVX組，n=25）和假手術(shù)組（Sham組，n=5）。手術(shù)前30只大鼠均稱體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量以10%水合氯醛3 mL/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉起效后再在大鼠背側(cè)正中線中下1/3處行一長(zhǎng)約2 cm縱行切口，逐層鈍性分離皮下組織至脊柱旁開0.5 cm處，撥開肌肉組織、顯露卵巢，OVX組輕提卵巢結(jié)扎輸卵管卵巢交界處，切下雙側(cè)卵巢，然后縫合關(guān)閉創(chuàng)口，Sham組直接縫合關(guān)閉創(chuàng)口。術(shù)后3 d給予肌注青霉素（2.5萬U/kg）預(yù)防感染。正常飼養(yǎng)12周后2組各取5只大鼠處死并取股骨行Micro-CT檢測(cè)，用于檢測(cè)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型是否建立。建模成功后將剩下的OVX組大鼠隨機(jī)的分成2組：Scl-Ab組、Scl-Ab+黃芪組。Scl-Ab組：給予Scl-Ab皮下注射（25 mg/kg，每周2次），并且每天給予200 mg/kg 0.9氯化鈉溶液灌胃，直至12周[11-12]；Scl-Ab+黃芪組：Scl-Ab皮下注射（12.5 mg/kg，每周2次），同時(shí)每天給于200 mg/kg黃芪液灌胃，直至12周。每周稱體質(zhì)量并調(diào)整藥物劑量。分別在治療第71天和第81天，所有大鼠腹腔注射鈣黃綠素及四環(huán)素（15 mg/kg）[13]。

1.2.2 Micro-CT檢測(cè)：藥物治療12周后處死大鼠，取下所有大鼠雙側(cè)股骨，剔除軟組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗后，馬上用4%的多聚甲醛固定用于Micro-CT檢測(cè)。將左側(cè)股骨置于儀器上，股骨遠(yuǎn)端骺線下方為掃描興趣區(qū)。CT掃描后進(jìn)行3D重建，在去除骨皮質(zhì)影像圖案后進(jìn)行定量分析。獲得大鼠股骨遠(yuǎn)端骺線下方檢測(cè)區(qū)域骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)：骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb．Th）、骨小粱分離度（trabecular spacing，Tb．Sp）、骨小粱數(shù)量（trabeculae number，Tb．N）、連接密度（connective density，Conn.D.）及股骨骨密度（bone mineral density，BMD）。

1.2.3 硬組織切片：待所有股骨經(jīng)過Micro-CT檢測(cè)后，用4%多聚甲醛固定所有標(biāo)本，梯度乙醇脫水，甲基丙烯酸甲酯包埋。隨后用硬組織切片機(jī)沿股骨縱軸冠狀面將組織包埋塊進(jìn)行切片，切片厚度為30～40 μm左右；隨后進(jìn)行清洗、打磨、拋光、Masson染色，使用光鏡及熒光顯微鏡觀察鈣黃綠素條帶，并用Image-Pro Plus 6.0全自動(dòng)圖像分析儀計(jì)算骨礦化沉積率（mineralization deposition rate，MAR）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料且符合正態(tài)分布用來表示，2組計(jì)量資料間比較用成組t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨質(zhì)疏松模型的構(gòu)建 術(shù)后12周大鼠的Micro-CT檢測(cè)結(jié)果，Sham組骨小梁更粗，骨質(zhì)也更加緊密，股骨BMD為（230.89±27.63）mg/cm2，而OVX組為（158.24±25.67）mg/cm2。與Sham組比，OVX組大鼠的BMD降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明建模成功，見圖1。

2.2 2組大鼠BMD的比較 Scl-Ab組和Scl-Ab+黃芪組各1只大鼠因麻醉過量、手術(shù)創(chuàng)傷和傷口感染死亡；最終共18只大鼠進(jìn)入檢測(cè)評(píng)估。藥物使用12周時(shí)大鼠股骨的Micro-CT檢測(cè)，Scl-Ab組股骨BMD為（176.78±28.23）mg/cm3，Scl-Ab+黃芪組股骨BMD為（215.79±27.86）mg/cm3；與Scl-Ab組比，Scl-Ab+黃芪組骨量增多，骨質(zhì)更緊密，股骨BMD增加了22.07%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 2組Micro-CT三維重建圖像分析及骨微觀參數(shù)的比較 Scl-Ab+黃芪組Tb.N的數(shù)量要明顯多于Scl-Ab組，而且骨小梁更粗、聯(lián)系緊密，見圖2。與Scl-Ab組比，骨微觀參數(shù)也顯示Scl-Ab+黃芪組有更高的BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D和更低的Tb.Sp，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.4 2組硬組織切片結(jié)果的比較 治療12周后Scl-Ab+黃芪組硬組織切片中股骨遠(yuǎn)端Tb.N的量明顯多于Scl-Ab組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且骨小梁排列更有規(guī)律、更緊密。熒光共聚焦顯微鏡下觀察進(jìn)一步證實(shí)了Micro-CT的結(jié)果。用熒光共聚焦顯微鏡經(jīng)Image-Pro Plus 6.0計(jì)算Scl-Ab組MAR為（0.80±0.09），Scl-Ab+黃芪組為（1.56±0.10），2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖2 2組大鼠股骨干骺端Micro-CT三維重建結(jié)果

表1 治療12周時(shí)2組大鼠左股骨干骺端骨微觀參數(shù)比較（每組n=9，

表1 治療12周時(shí)2組大鼠左股骨干骺端骨微觀參數(shù)比較（每組n=9，

與Scl-Ab組比：aP＜0.05

Scl-Ab+黃芪組 2.987±0.115a 0.174±0.016a 0.401±0.013a 0.345±0.037a 89.421±13.564a Scl-Ab組 2.270±0.090 0.123±0.011 0.198±0.016 0.610±0.129 46.723± 9.120

圖3 用藥物12周時(shí)Scl-Ab組和Scl-Ab+黃芪組大鼠股骨干骺端Masson染色和股骨四環(huán)素-鈣黃綠素標(biāo)記結(jié)果

3 討論

引起絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的主要原因是雌激素的缺乏，屬于高轉(zhuǎn)化型[14]。雌激素的不足使得成骨和破骨的平衡被打破，會(huì)直接影響骨質(zhì)，最終可能導(dǎo)致病理性骨折[15-16]。目前用于治療骨質(zhì)疏松的藥物很多，但都有自身的局限性。如二膦酸鹽類人體吸收率低，腎功能不全的患者者或有血栓栓塞性疾病的患者不適合使用；甲狀旁腺素類使用不方便，且不能用于骨骺線尚未閉合的兒童及青少年患者[17]；地諾單抗則容易導(dǎo)致下頜骨壞死[18]。Scl-Ab是一種非常有潛力的藥物，目前治療效果較好[19]。但也有人提出Scl-Ab存在一定不良反應(yīng)，可能發(fā)生同Van Buchem病和骨硬化病類似的癥狀，如因?yàn)轱B骨增生從而壓迫到顱神經(jīng)、脊柱椎管狹窄癥或者椎間孔增生壓迫到周圍神經(jīng)等癥狀。另一方面，臨床前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用Scl-Ab后受試者體內(nèi)的血清鈣會(huì)輕度降低，甲狀旁腺素會(huì)隨之代償性升高，血清鈣又會(huì)回到正常值。這種情況對(duì)于普通患者的風(fēng)險(xiǎn)較低，但如果是腎臟疾病或維生素D缺乏癥的患者則存著一定風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)對(duì)一些免疫系統(tǒng)紊亂的患者來講，可能會(huì)影響Scl-Ab的藥代動(dòng)力學(xué)或增加藥物毒性，又或者可能使機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，降低藥效[10]。

黃芪為蒙古黃芪、膜莢黃芪的根，性微溫，味甘，歸肺脾經(jīng)，助氣，壯筋骨，具有健脾補(bǔ)中、益氣固表、升陽舉陷、斂汗固脫之功[20]。文獻(xiàn)記載黃芪還具有補(bǔ)腎作用，也有防治骨量丟失及骨質(zhì)疏松的作用[21]。黃芪可以顯著提高血中磷、鈣、骨鈣素及ALP。

本研究通過對(duì)大鼠去勢(shì)來建立骨質(zhì)疏松模型，一般狀況下飼養(yǎng)3個(gè)月后經(jīng)Micro-CT檢測(cè)股骨BMD及骨量減少情況來確定骨質(zhì)疏松建模是否成功。通過黃芪和Scl-Ab的聯(lián)合使用和Scl-Ab單獨(dú)使用分別來治療去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松，藥物治療12周后處死所有大鼠并取股骨行硬組織切片、Micro-CT等評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn)，在用藥12周后Scl-Ab+黃芪組可以看見更多的骨小梁，且小梁之間排列更整齊、更緊密，而Scl-Ab組相對(duì)來講股骨干骺端骨小梁排列較稀疏，且部分骨小梁之間聯(lián)系欠緊密。用Micro-CT測(cè)定各組的BMD發(fā)現(xiàn)Scl-Ab+黃芪組要明顯高于Scl-Ab組。Scl-Ab+黃芪組與Scl-Ab組相比較，BV/TV、Tb.N、Tb.Th都增高，而Tb.Sp降低；Scl-Ab+黃芪組的MAR也明顯高于Scl-Ab組，這表明黃芪和Scl-Ab的聯(lián)合使用相較于單用Scl-Ab可以明顯增加去勢(shì)大鼠股骨BMD，提高股骨干骺端骨小梁的質(zhì)量，加速骨質(zhì)的礦化，對(duì)提高骨量效果更顯著。

本研究提示黃芪和Scl-Ab的聯(lián)合使用相較于單用Scl-Ab在抗骨質(zhì)疏松方面效果更好。聯(lián)合應(yīng)用黃芪可以降低Scl-Ab的使用量，有助于降低使用Scl-Ab時(shí)所帶來的不良反應(yīng)，并且提高了治療效果。