沉默信息調(diào)節(jié)因子3在丹酚酸A抗紫外線誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激性損傷中的作用及機(jī)制

李霞，王彥方，陳戰(zhàn)巧，俞頌平

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 眼科，浙江 麗水 323000）

老年性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是一種以布魯赫膜和視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）之間玻璃膜疣堆積為特征、以視力不可逆性下降為表現(xiàn)的老年性眼部疾病[1]。研究認(rèn)為AMD的發(fā)生與新生血管形成、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激性損傷、自身免疫反應(yīng)等有關(guān)[1]。過(guò)度紫外線照射已被認(rèn)為是AMD發(fā)生的外在因素，能夠誘發(fā)RPE細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激性損傷，且清除細(xì)胞內(nèi)ROS，能夠有效降低紫外線誘導(dǎo)的RPE損傷[2-3]。我們前期研究證實(shí)丹酚酸A（salvianolic acid A，Sal A）作為一種氧化清除劑[4-5]，對(duì)紫外線誘導(dǎo)RPE氧化應(yīng)激性損傷具有保護(hù)作用[3]，但其具體分子機(jī)制仍未完全明確。沉默信息調(diào)節(jié)因子3（silent information regulator 3，SIRT3）是一種NAD+依賴的 III型組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC），在人類RPE細(xì)胞中呈高表達(dá)，參與RPE的多種生物學(xué)功能，尤其與RPE氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)[6]。本研究進(jìn)一步探討SIRT3在Sal A抗紫外線誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，為應(yīng)用Sal A預(yù)防和治療AMD提供科學(xué)根據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 Sal A（貨號(hào)：96574-01-5）購(gòu)自上海阿拉丁公司，DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗、FBS、胰蛋白酶購(gòu)自英國(guó)Gibco公司，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽、二甲基亞砜購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；SIRT3、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）、Bax、bcl-2、cleaved-Caspase3、Cyt c和β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司，CuZn/Mn-SOD活性檢測(cè)試劑盒（WST-8法）和Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司，si-SIRT3、si-RNA購(gòu)買于美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將人ARPE-19細(xì)胞（購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）培養(yǎng)種植于含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取1×105接種于96孔板或1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，將ARPE-19細(xì)胞按照不同處理?xiàng)l件分組：對(duì)照（Sal A）組、UV（30 mJ/cm2紫外線照射）組、5 μmol/L Sal A（5 μmol/L Sal A預(yù)處理30 min后30 mJ/cm2紫外線照射）組、25 μmol/L Sal A（25 μmol/L Sal A預(yù)處理30 min后30 mJ/cm2紫外線照射）組、50 μmol/L Sal A（50 μmol/L Sal A預(yù)處理30 min后30 mJ/cm2紫外線照射）組。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按細(xì)胞密度為5×105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，將5 μL陰性si-RNA和si-SIRT3質(zhì)粒與5 μL Lipofectamine 2000試劑（美國(guó)Invitrogen公司）混合于200 μL無(wú)FBS、無(wú)雙抗培養(yǎng)基，加入ARPE-19細(xì)胞，置于37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜，次日更換含有10% FBS、雙抗的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按照轉(zhuǎn)染情況將細(xì)胞分為對(duì)照（Sal A）組、UV（30 mJ/cm2紫外線照射）組、Sal A+UV（50 μmol/L Sal A預(yù)處理30 min后30 mJ/cm2紫外線照射）組、Sal A+UV+陰性si-RNA（經(jīng)si-RNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用50 μmol/L Sal A預(yù)處理30 min后，30 mJ/cm2紫外線照射）組、Sal A+UV+si-SIRT3（經(jīng)si-SIRT3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，用50 μmol/L Sal A預(yù)處理30 min后30 mJ/cm2紫外線照射）組。

1.4 細(xì)胞活性檢測(cè) 將1×105個(gè)ARPE-19細(xì)胞接種于96孔板中，按照分組方法處理，并繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，37 ℃恒溫箱孵育4 h，棄去上清液，加入二甲基亞砜120 μL終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀中檢測(cè)各孔的吸光光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取1×106個(gè)細(xì)胞接種至6孔板中，經(jīng)處理48 h后，收集細(xì)胞懸液，以1 500 r/min離心，棄上清，再次重懸、離心、棄上清后，加入500 μL緩沖液，吹散細(xì)胞。將5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI依次加入、混勻，室溫下避光孵育15 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.6 ROS水平檢測(cè) 采用DCFH-CA方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。將細(xì)胞密度為1×106個(gè)/孔的ARPE-19接種于6孔板，經(jīng)處理48 h后，按照ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用終濃度為10 μmol/L的DCFH-CA重懸細(xì)胞，置入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，以無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次后，轉(zhuǎn)至流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度。

1.7 SOD2活性檢測(cè) 采用WST-8法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD2活性。將細(xì)胞密度為1×106個(gè)/孔的ARPE-19接種于6孔板，經(jīng)處理后，預(yù)冷的PBS洗滌2次。收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的PBS勻漿，取勻漿液4 ℃離心，收集上清液。經(jīng)BCA法進(jìn)行蛋白定量后備用。按照CuZn/Mn-SOD活性檢測(cè)試劑盒（WST-8法）說(shuō)明書(shū)配制WST-8/酶液和反應(yīng)啟動(dòng)液。取20 μL樣品，依次加入160 μL WST-8/酶液和20 μL反應(yīng)啟動(dòng)液，37 ℃孵育30 min。在波長(zhǎng)為450 nm時(shí)，測(cè)定吸光度。

1.8 Western blot檢測(cè) 各組細(xì)胞用預(yù)冷PBS漂洗3次后，加入150 μL RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解15 min，EP管收集細(xì)胞裂解液，置于4 ℃離心機(jī)，12 000 r/min離心15 min，取上清。按照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白定量，取20 μg總蛋白用聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上；經(jīng)3%脫脂奶粉封閉1 h，加入適量比例的SIRT3、SOD2一抗，置于4 ℃冰箱過(guò)夜。用 PBST緩沖液洗膜后，按1：20 000加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。再次洗膜后，用ECL試劑顯影。

1.9 RT-qPCR檢測(cè) 總RNA用Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）抽提，即加入1 mL Trizol試劑吹下細(xì)胞，加入200 μL氯仿，EP管內(nèi)靜置15 min后，置于4 ℃離心機(jī)，12 000 r/min離心15 min。取上清，用1 mL 75%乙醇洗滌，再次離心，棄上清、干燥后，取RNA沉淀物。mRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照PrimeScript RT Master Mix（大連Takara公司）說(shuō)明書(shū)合成cDNA。進(jìn)行PCR檢測(cè)，將反轉(zhuǎn)錄物用SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒（大連Takara公司）在ABI500 PCR儀上進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增、檢測(cè)。SIRT3引物：上游5’-CGCTAAACTTCTCCCGGGTT-3’，下游5’-ACACTAGTCCT CGCCAAACG-3’；SOD2引物：上游5’-GCCTCCCTGACCTG CCTTAC-3’；下游： 5’-GTGATTGATATGGCCCCCG-3’；GAPDH引物：上游5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；使用2-△△CT法分析SIRT3、SOD2 mRNA表達(dá)情況。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sal A抑制紫外線誘導(dǎo)SIRT3表達(dá) 與對(duì)照組比，UV組SIRT3表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；與UV組比，5、25、50 μmol/L Sal A處理后，細(xì)胞內(nèi)SIRT3表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 Sal A抗UV抑制SIRT3蛋白和mRNA的表達(dá)

2.2 SIRT3在Sal A抗紫外線誘導(dǎo)RPE細(xì)胞損傷的作用 與對(duì)照組相比，UV組細(xì)胞存活率明顯下降（P＜0.05）；與UV組相比，Sal A+UV組細(xì)胞存活率明顯增加（P＜0.05）；與Sal A+UV組相比，Sal A+陰性si-RNA+UV組細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Sal A+UV+si-SIRT3組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05）；與Sal A+陰性si-RNA+UV組相比，Sal A+UV+si-SIRT3組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 SIRT3在Sal A抗紫外線誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞凋亡的作用 與對(duì)照組相比，UV組細(xì)胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、Cyt c表達(dá)量增加，Bcl-2表達(dá)量下降（P＜0.05）；與UV組相比，Sal A+UV組細(xì)胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、Cyt c表達(dá)量降低，Bcl-2表達(dá)量增加（P＜0.05）；與Sal A+UV組相比，Sal A+陰性si-RNA+UV組細(xì)胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、Cyt c表達(dá)量降低（P＜0.05），Bcl-2表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Sal A+UV+si-SIRT3組細(xì)胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、Cyt c表達(dá)量降低，Bcl-2表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）；與Sal A+陰性si-RNA+UV組相比，Sal A+UV+si-SIRT3組細(xì)胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、Cyt c表達(dá)量明顯增加，Bcl-2表達(dá)量下降（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 SIRT3在Sal A抗紫外線誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用 與對(duì)照組相比，UV組ROS水平升高，SOD2活性、蛋白和mRNA表達(dá)下降（P＜0.05）；與UV組相比，Sal A+UV組ROS水平降低，SOD2活性、蛋白和mRNA表達(dá)量增加（P＜0.05）；與Sal A+UV組相比，Sal A+陰性si-RNA+UV組ROS水平、SOD2活性、蛋白和mRNA表達(dá)量無(wú)明顯差異（P＞0.05），Sal A+UV+si-SIRT3組ROS水平升高，SOD2活性、蛋白和mRNA表達(dá)量下降（P＜0.05）；與Sal A+陰性si-RNA+UV組相比，Sal A+UV+si-SIRT3組ROS水平增加，SOD2活性、蛋白和mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖2 SIRT3在Sal A抗UV抑制細(xì)胞存活的作用

3 討論

圖3 SIRT3在Sal A抗UV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用

圖4 SIRT3在Sal A抗UV誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的作用

SIRT3定位于線粒體基質(zhì)，能促使多種抗氧化物酶去乙?；?，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，維持細(xì)胞正常生理功能[7]。SIRT3高表達(dá)于視網(wǎng)膜組織，主要分布于內(nèi)外叢狀層和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞[6，8]，參與抵抗細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和視網(wǎng)膜血管新生的調(diào)控[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)胰高血糖素樣肽I類似物能夠增加SIRT3的表達(dá)，抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的R28細(xì)胞損傷作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)UV照射后，細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞凋亡，Bax、cleaved-Caspase3、cyt c表達(dá)量增加，而SIRT3、Bcl-2表達(dá)量顯著下降；經(jīng)Sal A預(yù)處理后，細(xì)胞存活率增加，細(xì)胞凋亡，cleaved-Caspase3、Cyt c表達(dá)量下降，SIRT3、Bcl-2表達(dá)量顯著增加；用si-SIRT3干擾后，Sal A抗UV誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的作用明顯減弱，表現(xiàn)為：與Sal A+UV組相比，Sal A+si-SIRT3+UV組細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、cyt c表達(dá)量增加，Bcl-2表達(dá)量下降；提示Sal A的抗UV誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷與其增加SIRT3表達(dá)有關(guān)。

SOD2作為位于線粒體的抗氧化物酶，能夠?qū)⒊蹼x子轉(zhuǎn)化成過(guò)氧化氫和水，維持細(xì)胞內(nèi)ROS平衡[12]。SIRT3能直接與SOD2的乙?；稽c(diǎn)結(jié)合，使SOD2去乙酰化，增加SOD2活性，形成SIRT3-SOD2通路，是重要的抗氧化通路[13-15]。QIU等[14]發(fā)現(xiàn)SIRT3使SOD2去乙?；黾蛹?xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激性的耐受性。CHEN等[15]表明木褪黑素能夠激活SIRT3介導(dǎo)的SOD2活性，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。LIU等[16]證實(shí)外源性增加SIRT3表達(dá)，SOD2的賴氨酸68位點(diǎn)乙?；挚固悄虿⊙趸瘧?yīng)激性損傷。本研究中，與UV組相比，Sal A+UV組SIRT3表達(dá)量明顯增加，SOD2活性、蛋白和mRNA表達(dá)量也明顯增加，提示Sal A增加SOD2活性及表達(dá)可能與其誘導(dǎo)SIRT3表達(dá)有關(guān)。經(jīng)si-SIRT干擾后，與Sal A+UV組相比，Sal A+si-SIRT3+UV組的SOD2活性、蛋白和mRNA表達(dá)量均明顯下降，說(shuō)明SIRT3可能是Sal A增加SOD2表達(dá)量和活性的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

綜上所述，紫外線照射下，ARPE-19細(xì)胞內(nèi)SIRT3表達(dá)量下降，SOD2的表達(dá)、活性降低，細(xì)胞氧化應(yīng)激性損傷被激發(fā)，Sal A能夠增加細(xì)胞內(nèi)SIRT3的表達(dá)量，進(jìn)而增加SOD2的活性和表達(dá)量，抵抗UV誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激性損傷。