瓊脂糖/ε-PLL/CHA屏障膜的制備及其抑菌能力和生物性能評價

何智琪，錢秋萍，鄧輝，胡榮黨

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 正畸科，浙江 溫州 325027；2.溫州生物材料與工程研究所 生材事業(yè)部，浙江 溫州 325000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 牙周科，浙江 溫州 325027）

近年來用引導(dǎo)組織再生（guided tissue regeneration，GTR）術(shù)修復(fù)牙周組織缺損在臨床開展廣泛。其中屏障膜在GTR術(shù)中扮演著重要角色。最常用的屏障膜是可吸收性膜，如聚合物膜[1-2]、膠原膜和組織膜[3]等，但都存在著缺乏骨誘導(dǎo)活性和抗菌能力不足等的缺點。因此以簡單工藝制備具有一定促進(jìn)牙周組織再生及抗菌性能的屏障膜具有重要意義。

碳酸羥基磷灰石（carbonated hydroxyapatite，CHA）的成分與自然骨相近，相較于傳統(tǒng)的羥基磷灰石（hydroxyaptite，HA）具有更好的生物相容性，更易于新骨組織的生長[4-5]。ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PLL）是由賴氨酸殘基ε-氨基和α-羧基形成的單體聚合物。研究表明ε-PLL在具有良好生物安全性的同時，具有廣譜抗菌活性[6-7]。為此，本研究采用具有高親和及多孔惰性的瓊脂糖水凝膠包載CHA和ε-PLL以通過簡單工藝制備具備抗菌作用的GTR屏障膜。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：瓊脂糖、ε-PLL（上海麥克林公司），無水氯化鈣、無水磷酸二氫鈉、尿素、無水乙醇（上海阿拉丁公司），DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），Live/Dead染色試劑盒（美國Thermo公司），LB固體培養(yǎng)基（北京索萊寶公司），金黃色葡萄球菌（美國ATCC，25923）。

1.1.2 儀器：IKA T10分散機（上海珂淮儀器有限公司）、流變儀（美國TA公司）、傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）（德國布魯克公司）、掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）（日本日立公司）、正置顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 方法

1.2.1 CHA的制備：采用一步水熱法合成。將摩爾比例在Ca/P=1.67的磷酸二氫鈉（NaH2PO4），氯化鈣（CaCl2）各自溶解在2 mL的水中，將以上2種材料制備成水溶液。然后，將CaCl2溶液滴加到NaH2PO4溶液中，并劇烈攪拌10 min后在溶液中加入0.45 mol/L的尿素，以在長時間水熱反應(yīng)中產(chǎn)生氨氣調(diào)節(jié)pH，最后加入6 mL乙醇，使乙醇與水的比例控制在3∶1，將懸浮液放置于180 ℃中24 h以制備中空狀的CHA。

1.2.2 FTIR分析：將CHA搗碎制成細(xì)小粉末，并制備成粉末壓片，通過FTIR檢測材料的紅外吸收光譜，以確證CHA制備成功。

1.2.3 屏障膜的制備：將75 mg瓊脂糖加入到5 mL水中，加熱至90 ℃以上使其充分溶解，制備濃度為15 mg/mL的瓊脂糖水溶液。將50 mg的ε-PLL加入使其濃度為10 mg/mL。隨后加入質(zhì)量/體積比（w/v）依次為1%、5%、10%的CHA，采用分散機充分混勻3 min后加入到模板中，直到溫度下降到35～40 ℃瓊脂糖凝固成膜。

1.2.4 屏障膜形貌表征：取屏障膜樣品，冷凍處理后置于凍干機凍干。通過濺射金實現(xiàn)表面導(dǎo)電，最后SEM觀察。

1.2.5 屏障膜機械性能檢測：制備直徑8 mm，高1 mm的屏障膜，流變儀器檢測損耗模量和儲存模量。

1.2.6 牙周膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)：本研究所用的原代人牙周膜細(xì)胞樣本采集自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診患者因為阻生而拔除的第三磨牙。所選患者符合如下標(biāo)準(zhǔn)：年齡范圍為18～30歲，身體健康，無全身系統(tǒng)性疾病史，無家族遺傳性疾病史，口腔衛(wèi)生良好，無吸煙史。所收集第三磨牙符合如下標(biāo)準(zhǔn)：無牙體缺損、齲壞，牙齒所在部位無牙齦炎和牙周炎。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，事先告知患者并簽署知情同意書。囑患者術(shù)前漱口水含漱，常規(guī)消毒。第三磨牙一經(jīng)拔除，立即用預(yù)冷的雙抗PBS（含100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素）沖去牙根表面血漬，后浸沒于含雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，保持低溫，即刻送實驗室。無菌刀刮取根中1/3部分的牙周膜組織，剪碎后轉(zhuǎn)移至無菌EP管中，加入0.3% I型膠原酶100 μL消化組織塊，37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入雙抗PBS吹打混勻，繼續(xù)1 000 r/min離心5 min后棄上清。在管內(nèi)加入1 mL完全培養(yǎng)基（含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基），吹打均勻后接種至T25培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞長至70%到80%時消化傳代，采用抗角蛋白和抗波形蛋白染色鑒定細(xì)胞來源，取3～5代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.7 屏障膜生物相容性檢測：首先將屏障膜進(jìn)行滅菌處理，經(jīng)紫外線照射30 min后75%乙醇浸泡2 h，無菌PBS溶液反復(fù)沖洗并吸干。每孔中加入300 μL DMEM培養(yǎng)基，浸泡過夜，吸干后置于48孔板。選擇3～5代牙周膜細(xì)胞，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基配成濃度為5×104/mL的細(xì)胞懸液。以300 μL/孔將細(xì)胞懸液接種于置有屏障膜的孔板內(nèi)，放于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育14 d（每3 d換液），按試劑盒說明進(jìn)行細(xì)胞Live/Dead染色，在熒光顯微鏡下觀察。綠色熒光標(biāo)記的是活細(xì)胞，紅色熒光標(biāo)記的是死細(xì)胞。

1.2.8 屏障膜生物體外抗菌性能檢測：取200 μL濃度為106CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液接種于LB固體培養(yǎng)基。將直徑8 mm屏障膜圓片放于其上，標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，游標(biāo)卡尺測量屏障膜周圍抑菌環(huán)寬度。

2 結(jié)果

2.1 CHA的制備 在10 000倍的SEM下我們可見到中空柱狀的CHA（見圖1A）。通過紅外光譜我們可以看到PO43-基團（1 040、960、603、570和437 cm-1），與HA的標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜特征峰基本吻合。此外，還看到在1 470、1 461、1 418及873 cm-1處CO32-的特征峰，說明成功合成CHA（見圖1B）。

2.2 屏障膜的制備 SEM結(jié)果證實瓊脂糖/ε-PLL膜內(nèi)部有明顯互通的大孔徑的天然孔隙。隨著CHA濃度增高，瓊脂糖/ε-PLL膜的天然孔隙孔徑逐漸減小，且在CHA濃度為10% w/v時，CHA部分團聚呈球狀（見圖2）。

2.3 機械性能 采用流變儀檢測儲存模量G’和損耗模量G”。在不加入CHA時，G’值為14 kPa，隨著CHA濃度的增加，G’明顯上升，在含有10%CHA時，G’超過34 kPa（見圖3）。證實CHA提升瓊脂糖/ε-PLL膜的機械性能。

圖2 不同CHA濃度的屏障膜SEM圖

圖3 含有不同濃度CHA的屏障膜的機械性能

2.4 生物相容性 利用前期培養(yǎng)和鑒定的人牙周膜細(xì)胞，我們通過Live/Dead染色結(jié)果來檢測屏障膜的生物相容性。在屏障膜上培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞14 d以后，只可見很少量的死細(xì)胞。且隨著CHA濃度的增高，活細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而死細(xì)胞數(shù)量未見增長。當(dāng)CHA的濃度為10% w/v時，細(xì)胞呈現(xiàn)梭形，生長良好。見圖4。

2.5 體外抑菌能力 在涂布金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)平板上，可觀察到半徑為（4.11±0.35）mm的抑菌環(huán)，且不同的CHA濃度對抗菌效果無影響（見圖5）。證實此屏障膜有良好的抑菌能力。

圖4 不同濃度CHA的屏障膜的Live/Dead染色結(jié)果

圖5 瓊脂糖/ε-PLL/CHA屏障膜的抑菌環(huán)實驗

3 討論

慢性牙周炎是發(fā)生于牙周支持組織的慢性感染性疾病，導(dǎo)致牙周組織特別是牙槽骨的吸收破壞，是成年人失牙的最主要原因。傳統(tǒng)的牙周基礎(chǔ)治療較難獲得牙周組織的再生。NYMAN等[8]首先提出了GTR的概念，其原理是通過外科的方法在骨缺損部位放入屏障膜，阻擋牙齦結(jié)締組織與根面接觸的同時提供一定的空間，引導(dǎo)具有牙周組織再生潛力的牙周膜細(xì)胞優(yōu)先占領(lǐng)根面，實現(xiàn)牙周組織再生。近年來GTR手術(shù)臨床開展廣泛，然而術(shù)后細(xì)菌感染常造成牙周組織再生明顯減少甚至GTR手術(shù)失敗[9]。

目前臨床上使用的屏障膜可分為可吸收性和不可吸收性?？晌招云琳夏び捎诒苊饬硕问中g(shù)取出，應(yīng)用更為廣泛，其中又以膠原膜最為普遍。雖然膠原膜具有生物相容性好、抗原性低、易于操作等優(yōu)點，但仍然存在機械強度不足，不具備抗菌能力等缺點[10]?；诳谇坏挠芯h(huán)境，這種屏障膜有發(fā)生術(shù)后感染的風(fēng)險，易導(dǎo)致GTR手術(shù)效果不佳甚至失敗。SUZAWA等[11]研究表明加入HA后的瓊脂糖凝膠顯著促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。NASAJPOUR等[12]報道聚己內(nèi)酯和氧化鋅的復(fù)合膜能促進(jìn)牙周膜細(xì)胞分化的同時還有良好的抗菌能力。因此以簡單工藝制備具有一定促進(jìn)牙周組織再生及抗菌性能的屏障膜具有重要意義。

HA作為一種人工骨材料，與骨骼主要成分相似，具有機械性能、生物相容性及骨傳導(dǎo)性良好等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于臨床[13-14]。CO32-取代HA中的OH-或PO43-，引起HA的晶格畸變，可成為CHA，在保持HA原有的良好生物相容性的同時，又顯著提高其生物活性[4-5]。

ε-PLL是一種含有25～30個賴氨酸殘基的同型單體聚合物，通過賴氨酸殘基的ε-氨基和α-羧基形成的酰胺鍵連接而成。其不但可以作為接枝材料[15]，還具有廣譜抑菌作用，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌等均具有抗菌作用。AMARIEI等[16]研究表明將ε-PLL摻入靜電紡絲制成的PAA/PVA膜后細(xì)菌的定植明顯減少。其同時具有良好的生物安全性，有研究表明其無毒劑量為10 000 ppm，且在30 000 ppm以下對生殖、神經(jīng)系統(tǒng)及胚胎的發(fā)育和生長均無毒性，被認(rèn)為是抗菌物質(zhì)的良好選擇之一[17]。

本研究采用了低成本的可物理交聯(lián)的多孔惰性材料CHA/瓊脂糖作為載體，包載具有廣譜抗菌性能的ε-PLL，通過簡單工藝的制備除了具有屏障功能，還能抗菌的屏障膜。

從FTIR結(jié)果圖可以看到CO32-部分取代PO43-和OH-所形成的特征峰，表明成功制備出了CHA。CO32-是人骨磷灰石中最多的摻雜離子[18]，CHA較HA可更有利于細(xì)胞的黏附及骨向分化[19]。研究發(fā)現(xiàn)HA在模擬體液浸泡后在其表面形成花狀的CHA，相較于HA具有更好的生物活性[20]。從SEM結(jié)果可以看到，高濃度的CHA可以減小瓊脂糖的內(nèi)部孔隙使屏障膜更好發(fā)揮屏障作用。并且由于CO32-的摻入可以有效提高CHA的機械性能[21]，流變實驗也證實隨著CHA濃度的升高，屏障膜的機械性能也逐漸增強，初步證實可以滿足在人體內(nèi)所需的機械性能的要求。從Live/Dead染色結(jié)果來看，死細(xì)胞數(shù)量極少，表明此屏障膜具有較好的生物相容性?？赡苡捎诓患覥HA的瓊脂糖凝膠硬度低，細(xì)胞生長較慢，因此可見瓊脂糖/ε-PLL膜上細(xì)胞較少，但隨著CHA濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，并且在CHA濃度為10% w/v時可見細(xì)胞鋪展呈梭形?？咕鷮嶒灡砻鞔似琳夏瘘S色葡萄球菌具有較好的抗菌性能。今后還需要通過動物實驗進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究以簡單工藝制備了瓊脂糖/ε-PLL/CHA膜，并初步證實其具有較好的力學(xué)、生物相容性和抗菌等性能。