miR-17-5p在大鼠垂體泌乳素腺瘤MMQ細胞耐藥中的作用

管佳清，許家棟，王春勇，蘇志鵬，蔡霖，陳賢斌，鄭偉明

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 溫州 325015）

垂體泌乳素腺瘤是臨床上最常見的垂體腺瘤類型，占垂體腺瘤的40%～66%，年發(fā)病率達6～10/10萬[1-2]?？溄橇郑╟abergoline，CAB）和溴隱亭作為多巴胺受體激動劑（dopamine agonist，DAs），是目前臨床上治療垂體泌乳素腺瘤的首選藥物。而相比于溴隱亭，CAB具有臨床療效更好，不良反應(yīng)更少且藥物的半衰期更長等特點，能夠有效地減小腫瘤體積和抑制泌乳素分泌[3-5]。然而，臨床上仍還有大約11%的泌乳素瘤患者對CAB治療耐藥[6]，這部分患者常因藥物治療無效而出現(xiàn)高泌乳素血癥和顯著的腫瘤占位性癥狀。垂體泌乳素腺瘤的耐藥是一個在臨床上亟待解決的問題。

微小RNA（microRNAs）家族由一系列長16～29 nt的非編碼單鏈RNA組成[7]，該類RNA能特異性結(jié)合靶基因mRNA的3'UTR位點，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達[8]。研究證實，包括乳腺癌[9]、骨肉瘤[10]、胰腺癌[11]、骨髓瘤[12]在內(nèi)多種惡性腫瘤的耐藥性都與miRNAs有關(guān)[13]。有研究表明miR-17-5p能促進結(jié)腸癌的發(fā)生和耐藥，從而降低癌癥患者的生存率[14]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p在耐受多巴胺受體激動劑治療的垂體泌乳素腺瘤中呈高表達[15]，但其在垂體泌乳素腺瘤耐藥中的作用仍不清楚。本研究通過體外建立miR-17-5p過表達和敲減的MMQ細胞模型，探討miR-17-5p在MMQ細胞耐藥性中的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞MMQ購自美國ATCC細胞庫（細胞證書：ATCC-CRL-10609）。CAB購自英國Tocris Bioscience公司（貨號：2664/10），CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）單克隆抗體購自美國Cell Signal Technology公司（貨號：9188S），GAPDH單克隆抗體購自美國Proteintech公司（貨號：10494-1-AP），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Thermo Fisher Scientific公司（貨號：K1622），SYBR Premix Ex Taq II購自日本TAKARA公司（貨號：RR820A），RNAiso for small RNA購自日本TAKARA公司（貨號：9753A），Mir-XTM miRNA First Strand Synthesis Kit購自日本TAKARA公司（貨號：638315），miRNA-17 mimic、miRNA-17 inhibitor及陰性對照購自上海吉瑪基因公司，PTEN慢病毒載體購自上海吉凱基因技術(shù)有限公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司，miR-17-5p、U6、PTEN及GAPDH引物購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠垂體泌乳素腺瘤MMQ細胞的培養(yǎng)：使用含有2.5%的胎牛血清、15%的馬血清和1%青鏈霉素混合液的F-12K培養(yǎng)基培養(yǎng)，將MMQ細胞接種于培養(yǎng)瓶后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖率：調(diào)整MMQ細胞密度為6×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔終體積為100 μL，培養(yǎng)過夜，按照說明書分別加入miR-17-5p mimics、miR-17-5p inhibitor以及陰性對照，作用至不同計劃時間點后，加入10 μL CCK-8試劑溶液，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后，在酶標儀450 nm波長處檢測OD值。細胞增殖率=［（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）］×100%。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞對CAB治療的反應(yīng)：將轉(zhuǎn)染miR-17-5p mimics、miR-17-5p inhibitor及陰性對照24 h后的細胞株接種于96孔培養(yǎng)板中，細胞濃度為每孔6×103個，按50 μmol/L終濃度加入CAB藥物處理，以PBS作為陰性對照，置入細胞培養(yǎng)箱，作用至不同計劃時間點后，加入10 μL CCK-8，37 ℃、5% CO2、飽和濕度細胞培養(yǎng)箱孵育2 h后，在酶標儀450 nm波長處檢測OD值。

1.2.4 生物信息學(xué)分析和熒光素酶報告檢測：通過在線預(yù)測網(wǎng)站獲取miR-17-5p與潛在靶標PTEN的互補結(jié)合位點，隨后設(shè)計相應(yīng)引物。以人基因組DNA為模板經(jīng)PCR反應(yīng)擴增人PTEN基因3’UTR序列，將反應(yīng)產(chǎn)物與pGEMT載體經(jīng)連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化擴增后構(gòu)建野生型pGEMT-PTEN 3’UTR載體（命名為pGEMTPTEN 3’UTR-WT）。隨后按照點突變試劑盒說明書進行點突變PCR反應(yīng)構(gòu)建突變型pGEMT-PTEN 3’UTR載體（命名為pGEMT-PTEN 3’UTR-MUT）。將pGEMT-PTEN 3’UTR-WT或pGEMT-PTEN 3’UTR-MUT載體和pmirGLO載體分別用限制性核酸內(nèi)切酶Pme I和Sal I雙酶切過夜，隨后將得到的純化的pmirGLO載體和pGEMTPTEN 3’UTR-WT/MUT片段連接轉(zhuǎn)化擴增得到野生型和突變型重組pmirGLO載體。將MMQ細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板，用Lipofectamine 2000試劑將100 nmol/L miR-17-5p mimics或miR-17-5p NC，分別與重組pmirGLO載體共轉(zhuǎn)染MMQ細胞，48 h后采用Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）檢測熒光素酶活性。

1.2.5 Western blot檢測：收集細胞后用1 mL PBS洗滌2次后，加入細胞裂解液冰上裂解后吸取上清。總蛋白量采用BCA試劑盒進行檢測定量后，取30 μg總蛋白10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后加入PTEN一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。次日用TBST緩沖液洗滌PVDF膜，加入二抗室溫孵育。最后用ECL試劑發(fā)光、顯影，并用Image Lab軟件進行分析。

1.2.6 RT-qPCR檢測：用Trizol法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)cDNA，用RNAiso for small RNA試劑盒和Mir-XTM miRNA First Strand Synthesis Ki試劑盒提取miRNA并反轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)cDNA，隨后進行熒光定量PCR，反應(yīng)體系為20 μL，用GAPDH作為參考，引物序列見表1。

表1 定量PCR相關(guān)引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS22.0軟件進行處理，計量資料用表示，2組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-17-5p促進MMQ細胞增殖 通過轉(zhuǎn)染miR-17-5p mimics提高MMQ細胞中的miR-17-5p表達水平，RT-qPCR結(jié)果顯示經(jīng)過轉(zhuǎn)染后的MMQ細胞中miR-17-5p相對表達量提高到原先的6.24倍（1.37±0.12 vs.8.54±0.58，P＜0.05），MMQ細胞的增殖率明顯高于對照。轉(zhuǎn)染后24 h，實驗組細胞較對照組細胞增殖率增加39.39%（174.8%±12.4% vs. 125.4%±13.1%，P＜0.05）。通過轉(zhuǎn)染miRNA-17 inhibitor降低MMQ細胞中的miR-17-5p水平，miR-17-5p相對表達量降低62.38%（1.01±0.13 vs. 0.38±0.09，P＜0.05）RT-qPCR結(jié)果提示MMQ細胞中miR-17-5p表達量顯著下降，MMQ細胞的增殖率明顯低于對照，轉(zhuǎn)染后24 h，實驗組較對照組減少35.09%（112.50±15.25 vs.173.33±14.75，P＜0.05）。見圖1。這些結(jié)果表明miR-17-5p促進MMQ細胞增殖。

圖1 miR-17-5p對MMQ細胞增殖的影響

2.2 miR-17-5p對CAB治療反應(yīng)的影響 將轉(zhuǎn)染后的細胞應(yīng)用CAB藥物處理，采用CCK-8法檢測細胞存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純CAB處理組細胞相對活性為（47.50±1.23）%，miR-17-5p過表達后CAB處理組細胞相對活性為（68.67±3.85）%，其細胞活性較前者提高了44.57%（P＜0.05）。miR-17-5p敲減后CAB處理組相對活性為（37.36±1.98）%，單純CAB處理組細胞相對活性為（48.0±3.7）%，下降了22.17%（P＜0.05）。見圖2。這些結(jié)果表明miR-17-5p能提高MMQ細胞對CAB的耐受性。

圖2 miR-17-5p對MMQ細胞CAB耐藥性的影響

2.3 miR-17-5p對MMQ細胞PTEN表達的影響 通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-17-5p的靶標基因，發(fā)現(xiàn)PTEN基因的3’UTR第276～第282位堿基存在miR-17-5p潛在結(jié)合位點（見圖3A）。熒光素酶報告提示，相較于陰性對照，PTEN野生型MMQ細胞的熒光素酶活性明顯降低，而PTEN突變型MMQ細胞的熒光素酶活性無明顯變化（見圖3B）。采用Western blot與RT-qPCR檢測miR-17-5p轉(zhuǎn)染前后MMQ細胞中PETN的表達，結(jié)果顯示，與陰性對照相比，miR-17-5p高表達的MMQ細胞中PTEN蛋白和mRNA表達量均明顯降低（P＜0.05），而miR-17-5p下調(diào)后的MMQ細胞中PTEN蛋白和mRNA表達量均明顯上升（P＜0.05）。見圖3C-D。這些結(jié)果表明miR-17-5p能抑制MMQ細胞PTEN的表達。

圖3 miR-17-5p對PTEN表達的影響

2.4 PTEN表達上調(diào)對miR-17-5p過表達的MMQ細胞對CAB治療反應(yīng)的影響 用miR-17-5p mimic和PTEN慢病毒載體共轉(zhuǎn)染MMQ細胞。采用Western blot法檢測轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果提示，慢病毒轉(zhuǎn)染后PTEN基因蛋白表達量較對照組升高了249.6%。用CAB處理各組細胞，CCK-8法檢測細胞存活率，結(jié)果提示CAB+miR-17-5p mimic轉(zhuǎn)染組細胞相對活性為（74.8±1.9）%，CAB+miR-17-5p mimic+PTEN慢病毒載體共轉(zhuǎn)染組相對細胞活性為（57.0±1.8）%，較前降低23.8%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。這些結(jié)果表明PTEN表達上調(diào)能部分逆轉(zhuǎn)miR-17-5p過表達引起的MMQ細胞對CAB的耐藥性。

3 討論

圖4 PTEN表達上調(diào)對miR-17-5p過表達MMQ細胞CAB耐藥性的影響

垂體泌乳素腺瘤是最常見功能性垂體腺瘤，常引起患者性腺機能減退和不育[1-2]。在治療垂體泌乳素腺瘤的一線藥物中，CAB能有效地減小腫瘤體積，抑制泌乳素分泌并能恢復(fù)性腺功能[3]。然而有一部分患者在治療過程中仍然表現(xiàn)出了對CAB的耐藥[1，5]，如何有效逆轉(zhuǎn)耐藥性是臨床治療上面臨的一個挑戰(zhàn)。miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類小分子非編碼單鏈RNA，在腫瘤發(fā)生發(fā)展進程中調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達[16]，miRNA對多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展都有影響，另有研究證實，miR-17-5p可以通過調(diào)控PTEN的表達影響胃癌的化療敏感性[17]。而我們既往的研究發(fā)現(xiàn)miR-17-5p在耐藥泌乳素瘤組織中表達顯著上升，但其具體作用及調(diào)控機制仍不明確[15]。有研究表明miR-17-5p能誘發(fā)結(jié)腸癌并促進其耐藥[14]，該過程主要通過抑制PTEN表達，激活PI3K/AKT信號通路來完成[18]。本項研究表明在垂體泌乳素腺瘤細胞中，miR-17-5p可能會通過下調(diào)PTEN的表達來促進腫瘤細胞的增殖并提高耐藥性。

PTEN基因定位于染色體10q23.3，由9個外顯子組成，編碼的蛋白質(zhì)包含403個氨基酸，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系[19]。PTEN蛋白可通過拮抗磷酸化酶的活性抑制腫瘤的生長[20-21]，對腫瘤細胞的生長、侵襲、遷移等方面有重要的作用[22]。近年來有關(guān)PTEN的研究逐漸增多，有研究表明骨肉瘤中的PTEN基因表達率明顯低于正常軟骨組織，提示骨肉瘤中的PTEN蛋白表達減少，從而失去了細胞周期的負調(diào)節(jié)，導(dǎo)致細胞異常增殖，最終引起腫瘤發(fā)生。由PTEN編碼的蛋白可以抑制骨肉瘤中的PI3K/AKT通路，抑制腫瘤的病理過程[23]。還有研究表明，miR-23a可以抑制骨肉瘤細胞中PTEN的表達從而促進其生長侵襲[24]。另外有研究表明，PTEN的表達異常對胃癌的發(fā)生發(fā)展起到重要的作用[25]。而我們的研究證實PTEN可能是miR-17-5p的直接作用靶標，在泌乳素瘤中，PTEN的上調(diào)可能會促進腫瘤對CAB的藥物敏感性。

綜上所述，本研究證實miR-17-5p能通過靶向調(diào)控PTEN基因的表達，從而促進MMQ細胞增殖，增強其對CAB的耐藥性，這為解決泌乳素腺瘤耐藥性提供了新的治療思路。相信隨著基因技術(shù)的發(fā)展，miR-17-5p可以作為評估泌乳素腺瘤耐藥性的重要分子生物標志物，并能將針對miR-17-5p的靶向治療應(yīng)用于臨床。然而本研究尚有一些局限性。首先，miR-17-5p的效果及機制僅在大鼠細胞中進行了研究，在人類泌乳素瘤細胞尚未驗證。其次，除了提高MMQ細胞對CAB的耐藥性，miR-17-5p可能直接影響到細胞的增殖，因此，這些機制應(yīng)該進行進一步的研究。