云南產(chǎn)地參多糖脫色、脫蛋白及其抗凝血活性研究

李巖 張翠香 羅永會(huì)

摘 要：以地參多糖損失率、蛋白去除率和色素去除率為測定指標(biāo)，篩選地參多糖脫蛋白、脫色的最佳方法，并對(duì)精制總多糖的抗凝血活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，4種多糖脫蛋白方法中，效果最好的為三氯乙酸-正丁醇法，經(jīng)該方法處理的地參多糖提取液，蛋白質(zhì)去除率為（80.28±0.98）%，多糖損失率為（9.67±0.97）%；活性炭脫色法為地參多糖的最佳脫色方法，用終濃度為1%的活性碳對(duì)地參多糖水溶液進(jìn)行脫色，脫色率達(dá)到（91.56±0.87）%，多糖損失率為（8.39±0.74）%?？鼓囼?yàn)表明，地參多糖具有明顯的體外抗凝血活性，能延長人體血漿APTT（活化部分凝血活酶時(shí)間）與PT（凝血酶原時(shí)間），對(duì)TT（凝血酶時(shí)間）無影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為地參多糖純化及活性的研究提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：地參；地參多糖；脫色；脫蛋白；抗凝血

中圖分類號(hào) S567.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2019）07-0013-04

Abstract：With the loss rate of polysaccharide，protein removal rate and pigmentation removal rate of L. lucidus Turcz as indicators，the best method of deproteinization and decolorization of L. lucidus Turcz polysaccharide was screened. The anticoagulant activity of refined polysaccharides was also studied. The results showed that the best method for protein removal was trichloroacetic acid-n-butanol method. The protein removal rate and polysaccharide loss rate of polysaccharide extract from L. lucidus Turcz were（80.28±0.98）% and（9.67±0.97）% respectively. Activated carbon decolorization is the best decolorization method for polysaccharides from L. lucidus Turcz. The decolorization rate of Polysaccharides from L. lucidus Turcz was（91.56±0.87）% and the loss rate of polysaccharides was（8.39±0.74）% with 1% active carbon at the final concentration. Anticoagulation test showed that L.lucidus Turcz polysaccharides had obvious anticoagulant activity in vitro. L. lucidus Turcz polysaccharides could prolong APTT （activated partial thromboplastin time） and PT （prothrombin time） in human plasma，but had no effect on TT （thrombin time）. The test was expected to provide a basis for the purification and activity of Polysaccharides from L. lucidus Turcz.

Key words：L. lucidus Turcz；L. lucidus Turcz Polysaccharides；Decoloration；Deproteinization；Anticoagulation

多糖廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞中，研究表明，多糖具有抗腫瘤、降血糖、增強(qiáng)人體免疫力以及抗病毒等多種生物活性[1-5]。近年來，血栓性疾病日益威脅著人們的身體健康[6]?？鼓幬锶绺嗡囟嗵窃谘ㄐ约膊〉闹委熤衅鹬匾饔?，但副作用則是易引起自發(fā)性出血及血小板減少[7]。因此，尋找天然抗凝血活性產(chǎn)物，進(jìn)而研發(fā)新藥，開發(fā)功能性食品，具有毒性小、費(fèi)用低的優(yōu)勢(shì)[8]。

地參（L. lucidus Turcz.）又名蟲草參、銀條菜，為唇形科屬多年生草本植物，食藥兼用，在我國主要產(chǎn)于云南、廣西。地參含有多種藥用成分，其莖葉曬干后即是名貴中草藥。全草入藥，具有活血、利尿、通經(jīng)、滋陽、潤燥、調(diào)血脂、通竅、利關(guān)節(jié)、養(yǎng)氣血等功能。目前，植物多糖的提取通常采取水提醇沉的方法，得到的多糖產(chǎn)品純度較低，主要雜質(zhì)有色素、蛋白質(zhì)和一些小分子物質(zhì)。色素的存在不僅影響多糖的色澤，同時(shí)也影響多糖的純度，從而影響其生物活性，阻礙了對(duì)多糖的組成及結(jié)構(gòu)以及生物活性關(guān)系的研究[9，10]。目前，對(duì)太子參、西洋參等植物多糖的提取工藝的研究已有報(bào)道[11，12]，而對(duì)地參多糖提取工藝的研究還鮮有報(bào)道[13]，其除蛋白脫色工藝及抗凝血活性的研究尚未見報(bào)道。為此，本研究對(duì)不同脫色和脫蛋白方法的效果進(jìn)行了比較，篩選地參多糖脫蛋白、脫色的最佳方法，使粗多糖得到精制，并對(duì)精制多糖的抗凝血活性進(jìn)行了研究，為地參的綜合利用提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 地參購于大理市劍川縣農(nóng)貿(mào)市場。葡萄糖對(duì)照品、牛血清白蛋白為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)口分裝；考馬斯亮藍(lán)G-250為北京鼎國生物技術(shù)有限公司進(jìn)口分裝；其他試劑均為分析純。試驗(yàn)使用的儀器主要有：RE-25B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），B600型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠），SH-2型磁力攪拌器（北京洪博達(dá)科技有限公司），BT-224S型電子分析天平（德國賽多利斯儀器公司），F(xiàn)D-1型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康技術(shù)有限公司），UV2550型紫外分光光度計(jì)（日本島津蘇州儀器有限公司），恒溫水浴鍋（上海博迅達(dá)實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 地參多糖提取工藝流程 地參干料→粉碎→脫酯（5倍體積無水乙醇，70℃回流2次，每次2.5h）→加水浸提→離心→濃縮→乙醇沉淀→離心→沉淀60℃恒溫干燥→地參多糖粗品，具體提取方法參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 多糖含量測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取已經(jīng)干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品24mg，用500mL蒸餾水定容至刻度，分別吸取0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8mL，各以蒸餾水補(bǔ)至2.0mL，然后加入5%苯酚水溶液0.5mL，再沿著試管壁緩慢滴入濃硫酸至總體積達(dá)10mL，用快速旋渦混勻器混合均勻后，室溫放置30min，在波長490nm處測定吸光度。樣品測定：吸取樣品液1.0mL按上述步驟操作，測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量[14]。

1.2.2.2 蛋白質(zhì)含量測定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[15]。

1.2.2.3 多糖損失率測定 多糖損失率的計(jì)算為：

[多糖損失率（%）=C1-C2C1×100]

式中：C1為脫蛋白或脫色前多糖的質(zhì)量濃度；C2為脫蛋白或脫色后多糖的質(zhì)量濃度。

1.2.2.4 色素去除率測定 地參多糖脫色效果的評(píng)價(jià)用“脫色率”表示：

[脫色率（%）=A1-A2A1×100]

式中：A1為脫色前吸光度；A2為脫色后吸光度值。

1.2.2.5 蛋白脫除率的測定 地參多糖水溶液中蛋白脫除效果的評(píng)價(jià)用“蛋白脫除率”表示：

[蛋白脫除率（%）=M1-M2M1×100]

式中：M1為脫蛋白前多糖溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度；M2為脫蛋白后多糖溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。

1.2.2.6 檢測波長的測定 對(duì)地參多糖的水溶液于200～700nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，檢測其最適吸收波長。

1.2.3 地參多糖脫色方法 脫色前后的多糖溶液于最適吸收波長下，測定多糖溶液的吸光度值，計(jì)算色素去除率，以多糖損失率為指標(biāo)，考察不同濃度的活性炭、H2O2對(duì)多糖的脫色效果。

1.2.3.1 過氧化氫脫色 取粗多糖溶液（0.5mg/mL），加入適量30%的過氧化氫，使過氧化氫在多糖溶液中的終濃度分別為0.5%、1%、1.5%，攪拌0.5h，8000r/min離心10min，收集上清液，測定上清液吸光度值和多糖含量，計(jì)算色素去除率和多糖損失率。

1.2.3.2 活性炭脫色 取粗多糖溶液（0.5mg/mL），加入經(jīng)重蒸水清洗過濾，110℃干燥至恒重的活性炭，使活性碳在多糖溶液中的終濃度分別為0.5%、1%、1.5%，攪拌0.5h，8000r/min離心10min，收集上清液，測定上清液吸光度值和多糖含量，計(jì)算色素去除率和多糖損失率。

1.2.4 地參多糖脫蛋白方法 采用水提醇沉法所得的多糖中常存在一定量的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的存在會(huì)對(duì)多糖生物學(xué)活性產(chǎn)生影響。為得到高純度多糖精制品。本研究以蛋白去除率、多糖損失率為指標(biāo)，比較三氯乙酸法、三氯乙酸-Sevage法、三氯乙酸-正丁醇法、Sveage法的脫蛋白效果，篩選出地參多糖最佳脫蛋白方法。

1.2.4.1 三氯乙酸法 取粗多糖溶液（0.5mg/mL）50mL，

加入等體積20%三氯乙酸，攪拌1.5h，靜置過夜，8000r/min離心10min，收集上清液，測定蛋白和多糖含量，計(jì)算蛋白去除率和多糖損失率。

1.2.4.2 三氯乙酸-Sevage法 取粗多糖溶液（0.5mg/mL）50mL，加入等體積10%三氯乙酸和10mL Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），攪拌1.5h，8000r/min離心10min，收集上清液，測定蛋白和多糖含量，計(jì)算蛋白去除率和多糖損失率。

1.2.4.3 三氯乙酸-正丁醇法 取粗多糖溶液（0.5mg/mL）50mL，加入100mL三氯乙酸-正丁醇（三氯乙酸∶正丁醇=1∶10）試劑，攪拌1.5h，8000r/min離心10min，收集上清液，測定蛋白和多糖含量，計(jì)算蛋白去除率和多糖損失率。

1.2.4.4 Sevage法 取粗多糖溶液（0.5mg/mL）50mL，加入12.5mL的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），攪拌1.5h，8000r/min離心10min，收集上清液，測定蛋白和多糖含量，計(jì)算蛋白去除率和多糖損失率。

1.2.5 體外抗凝血實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[16]的方法，取健康人新鮮血液與100mmol/L枸櫞酸鈉，按體積比9∶1混勻，3000r/min離心10min，收集離心上層液體，獲得貧血小板血漿。取地參精制總多糖，用生理鹽水分別配制成10、50、100、150、200mg/L的溶液，分別與待測血漿按1∶4的體積比混合。并以地參多糖溶液相應(yīng)等體積的肝素鈉及生理鹽水處理待測血漿，分別作為陽性和陰性對(duì)照。用Sysmex-CA7000全自動(dòng)凝血儀測定APTT、PT和TT值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 每試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用origin86軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作在波長490nm處測定吸光度。以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，回歸方程為y=0.161x-0.014，R2=0.9998，表明該方程精密度很好，可用于后續(xù)多糖的測定。

2.2 蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線 以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，按實(shí)驗(yàn)方法，以BSA的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，回歸方程為y=0.0253x+0.0139，R2=0.9963，表明該方程精密度很好，可用于后續(xù)多糖中蛋白質(zhì)濃度的測定。

2.3 多糖溶液最大吸收波長 對(duì)地參多糖的水溶液于200～700nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)溶液在490nm下有較大吸光度，如圖3所示。在以后續(xù)試驗(yàn)中采用此波長對(duì)色素的去除率進(jìn)行測定。

2.4 地參多糖脫色效果 脫色后的多糖溶液于波長為490nm下對(duì)脫色去除率進(jìn)行測定，以多糖損失率為指標(biāo)，考察不同濃度的活性炭、H2O2對(duì)多糖脫色的效果。從表1對(duì)比可知，活性炭對(duì)地參多糖水溶液中色素具有良好的去除作用，其脫色效果較過氧化氫好，多糖損失率較低。脫色劑以及用量不同對(duì)多糖脫色效果顯示出差異，而用量升高時(shí)多糖損失率明顯增加。所以選擇終深度為1.0%的活性碳對(duì)地參多糖進(jìn)行脫色。

2.5 地參多糖脫蛋白效果 由表2可知，脫蛋白效果最好的為三氯乙酸-正丁醇法，該法去除蛋白質(zhì)的同時(shí)多糖損失率也較低。

2.6 體外抗凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，與生理鹽水組相比，在10～200mg/L劑量范圍內(nèi)，地參多糖對(duì)APTT和PT影響顯著，而對(duì)TT無影響。在50～200mg/L劑量濃度范圍，地參多糖對(duì)APTT的影響明顯高于肝素鈉。結(jié)果提示地參多糖有較好的抗凝血活性。

3 結(jié)論與討論

水提醇沉提取方法得到的地參粗多糖有較多的蛋白質(zhì)和較深的顏色，蛋白質(zhì)和色素的存在影響多糖的純度，從而影響其生物活性，阻礙了對(duì)多糖的組成和結(jié)構(gòu)的研究。因此，脫色和脫蛋白在多糖純化過程中有著非常重要的意義[17]。過氧化氫對(duì)地參多糖的脫色效果較活性炭差，且多糖損失率較高。實(shí)驗(yàn)中較高濃度的活性炭的脫色效果較好，但由于活性炭對(duì)色素吸附的同時(shí)也會(huì)吸附掉部分多糖，造成多糖損失，故在脫色劑用量的選擇上，應(yīng)同時(shí)考慮脫色效果與多糖損失兩者的綜合效應(yīng)。本研究選用終濃度為1%的活性碳對(duì)地參多糖水溶液進(jìn)行脫色1次脫色率就能達(dá)到（91.56±0.87）%，多糖損失率僅為（8.39±0.74）%，結(jié)果表明，終濃度為1%的活性碳吸附除去地參多糖提取液中的色素是較好的方法。

多糖主要以2種形式存在，一是純糖鏈，另一種是糖鏈與肽鏈結(jié)合，形成的糖肽或糖蛋白。多糖脫蛋白主要是去除游離蛋白質(zhì)，因此在選擇脫蛋白方法時(shí)應(yīng)該注意避免多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物的降解，從而造成多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物特有的生理活性下降。比較4種多糖脫蛋白方法，脫蛋白效果最好的為三氯乙酸-正丁醇法，經(jīng)該方法處理的地參多糖提取液，蛋白質(zhì)去除率為（80.28±0.98）%，多糖損失率為（9.67±0.97）%。體外抗凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，地參多糖抗凝血活性有濃度依賴性，地參多糖對(duì)APTT和PT影響顯著，而對(duì)TT無影響。在50～200mg/L劑量濃度范圍，地參多糖對(duì)APTT的影響明顯高于肝素鈉，表明地參多糖有較好的抗凝血活性。本研究可為地參多糖的分離純化及其生物學(xué)活性的研究提供基礎(chǔ)。

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