普拉格雷對海水吸入型急性肺損傷的作用分析

魚高樂 韓璐瑤 高永恒 宋斯迪 金發(fā)光

淹溺是近年來意外死亡的重要原因，與淡水相比，海水由于其高滲與堿性的特點(diǎn)，造成的急性肺損傷更容易出現(xiàn)嚴(yán)重的低氧血癥與酸中毒，更易發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)，其救治難度更大[1]。海水淹溺的基本病理改變是肺微血管通透性增高，血管內(nèi)液外滲，從而導(dǎo)致的肺水腫以及肺間質(zhì)以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤[2]。

近年研究發(fā)現(xiàn)血小板除在凝血方面的作用外，在免疫炎癥反應(yīng)以及腫瘤轉(zhuǎn)移中有著重要的作用。比如血小板可以與炎癥細(xì)胞黏附，激活炎癥細(xì)胞；血小板誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，從而增加炎癥細(xì)胞的黏附與滲出；血小板釋放趨化因子以及可溶性免疫介質(zhì)如CD 40 L，從而促進(jìn)炎性細(xì)胞的激活與滲出[3- 5]。其中，血小板與中性粒細(xì)胞有著重要的相互關(guān)系，黏附于中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的血小板可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的遷移、黏附、滲出，同時(shí)血小板可以分泌炎性介質(zhì)從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞釋放活性產(chǎn)物[6-7]。

抗血小板治療在一些炎癥性疾病中有著不錯(cuò)的治療以及保護(hù)作用，比如對酸吸入型肺損傷、膿毒血癥及內(nèi)毒素型肺損傷[8- 9]。普拉格雷通過抑制血小板表面的P2Y12受體，可抑制血小板活化與聚集反應(yīng)，降低炎癥反應(yīng)[10-11]。研究表明普拉格雷可以通過抑制血小板與中性粒細(xì)胞的黏附達(dá)到降低炎癥反應(yīng)，從而對疾病產(chǎn)生保護(hù)作用[12]。鑒于海水吸入型肺損傷與炎癥反應(yīng)以及中性粒細(xì)胞的密切關(guān)系，本文旨在探索普拉格雷對海水吸入型肺損傷的作用以及可能的作用機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

健康雄性SD大鼠，清潔級，體重300 g左右，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。采用完全隨機(jī)方法將64只SD大鼠分為兩大組，即海水吸入后1 h與2 h組。每個(gè)大組中隨機(jī)分又為四組，每組8只大鼠，分別為；A:空白對照組，B：海水淹溺組，C：溶劑CMC-Na預(yù)處理組，D：普拉格雷預(yù)處理組。造模前4 h灌胃給藥。

普拉格雷購自Macklin公司，用0.5%羥甲基纖維素鈉(sodium carboxymethylcellulose, CMC-Na)溶液混懸灌胃給藥。配方海水按照中國國家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我國東南沿海海水的主要成分配制：NaCl 26.518 g/L，MgSO43.305 g/L，MgCl22.447 g/L，CaCl21.141g/L，NaHCO30.202 g/L，KCl 0.725 g/L，NaBr 0.083 g/L；pH 8.2，相對密度1.05，滲透壓1300 mmol/L。TNF-α、IL-1β和TXB2 ELISA試劑盒購于Bio-Swamp公司。肺泡灌洗液蛋白測定使用Bradford試劑盒，髓過氧化物酶(MPO)試劑盒購于南京建成公司。測定流式細(xì)胞所用紅細(xì)胞裂解液購于BD公司。流式抗體抗大鼠CD62P-PE抗體購于BIO-RAD公司，抗大鼠CD11b-APC抗體以及抗大鼠CD61-FITC抗體購于BD公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

C組給與2 ml/kg CMC-Na溶劑，D組給與3 mg/kg普拉格雷(0.5% CMC-Na混懸)，B、C、D組大鼠制作海水吸入型肺損傷模型，建模后1 h或2 h后放血處死大鼠后收集肺組織標(biāo)本。動物模型的制備：大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1.5 ml/kg)麻醉，仰臥固定于平板，大鼠頭部墊高與桌面約呈30°，正中切口暴露氣管，取1 ml的注射器插入氣管，在4 min之內(nèi)緩慢勻速注入4 ml/kg海水。

心臟穿刺取血對血小板的活化影響最小。用枸櫞酸鈉抗凝，在大鼠胸骨左側(cè)偏下摸得心臟跳動最強(qiáng)點(diǎn)，用5 ml注射器呈大約20°夾角進(jìn)針，有落空感后抽取血液3 ml。處死大鼠后，迅速打開胸腔，充分暴露氣管、支氣管，結(jié)扎右總支氣管，防止灌洗液流入右肺。行氣管插管，向左側(cè)緩慢注入PBS，三次共計(jì)5 ml，回收率大于90%。

三、檢測指標(biāo)

1. 肺組織病理切片染色： 取大鼠右肺中葉組織，迅速放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2. 肺組織濕干比(W/D)測定： 取大鼠右肺下葉，擦干外表面后迅速稱得其濕重，后將標(biāo)本放于60 ℃烘箱中72 h稱得干重，求出濕干比。

3. TNF-α、IL-1β和TXB2的測定： 心臟穿刺取血后血液離心后獲得血漿，用ELISA法測得其細(xì)胞因子含量，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書。

4. 肺泡灌洗液蛋白測定及MPO測定： 肺泡灌洗液離心后取上清，蛋白測定按照Bradford試劑盒嚴(yán)格操作，MPO測定按照試劑盒步驟操作，之后比色計(jì)算結(jié)果。

5. 血小板活化率及其與中性粒細(xì)胞黏附率測定： 用抗CD11b抗體標(biāo)記中性粒細(xì)胞，用抗CD61抗體標(biāo)記血小板，CD62P為血小板活化指標(biāo)。取心臟穿刺所得血液100 μl于流式管中，避光孵育30 min后裂解，洗滌，重懸后上機(jī)檢測。流式細(xì)胞結(jié)合前向散射光、側(cè)向散射光及標(biāo)志性熒光抗體圈出中性粒細(xì)胞和血小板，進(jìn)而分析血小板活化率以及血小板與中性粒細(xì)胞黏附率。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、病理學(xué)檢測

空白對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯的病理結(jié)構(gòu)變化；海水處理組與溶劑預(yù)處理組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，局部肺不張，肺間質(zhì)可見出血、水腫，并可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔明顯增厚；普拉格雷預(yù)處理組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)尚清晰，間質(zhì)水腫、出血和炎細(xì)胞浸潤等改變較海水處理組與溶劑預(yù)處理組大鼠明顯減輕，并且海水吸入2 h較1 h病理損傷更為嚴(yán)重，見圖1。

二、 肺組織濕干比、細(xì)胞因子測定

海水吸入后，肺組織濕干比明顯增高，炎癥因子TNF-α、IL-1β和TXB2也明顯增高，2 h較1 h增高更為明顯。普拉格雷預(yù)處理有效的降低了這些指標(biāo)，見圖2。

三、BALF蛋白測定、MPO測定

海水吸入后，肺泡灌洗液蛋白定量以及MPO活性也明顯增高，同時(shí)2 h增高更為明顯。普拉格雷預(yù)處理組這些指標(biāo)均降低，見圖3。

圖3 不同處理組肺泡灌洗液蛋白濃度及MPO活性的比較；注：*表示P<0.05；n.s.表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；A：空白對照組；B：海水淹溺組；C：溶劑CMC-Na預(yù)處理組；D：普拉格雷預(yù)處理組

圖1 不同處理組大鼠肺組織的病理切片，大鼠1 h與2 h肺組織的損傷；注：A：空白對照組；B：海水淹溺組；C：溶劑CMC-Na預(yù)處理組；D：普拉格雷預(yù)處理組(HE×20)

圖2 不同處理組肺組織濕干比的比較，ELISA檢測血漿TNF-α、IL-1β及TXB2水平；注：*表示P<0.05，**表示P<0.1，n.s.表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；A：空白對照組；B：海水淹溺組；C：溶劑CMC-Na預(yù)處理組；D：普拉格雷預(yù)處理組

四、血小板活化率及血小板與中性粒細(xì)胞黏附率測定

海水處理組與溶劑預(yù)處理組在海水吸入后血小板活化率以及血小板與中性粒細(xì)胞黏率均明顯升高， 2 h較1 h兩項(xiàng)指標(biāo)升高更為明顯，但普拉格雷預(yù)處理均有效的降低了血小板活化率及其與中性粒細(xì)胞之間的黏附，見圖4。

圖4 不同處理組血小板活化率以及血小板與中性粒細(xì)胞黏附率的比較；注：*表示P<0.05；n.s.表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；A：空白對照組；B：海水淹溺組；C：溶劑CMC-Na預(yù)處理組；D：普拉格雷預(yù)處理組

討 論

海水吸入后進(jìn)入肺泡腔的高滲海水可直接導(dǎo)致肺水腫的形成，并且損傷肺泡上皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞，使得肺內(nèi)炎癥滲出，肺泡結(jié)構(gòu)受損、局部出現(xiàn)肺不張以及肺泡間質(zhì)增厚、炎性浸潤，出現(xiàn)通氣換氣障礙從而引起低氧血癥。低氧血癥與肺水腫又會不斷加重炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)。同時(shí)多種炎癥因子參與急性肺損傷的發(fā)生和發(fā)展，例如肺巨噬細(xì)胞激活后釋放的血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)、TNF-α和IL-1 等以及活化的中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的氧自由基、血栓素、前列環(huán)素等炎癥介質(zhì)造成肺組織損害加重。炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大進(jìn)一步加重肺組織損傷[13]。故海水吸人后，極易出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征，如不及時(shí)診治，病死率極高[14]。

近年來血小板在炎癥免疫反應(yīng)以及腫瘤轉(zhuǎn)移方面的作用受到廣泛關(guān)注，研究表明血小板可以直接識別、捕獲、殺滅病原體，激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥細(xì)胞黏附與滲出，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的功能，例如增強(qiáng)其吞噬殺滅病原體以及產(chǎn)生中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs)[15-18]。這些功能的實(shí)現(xiàn)部分原因是因?yàn)檠“蹇梢苑置卺尫旁S多炎癥介質(zhì)以及其表面分子可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能[19]。許多研究表明血小板與中性粒細(xì)胞之間有著密切的關(guān)系，血小板除了具有促進(jìn)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs外，還可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫顆粒，增強(qiáng)其吞噬作用，另外血小板作為產(chǎn)生循環(huán)型CD40L的主要細(xì)胞可促進(jìn)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧[20-21]。并且血小板可促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化、黏附、滲出到炎癥反應(yīng)部位，血小板可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞上調(diào)表達(dá)黏附分子，聚集在內(nèi)皮細(xì)胞上的血小板也可以介導(dǎo)炎癥細(xì)胞的黏附與滲出[22]。許多疾病的發(fā)生與血小板有著密切的關(guān)系，例如血小板與免疫細(xì)胞的相互作用在多發(fā)性神經(jīng)硬化中(multiple sclerosis, MS)對神經(jīng)脫髓鞘產(chǎn)生重要影響，血小板的過度激活在糖尿病發(fā)生發(fā)展中也有著重要作用[23-24]。

血小板P2Y12受體在血小板活化中有著重要作用，其受體抑制劑可有效抑制血小板活化，使血小板前炎癥反應(yīng)因子釋放減少，如CD40L。另外可減少血小板P選擇素(selectin)的表達(dá)，而P選擇素已被廣泛證明可介導(dǎo)血小板與炎癥細(xì)胞的黏附[11]。血小板P2Y12受體抑制劑包括氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)等，臨床上在心血管疾病中有著廣泛的應(yīng)用，對血栓性疾病有著較好的防治作用[25-26]。另外使用該類藥物進(jìn)行抗血小板治療對許多疾病可產(chǎn)生保護(hù)作用，比如對于腫瘤轉(zhuǎn)移以及膿毒血癥[27-28]。本文結(jié)果提示，P2Y12受體抑制劑普拉格雷可抑制血小板活化，減少血小板前炎癥因子的釋放，抑制血小板與中性粒細(xì)胞的相互作用，從而降低炎癥反應(yīng)以及中性粒細(xì)胞的滲出，對海水淹溺型急性肺損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)普拉格雷對海水淹溺型肺損傷有較好的保護(hù)作用，有效改善了肺組織的滲出與水腫，而這一作用很可能是通過抑制血小板與中性粒細(xì)胞之間的黏附以及降低炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。但至于普拉格雷在降低血小板與中性粒細(xì)胞的黏附后是如何進(jìn)一步影響中性粒細(xì)胞的趨化、黏附、滲出的，本實(shí)驗(yàn)缺少直接的證據(jù)，其具體機(jī)制需要進(jìn)一步的探索與研究。有研究表明血小板與免疫細(xì)胞的黏附率與疾病的嚴(yán)重程度以及預(yù)后密切相關(guān)，如銀屑病(psoriasis)、前列腺癌(prostatic carcinoma)等[29-30]。本文中2 h組肺損傷較1 h組明顯加重，同時(shí)其血小板與中性粒細(xì)胞黏附率同時(shí)增高，因此可以進(jìn)一步研究不同程度肺損傷與此指標(biāo)的相關(guān)性，以期有助于疾病的診斷與嚴(yán)重程度評估。普拉格雷等抗血小板藥物都會在一定程度上影響到凝血功能，因此也有必要在不同藥物濃度梯度下，檢測藥物對肺損傷的保護(hù)作用以及血小板與免疫細(xì)胞的黏附率，爭取用最小計(jì)量藥物對肺損傷產(chǎn)生較好的保護(hù)作用，避免不必要的副反應(yīng)。

綜上所述，普拉格雷對海水淹溺型急性肺損傷有著較好的保護(hù)作用，可有效減輕肺組織損傷及炎性細(xì)胞浸潤等。其具體的保護(hù)機(jī)制、最佳的藥物劑量以及血小板與免疫細(xì)胞黏附率和疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性還需要進(jìn)一步的探索研究。