乳品中獸藥殘留熒光檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

方芳 鄭君杰 孫志偉 李蓉蓉 劉薇 楊柳

近年來(lái)，乳品質(zhì)量安全事件頻發(fā)嚴(yán)重威脅著社會(huì)公共健康，故成為國(guó)際關(guān)注的重點(diǎn)。獸藥殘留是乳品質(zhì)量管控的重中之重，因?yàn)槠鋵⒅苯游：οM(fèi)者的身體健康。本文介紹了乳品中獸藥殘留的種類(lèi)和危害，總結(jié)了熒光檢測(cè)技術(shù)在乳品獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用，并展望了熒光檢測(cè)技術(shù)在乳品獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域中的發(fā)展前景。

乳及乳制品作為一類(lèi)營(yíng)養(yǎng)全面的理想食品，能夠?yàn)槿梭w提供優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和無(wú)機(jī)鹽等基本營(yíng)養(yǎng)素。此外，乳制品在人類(lèi)膳食結(jié)構(gòu)中占有十分重要的地位，尤其是嬰幼兒和老人。隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和食品貿(mào)易國(guó)際化進(jìn)程的加快，乳品的質(zhì)量安全已成為世界性的挑戰(zhàn)和全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。其中，獸藥殘留問(wèn)題是影響乳制品安全的重要因素之一。目前，乳品中獸藥殘留的主要檢測(cè)方法有微生物檢測(cè)法、免疫分析法、儀器分析法、適配體傳染器檢測(cè)法等。本文就乳品中獸藥殘留的種類(lèi)和危害進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹，并重點(diǎn)總結(jié)了熒光免疫分析技術(shù)在乳品獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。

1 乳品中獸藥殘留的危害

獸藥殘留是指動(dòng)物產(chǎn)品中任何可食部分所含獸藥的母體化合物及（或）其代謝物，以及與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)。所以，獸藥殘留既包括原藥，也包括藥物在動(dòng)物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物和獸藥生產(chǎn)中所伴生的雜質(zhì)。按照用途，可將殘留毒理學(xué)意義較大的獸藥分為7類(lèi)，包括：抗生素類(lèi)、驅(qū)腸蟲(chóng)藥類(lèi)、生長(zhǎng)促進(jìn)劑類(lèi)、抗原蟲(chóng)藥類(lèi)、滅錐蟲(chóng)藥類(lèi)、鎮(zhèn)靜劑類(lèi)、β-腎上腺素能受體阻斷劑類(lèi)，其中抗生素類(lèi)是最主要的獸藥添加劑，約占藥物添加劑的60%。

人體長(zhǎng)期攝入含獸藥殘留的乳品后會(huì)造成藥物積累，產(chǎn)生耐藥性和毒害作用，破壞胃腸道菌群環(huán)境。乳品中殘留的許多低劑量抗菌藥物如青霉素、四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)等可使部分人群發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，甚至休克;硝基呋喃類(lèi)、雌激素等都已經(jīng)被證明具有致癌作用;苯丙咪唑類(lèi)抗蠕蟲(chóng)藥具有潛在的致突變性和致畸性;磺胺二甲嘧啶會(huì)誘發(fā)動(dòng)物甲狀腺增生，并有致腫瘤傾向。長(zhǎng)期食用含以上藥物殘留的乳品后，均可能產(chǎn)生致畸、致癌和致突變等“三致”作用。另外，生長(zhǎng)激素、性激素、甲狀腺素類(lèi)促生長(zhǎng)激素以及人工合成的蛋白質(zhì)同化激素等會(huì)干擾人體內(nèi)的激素平衡，產(chǎn)生一系列激素樣作用。動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)中濫用獸藥、藥物添加劑會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物的排泄物、動(dòng)物產(chǎn)品加工的廢棄物污染生態(tài)環(huán)境，影響人類(lèi)健康。因此，乳品中獸藥殘留的快速檢測(cè)受到越來(lái)越多的重視。

2 熒光免疫分析技術(shù)

2.1 原理

1941年，Coons和Kaplan將熒光素和抗體結(jié)合來(lái)定位組織中的抗原，從而提出了熒光免疫分析法（fluorescent immunoassay， FIA）。該技術(shù)用已標(biāo)記了熒光標(biāo)記物的熒光抗體（抗原）作為探針，進(jìn)而檢查組織或細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的抗原（抗體），并在組織或細(xì)胞中所形成的抗原-抗體復(fù)合物上沉著有熒光標(biāo)記物。在熒光顯微鏡下觀察樣品，熒光標(biāo)記物受激發(fā)光的照射而發(fā)出熒光，因此可以根據(jù)熒光所在的細(xì)胞或組織，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原或抗體的定位，同時(shí)還可利用定量技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行定量。

2.2 熒光標(biāo)記物

2.2.1 熒光素

熒光素是指具有熒光特性的有機(jī)染料，Coons等首次報(bào)道了異氰酸熒光素標(biāo)記抗體用于檢測(cè)鼠組織切片中肺炎球菌抗原分布的研究。此后，Riggs等合成了性質(zhì)穩(wěn)定、毒性較低的異硫氰酸熒光素;Marshall等改良了熒光抗體標(biāo)記技術(shù)，使熒光免疫技術(shù)得到快速發(fā)展。目前，應(yīng)用于熒光免疫分析的熒光素主要有5種——異硫氰酸熒光素、四乙烯基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、與酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)和鑭系。

2.2.2 半導(dǎo)體量子點(diǎn)

半導(dǎo)體量子點(diǎn)納米晶，簡(jiǎn)稱(chēng)量子點(diǎn)（quantum dots， QDs），直徑通常在1～20nm之間，一般由II-VI或III-V族元素組成，具有激發(fā)譜寬、發(fā)射譜窄、熒光性強(qiáng)、不易淬滅、顏色可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，是目前認(rèn)為最具潛力的熒光探針之一。

2.2.3 稀土離子配合物

稀土離子配合物是指從元素鑭到元素镥的15種元素的配合物，應(yīng)用最廣泛的主要是銪（Eu）和鋱（Tb）。以釩酸鹽（YVO4）為基質(zhì)的納米稀土發(fā)光材料是比較具有研究意義及應(yīng)用價(jià)值的稀土熒光材料，由于其固態(tài)的微環(huán)境，摻雜礬酸鹽的稀土離子配合物可增強(qiáng)其穩(wěn)定性，避免了溶劑分子對(duì)熒光的淬滅，從而可發(fā)出高強(qiáng)度的特征熒光。隨著納米科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，這一熒光材料有望成為新的免疫熒光標(biāo)記體。

2.2.4 上轉(zhuǎn)換納米粒子

Auzel于1966年在研究NaYb（WO4）2鈉玻璃時(shí)發(fā)現(xiàn)，如基質(zhì)中含有Yb3+時(shí)，Er3+、Tm3+等，在近紅外光激發(fā)下可以發(fā)射出可見(jiàn)光，由此提出了上轉(zhuǎn)換發(fā)光的概念，即激發(fā)光的能量比發(fā)射光的能量低，稱(chēng)之為上轉(zhuǎn)換發(fā)光。上轉(zhuǎn)換發(fā)光大都發(fā)生在摻雜稀土離子的化合物中，NaYF4是目前上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率最高的基質(zhì)材料。上轉(zhuǎn)換納米粒子與熒光染料、量子點(diǎn)相比具有毒性低、靈敏度高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，可避免樣品中熒光特性基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，是目前理想的熒光標(biāo)記物之一。

3 熒光免疫分析技術(shù)分類(lèi)及其在乳品中獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 熒光偏振免疫分析

熒光偏振免疫分析技術(shù)是以免疫競(jìng)爭(zhēng)原理和熒光偏振原理為基礎(chǔ)的一種快速篩選分析技術(shù)，主要用于測(cè)定小分子量物質(zhì)（抗原），即檢測(cè)熒光標(biāo)記抗原在結(jié)合特異性抗體前后的熒光偏振值變化，是均相的競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法。這一反應(yīng)系統(tǒng)完全在溶液中進(jìn)行，不需要分離抗體，不易受到溶液顏色、儀器靈敏度的影響，具有操作簡(jiǎn)單和檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，適用于大量樣本的快速篩選。

高月建立了用于檢測(cè)牛奶中新霉素殘留的熒光偏振檢測(cè)方法，回收率高達(dá)87.91%～114.28%。宋佩等以異硫氰酸熒光素（FITC）作為熒光標(biāo)記物標(biāo)記沙拉沙星，利用薄層色譜法提純，建立了沙拉沙星的快速熒光偏振免疫分析法。沙拉沙星在緩沖液中的半數(shù)抑制濃度（IC50）為43.2mg/L，檢測(cè)范圍為5.7～327mg/L，達(dá)到了國(guó)家規(guī)定的動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量（80mg/kg）的要求，與環(huán)丙沙星、恩諾沙星、加替沙星及氧氟沙星的交叉反應(yīng)率分別為3.3%、1.8%、1.7%和0.7%，牛奶中沙拉沙星的回收率在71%～94%之間。該方法操作便捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)，適用于動(dòng)物性食品中沙拉沙星殘留的快速篩選檢測(cè)。

3.2 時(shí)間分辨熒光免疫分析

時(shí)間分辨熒光免疫分析采用鑭系稀土元素，如銪（Eu3+）螯合物標(biāo)記抗原或抗體，螯合物經(jīng)激發(fā)后可發(fā)射特征熒光，通過(guò)時(shí)間延遲和波長(zhǎng)分辨進(jìn)行檢測(cè)，使強(qiáng)特異性熒光和背景干擾熒光區(qū)分開(kāi)，有效地排除了干擾因素，提高了分析方法的靈敏度。

Leivo等應(yīng)用TRF結(jié)合熒光免疫法對(duì)牛奶中的氟喹諾酮進(jìn)行檢測(cè)，其線性范圍為0.2～68.0μg/L，并指出這種檢測(cè)方法可以進(jìn)一步優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)各種牛奶樣品中氟喹諾酮的檢測(cè)。高文慧等構(gòu)建了Eu3+-苯甲酸（BA）-鄰菲啰啉（Phen）三元配合物體系熒光探針，檢測(cè)牛奶中鹽酸四環(huán)素殘留，其線性范圍為1.0×10-6～5.0×10-5mol/L，且具有較好的選擇性和較高的回收率。Bacigalupo等通過(guò)建立間接競(jìng)爭(zhēng)TRFIA對(duì)牛奶中的氨芐青霉素進(jìn)行定量分析，靈敏度明顯高于ELISA，遠(yuǎn)超歐盟標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 量子點(diǎn)熒光免疫分析

以量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記探針開(kāi)發(fā)的熒光免疫分析方法，可利用其高強(qiáng)度的熒光信號(hào)，大幅度提高獸藥殘留的檢測(cè)靈敏度。量子點(diǎn)熒光分析法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏以及優(yōu)越的重現(xiàn)性，目前應(yīng)用和研究愈發(fā)廣泛。

李研東等通過(guò)制備量子點(diǎn)標(biāo)記抗體，建立了四環(huán)素類(lèi)藥物殘留量子點(diǎn)熒光免疫分析方法。結(jié)果顯示，50%抑制濃度（IC50）為0.9μg/L;四環(huán)素、金霉素、土霉素的交叉反應(yīng)率分別為100.0%、154.0%和46.4%;四環(huán)素、金霉素、土霉素的最低檢出限分別為3.0μg/kg、2.0μg/kg和6.0μg/kg，樣本添加回收率在78.7%～97.0%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)<15%。國(guó)家獸藥安全評(píng)價(jià)中心于2007年建立了牛奶和豬肉中磺胺二甲嘧啶的直接競(jìng)爭(zhēng)熒光免疫分析法，其中牛奶50%的抑制率（IC50）為4.3ng/mL，檢測(cè)限為0.6ng/mL，此方法的回收率在94.0%～106.2%。Li等通過(guò)多殘留熒光微球免疫層分析法對(duì)生乳中的紅霉素、螺旋霉素、替米考星和泰樂(lè)菌素同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，半抑制濃度（IC50）值分別為1.36ng/mL、1.22ng/mL、1.01ng/mL和1.39ng/mL，檢測(cè)限（LOD）為0.13ng/mL，回收率范圍分別為91.8%～109.2%、89.6%～114.4%、84.8%～111.6%和85.8%～115.2%。該方法大大簡(jiǎn)化了操作步驟，整個(gè)測(cè)試過(guò)程在20min內(nèi)完成，節(jié)省了大量時(shí)間。

3.4 上轉(zhuǎn)換納米粒子熒光免疫分析

HU等人將NaYF4：Yb/Tm上轉(zhuǎn)換納米粒子標(biāo)記抗體結(jié)合物作為熒光探針，單分散磁性聚苯乙烯微球標(biāo)記抗原結(jié)合物作為免疫信號(hào)捕獲探針，用于檢測(cè)牛奶樣本中的SQX。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液SQX的LOD為0.1μg/L，樣本中為0.5μg/L，標(biāo)曲線性范圍為0.1～100μg/L。樣本中添加回收率為69.8%～133%，變異率為0.24%～25.06%。該方法無(wú)需前處理，可直接稀釋測(cè)定，便于現(xiàn)場(chǎng)大批量檢測(cè)。

王瑜等以上轉(zhuǎn)換納米粒子結(jié)合己烯雌酚單克隆抗體作為熒光探針，建立了上轉(zhuǎn)換免疫層析熒光快速定量檢測(cè)己烯雌酚殘留方法。該試紙條線性范圍為25～1000ng/mL，檢出限為20.84ng/mL，批內(nèi)、批間變異系數(shù)小于10%，牛奶樣品的添加回收率為90.1%～115.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，為牛奶中己烯雌酚殘留快速定量檢測(cè)提供了新的測(cè)定方法。

劉曉等以上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料為標(biāo)記物，建立了可對(duì)奶制品中黃曲霉毒素M1進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的上轉(zhuǎn)換熒光免疫層析方法。該方法對(duì)奶粉和牛奶中黃曲霉毒素M1的檢測(cè)靈敏度分別達(dá)到0.1ng/mL和0.3ng/mL，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)量的變異系數(shù)小于15%。

3.5 熒光猝滅免疫分析

熒光淬滅免疫分析法是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子之間所發(fā)生的導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低的物理或化學(xué)作用的過(guò)程，與熒光物質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱(chēng)為熒光猝滅劑。胡高爽等依據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，建立了一種新型免疫標(biāo)記熒光猝滅試紙條檢測(cè)牛奶中獸藥磺胺喹惡啉（sulfaquinoxaline，SQX）的殘留。該免疫熒光猝滅試紙條檢測(cè)SQX的方法檢測(cè)限為1μg/L，牛奶樣品的檢測(cè)限為8μg/L，且該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、結(jié)果易于判斷，可以用于牛奶中SQX殘留的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

3.6 熒光免疫層析分析

熒光免疫層析技術(shù)是基于抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的新型膜檢測(cè)技術(shù)，其以固定有檢測(cè)線和質(zhì)控線的條狀纖維層析材料為固定相，測(cè)試液為流動(dòng)相，熒光標(biāo)記體或抗原固定于連接墊，通過(guò)毛細(xì)管作用使待分析物在層析條上移動(dòng)。該方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、受自然熒光本底干擾低等優(yōu)點(diǎn)，是快速檢測(cè)分析研究的熱點(diǎn)。

Taranova等將具有不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)偶聯(lián)氯霉素抗體、鏈霉素抗體、氧氟沙星抗體為熒光探針，構(gòu)建了可同時(shí)檢測(cè)牛奶中3種抗生素的熒光免疫層析試紙條，該試紙條對(duì)氧氟沙星的檢測(cè)限為0.3ng/mL，氯霉素的檢測(cè)限為0.12ng/mL，鏈霉素的檢測(cè)限為0.2ng/mL，比使用同一對(duì)應(yīng)抗體建立ELISA方法的檢測(cè)限低80～200倍，對(duì)實(shí)際牛奶樣品的添加回收率為92%～101%。

4 展望

隨著科學(xué)技術(shù)的日益提高，獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)的水平也在逐步提升。在乳品獸藥殘留的檢測(cè)分析中，目前較為常用的儀器分析法、免疫分析法的靈敏度有了顯著提高。相較于儀器分析和常用免疫分析的檢測(cè)方法，熒光免疫分析技術(shù)由于靈敏度高、特異性強(qiáng)、體積小、操作簡(jiǎn)單、成本低等諸多優(yōu)勢(shì)受到科研工作者的廣泛關(guān)注，但是也存在一些問(wèn)題，需要科研工作者逐步進(jìn)行完善。如開(kāi)發(fā)、探索化學(xué)性能好，發(fā)光性能優(yōu)良，在進(jìn)一步提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度和靈敏度方面有極大潛能的新型標(biāo)記物用于抗原抗體的標(biāo)記等問(wèn)題。

相信隨著熒光免疫分析技術(shù)的不斷完善，以及自身優(yōu)勢(shì)的凸顯，其在乳品獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域中將得到更廣泛的應(yīng)用。