苦木總生物堿含量測(cè)定的透射比濁法研究

李 喬,王 寧,鄭曉麗,董星辰,許 卉

(煙臺(tái)大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺(tái)大學(xué)),山東 煙臺(tái) 264005)

苦木為苦木科植物苦木Picrasmaquassioides(D.Don) Benn.的干燥枝和葉,其味苦、性寒,具有抗菌、消炎、清火退熱、解毒、祛濕等療效,用于風(fēng)熱感冒,咽喉腫痛,濕熱瀉痢,蛇蟲咬傷[1]．苦木中主要含有生物堿、三萜和苦木內(nèi)酯3類成分[2],其中生物堿是主要的活性成分和質(zhì)量控制指標(biāo)性成分[3-7]．2015版《中國藥典》苦木藥材項(xiàng)下并未收錄含量測(cè)定項(xiàng),關(guān)于苦木總生物堿含量測(cè)定的文獻(xiàn)研究也多集中在HPLC法測(cè)定一種或者幾種生物堿含量[6,8-9],該方法雖然具有很好的專屬性和準(zhǔn)確度,但是其耗時(shí)長,且不能準(zhǔn)確測(cè)定苦木中總生物堿的含量,因此,苦木藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)亟待完善[10-11]．目前苦木藥材質(zhì)量研究尚未系統(tǒng)的主要問題為缺乏可控的對(duì)照品以及合適的含量測(cè)定方法,特別是對(duì)總生物堿的含量測(cè)定方法．

迄今,已從苦木中分離鑒定60余種生物堿類成分,涉及鐵屎米酮和β-咔巴啉2種基本骨架及其二聚體．苦木酮(Nigakinone),又稱苦木酮堿,苦木堿己,是一種鐵屎米酮型生物堿(4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮,C15H10N2O3,圖1),在眾多苦木生物堿中的天然豐度最高[9-13]．大量藥理研究表明,苦木酮具有明確的、與本品功能主治一致的生物活性,如抗菌、抗炎作用、抗病毒和細(xì)胞毒性作用[2,4-5,14-15],適于作為苦木質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分．透射比濁法是通過測(cè)定透過懸浮質(zhì)點(diǎn)介質(zhì)的光強(qiáng)度來確定懸浮物質(zhì)濃度的一種分析方法,主要用于測(cè)定能形成懸浮體的沉淀物質(zhì),例如微量磷、硫、氯和鈣等的測(cè)定,生物堿與沉淀試劑形成的混濁也可用此法測(cè)定[16]．與HPLC法相比,透射比濁法具有操作簡(jiǎn)便快捷、靈敏快速的優(yōu)點(diǎn)．基于通用生物堿沉淀劑改良碘化鉍鉀試液與生物堿類成分在適宜溶劑和酸度條件下的絡(luò)合沉淀反應(yīng),以苦木酮為對(duì)照,本研究建立了一種適用于苦木藥材中總生物堿含量測(cè)定的透射比濁法,優(yōu)化反應(yīng)和測(cè)定條件,并進(jìn)行系統(tǒng)的方法評(píng)價(jià)和驗(yàn)證,為苦木藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和方法基礎(chǔ)．

圖1 苦木酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

島津UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì);福立UV-1600型紫外-可見分光光度計(jì);METTLER TOLEDO XS105型分析天平;K-98-I型電熱恒溫水浴鍋;上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司SKHP250型超聲波清洗器;PURELAB Classic UVF型純水機(jī)．

藥材苦木(廣西桂林201408,湖南武源201408,湖南郴州201408,湖南臨武201408,廣東英德201402,江西井岡山201408,湖北荊州201505,廣東英德201507,廣東英德201505);苦木酮對(duì)照品(本實(shí)驗(yàn)室自制,經(jīng)波譜綜合分析確證化學(xué)結(jié)構(gòu),HPLC歸一化純度>99.5%);堿式硝酸鉍、碘化鉀、冰醋酸、鹽酸、乙醇均為市售分析純?cè)噭?實(shí)驗(yàn)用水為超純水．

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 試液配制

碘化鉍鉀試液:取堿式硝酸鉍0.85 g,加入冰醋酸10 mL與水40 mL超聲溶解,放置過夜;精密稱定碘化鉀8 g,加水溶解,定容至20 mL．將上述2溶液混勻即得碘化鉍鉀試液(避光保存)．改良碘化鉍鉀試液:將碘化鉍鉀試液、0.6 mol/L鹽酸水溶液、水按體積比1∶2∶7混合、搖勻,即得改良碘化鉍鉀試液(現(xiàn)用現(xiàn)配)．

2.2 溶液配制

對(duì)照品溶液:精密稱定苦木酮對(duì)照品適量,85%乙醇溶解、稀釋,制備100 μg/mL的苦木酮對(duì)照品溶液．供試品溶液:精密稱定苦木樣品粉末約1.0 g,精密加入85%乙醇50 mL于具塞圓底燒瓶中,密塞、稱重;回流提取2 h,放冷、稱重,用85%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過濾,即得供試品溶液．

2.3 比濁法測(cè)定

精密量取供試品溶液及對(duì)照品溶液各1 mL,分別置于10 mL具塞比色管中,加入2 mL改良碘化鉍鉀試液,搖勻,繼續(xù)加0.1 mol/L鹽酸定容至刻度,搖勻,即得．同時(shí)配制不含試樣或生物堿對(duì)照的空白溶液作為參比,在反應(yīng)5～20 min內(nèi),于500 nm處分別測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液反應(yīng)體系的吸光度,外標(biāo)法計(jì)算苦木試樣中總生物堿含量．

2.4 溶劑及酸度的選擇

分別考察了以水、甲醇、乙腈為溶劑的反應(yīng)體系,發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醇或乙腈在體系內(nèi)占比超過1/10時(shí)無沉淀生成,吸光度為負(fù)值或很小,且無線性關(guān)系．而以水為溶劑的體系中有橘紅色絡(luò)合物沉淀生成且吸光度呈線性,故選擇水作為溶劑．由于生物堿與沉淀劑的反應(yīng)需在酸性溶液中進(jìn)行,且沉淀劑的穩(wěn)定性受酸度影響,因此酸度考察是必要的．分別考察以水,0.05、0.1、0.2、0.5 mol/L的鹽酸水溶液為稀釋溶劑下反應(yīng)體系的穩(wěn)定性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)反應(yīng)30 min內(nèi),水反應(yīng)體系下比色管底部有黑色鉍析出;1 h內(nèi),0.05 mol/L的鹽酸水溶液反應(yīng)體系下比色管底部有黑色鉍析出;0.1、0.2、0.5 mol/L的鹽酸水溶液反應(yīng)體系均可保持24 h內(nèi)無鉍析出．又因吸光度隨酸度增大而減小,因此選擇0.1 mol/L的鹽酸水溶液作為稀釋溶劑．

2.5 反應(yīng)時(shí)間的選擇

按“2.2”項(xiàng)的方法配制苦木酮對(duì)照品溶液以及供試品溶液,按照“2.3”項(xiàng)的方法操作,并分別在反應(yīng)5、10、15、20、30、45、60 min,于500 nm處測(cè)定吸光度,考察不同的反應(yīng)時(shí)間對(duì)沉淀反應(yīng)的影響,結(jié)果如圖2所示．最終發(fā)現(xiàn)生物堿與改良碘化鉍鉀試液快速生成沉淀產(chǎn)物(<2 min),并在20 min內(nèi)吸光度保持穩(wěn)定(RSD<1.0%)．故實(shí)驗(yàn)選擇在反應(yīng)5～20 min內(nèi)完成吸光度測(cè)定．

2.6 測(cè)定波長選擇

分別精密量取0.05、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL的苦木酮對(duì)照品溶液1 mL于10 mL具塞比色管中,其余同“2.3”項(xiàng)的方法操作．以不含苦木酮對(duì)照品的空白溶液作為參比,在反應(yīng)5～20 min內(nèi),分別測(cè)定400、500、600、700 nm處吸光度(表1)．結(jié)果發(fā)現(xiàn),500 nm處測(cè)得的吸光度具有良好的線性關(guān)系,且靈敏度最高．因此選擇500 nm作為測(cè)定波長．

表1 測(cè)定波長選擇

圖2 反應(yīng)時(shí)間曲線

2.7 方法學(xué)驗(yàn)證

2.7.1 線性與范圍 精密量取0.05,0.08,0.10,0.15,0.20 mg/mL的苦木酮對(duì)照品溶液1 mL于10 mL具塞比色管中,按照“2.3”項(xiàng)的方法測(cè)定其500 nm處的吸光度．以各溶液的吸光度值A(chǔ)對(duì)相應(yīng)的對(duì)照品質(zhì)量濃度C(mg/mL)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為A=5.765 4C-0.144 4(r=0.998 4)．結(jié)果表明,苦木酮在0.05～0.20 mg/mL濃度范圍內(nèi)進(jìn)行比濁測(cè)定,具有適宜的吸光度值,且線性關(guān)系良好．

2.7.2 重復(fù)性及重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批次苦木藥材試樣,平行6份,按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,依“2.3”項(xiàng)下方法比濁測(cè)定總生物堿含量,計(jì)算得RSD 1.9%(n=6),表明方法重復(fù)性良好．另取同一批次苦木藥材試樣,分別在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員按相同方法進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算得RSD 1.8%(n=6),表明所建立的透射比濁法用于苦木藥材總生物堿含量測(cè)定重現(xiàn)性符合要求．

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.7.3 加樣回收率試驗(yàn) 取已知總生物堿含量的苦木藥材試樣9份,每份約0.5 g,精密稱定,分別加入一定量苦木酮對(duì)照品,依“2.2”、“2.3”項(xiàng)下方法操作,制備供試品溶液,比濁測(cè)定總生物堿含量,計(jì)算加樣回收率．由表2數(shù)據(jù)可見,應(yīng)用本方法對(duì)苦木藥材中總生物堿含量進(jìn)行測(cè)定,加樣回收率為85.9%～95.6%,平均回收率92.3%,RSD 4.5%(n=9),表明所建立的方法準(zhǔn)確度良好．

2.8 樣品測(cè)定

按照“2.3”項(xiàng)的方法對(duì)9批不同產(chǎn)地的苦木中總生物堿含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表3．

表3 苦木中總生物堿含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

苦木是一種常見中藥材,所富含的生物堿類成分是其清熱解毒作用的重要有效部位,被藥典列為苦木及其制劑質(zhì)量控制的指標(biāo)成分,苦木生物堿類成分定量測(cè)定方法的研究日益受到關(guān)注．其中,以分離為基礎(chǔ)的HPLC方法在專屬性和準(zhǔn)確度上優(yōu)勢(shì)突出,廣泛應(yīng)用于單一或有限幾個(gè)生物堿成分的選擇分析[6,8-11],但不能針對(duì)由為數(shù)眾多含有相同骨架結(jié)構(gòu)的生物堿物質(zhì)成分群即有效部位總量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定．本課題組前期研究建立了適用于苦木藥材及相關(guān)制劑中苦木生物總堿定量分析的酸性染料比色法,但存在操作繁瑣、耗時(shí)和測(cè)定條件不易控制的不足[17]．為此,本研究利用苦木生物堿類成分與改良碘化鉍鉀試液在適宜溶劑和酸度條件下的通用絡(luò)合沉淀反應(yīng),并以天然含量高、化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的單體生物堿苦木酮為對(duì)照,研究建立了一種透射比濁方法,該方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏快捷、精密度和準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定易重現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn),適于在苦木及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制中進(jìn)行推廣．

本研究中所測(cè)得的9批藥材總生物堿含量在3.25～9.49 mg/g范圍內(nèi),平均含量為5.36 mg/g．相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC法同時(shí)測(cè)定苦木藥材中的7種生物堿含量,這7種生物堿總含量在1.15～4.52 mg/g范圍內(nèi)[3],通過計(jì)算7種生物堿的峰面積之和與20個(gè)共有峰的峰面積之和的比值,得總生物堿含量在1.72～9.62 mg/g范圍內(nèi)．本研究測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致．

本研究由于樣本量少,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可能無法完全反映各產(chǎn)地苦木藥材的質(zhì)量情況,但從9批苦木藥材樣品的總生物堿含量數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),不同產(chǎn)地、不同批次的樣品間總生物堿含量差異明顯,相同產(chǎn)地、不同批次的樣品間同樣存在較大差異．究其原因可能是由于藥材的生長年限、采收期、采收部位的差異造成的．苦木藥材的質(zhì)量不一和不可控性必然導(dǎo)致苦木相關(guān)制劑產(chǎn)品的不穩(wěn)定．因此,對(duì)于苦木原藥材需要進(jìn)行質(zhì)量管制,應(yīng)當(dāng)建設(shè)種植苦木藥材的GAP基地,從源頭上保證其相關(guān)制劑質(zhì)量穩(wěn)定均一．

4 結(jié) 論

本研究基于生物堿與改良碘化鉍鉀試液的絡(luò)合沉淀反應(yīng),建立了一種適用于苦木藥材中總生物堿含量測(cè)定的透射比濁法,對(duì)反應(yīng)溶劑及酸度、反應(yīng)時(shí)間、穩(wěn)定劑及測(cè)定波長進(jìn)行了考察,最終確定了最優(yōu)的反應(yīng)條件．系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證表明，透射比濁法滿足定量分析的要求,能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)苦木中總生物堿含量準(zhǔn)確、快速的測(cè)定,為苦木藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了可靠的依據(jù)．