不同藥材中迷迭香酸甲酯及迷迭香酸的含量測定

丁麗敏,劉茜茜,蘇超男,鞏 釗,劉榮霞

(煙臺大學新型制劑與生物技術藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室 (煙臺大學),山東 煙臺 264005)

迷迭香酸甲酯是迷迭香酸的衍生物,廣泛存在于冬凌草、黃荊、南丹參、溪黃草和紫蘇等植物中[1-11],與迷迭香酸的不同主要在于側鏈羧基酯化. 迷迭香酸甲酯的藥理活性研究表明,在體外抗炎[12-13]、抗菌[14-15]、抗氧化[16-17]和抗心血管平滑肌細胞增殖[18]等實驗中,迷迭香酸甲酯的活性強于迷迭香酸. 關于迷迭香酸甲酯在植物中含量的報道很少[19-22]. 因此,對天然植物中迷迭香酸甲酯進行含量測定非常有必要.本實驗建立了迷迭香酸甲酯和迷迭香酸同時測定的分析方法,檢測并對比了二者在薄荷、丹參、夏枯草、紫蘇葉及迷迭香等藥材中的含量差異.

本實驗采用單因素考察法優(yōu)化迷迭香酸甲酯和迷迭香酸提取條件,開發(fā)了一種簡便、快速、準確的提取方法,并采用具有高靈敏度、高選擇性、分析時間短等優(yōu)點的超高壓液相色譜串聯(lián)質譜 (UHPLC-MS/MS) 法,對薄荷、丹參、夏枯草、紫蘇葉及迷迭香藥材中的迷迭香酸甲酯及迷迭香酸含量進行測定.

1 實驗部分

1.1 試劑

迷迭香酸 (Rosmarinic acid, RA),購自四川省維克奇生物有限公司,純度≥98%,迷迭香酸甲酯 (Methyl rosmarinate,MR) 由實驗室合成,純度≥98%,化學結構如圖1所示. 色譜純乙腈,甲醇購自默克公司. 甲酸 (FA),二甲基亞砜 (DMSO) 購自Sigma公司. 娃哈哈純凈水,購自杭州娃哈哈有限公司. 其他相關試劑均為分析純.

1.2 儀器

島津LC—30AD 超高壓液相 (日本島津公司):LC—30AD二元高壓泵、自動進樣器、在線真空脫氣機、柱溫箱;AB 4500 型三重四級桿質譜儀 (美國AB公司):電噴霧離子源 (ESI)、定量分析軟件3.0.2版本. Thermo ST8R離心機 (賽默飛世爾科技公司).

圖1 迷迭香酸甲酯及迷迭香酸結構式

1.3 藥材

迷迭香分別產自云南、四川和海南. 薄荷分別產自云南、江蘇和安徽. 丹參分別產自云南、四川和山東. 夏枯草分別產自云南、四川和安徽. 紫蘇葉分別產自云南、四川和浙江.

1.4 標準溶液的制備

分別取MR及RA對照品適量,精密稱定,用DMSO溶解并稀釋至5 mg/mL. 精密量取適量,用50%甲醇稀釋制成系列濃度的混合標準溶液,MR濃度分別為0.1,0.5,1,5,10,50,100 ng/mL;RA濃度分別為0.1,0.5,1,5,10,50,100,500 ng/mL.

1.5 供試品溶液的制備

藥材粉碎過篩 (過60目篩),取約0.1 g,精密稱定,置25 mL具塞玻璃試管中,精密加入50%甲醇25 mL,密封,放置過夜后,超聲15 min,離心,上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過,取適量濾液用50%甲醇稀釋2倍和100倍,分別用于MR與RA樣品分析.

1.6 液相色譜和質譜條件

1.6.1 色譜條件 Waters Acquity UHPLC BEH 色譜柱 (2.1×50 mm,1.7 μm);流動相為0.1% FA水 (A) 和0.1% FA乙腈 (B);洗脫梯度為:0～0.5 min,15% B→60% B,0.5～2.5 min,60% B,2.5～2.6 min,60% B→15% B,2.6～3.0 min,15% B;流速:300 μL/min;柱溫:40 ℃;進樣體積:5 μL.

1.6.2 質譜條件 ESI離子源,多反應監(jiān)測模式 (MRM),負離子模式,MR離子對 (m/z) 373.1/179.1,RA離子對 (m/z) 359.0/161.0,離子源電壓5 500 V,離子源溫度500 ℃,氣簾氣壓力35 psi, 碰撞氣壓力8 psi. MR與RA的去簇電壓分別為-93 V和-72 V,碰撞電壓分別為-25 V和-21 V.

2 結 果

2.1 線性及定量下限

以樣品濃度X為橫坐標,化合物的峰面積Y為縱坐標,采用最小二乘法加權回歸,得到線性方程. 以S/N=10計算定量下限. MR線性方程為Y=19 100X+1 810 (r=0.999);RA線性方程為Y=19 133X+1 443 (r=0.999); MR和RA所有校準濃度點準確度均在85%～115%范圍內,線性關系良好. MR與RA的定量下限 (LLOQ)均為0.1 ng/mL,色譜圖如圖2所示.

2.2 重復性

分別精密稱取藥材粉末6份,按“1.5”項下方法制備供試品溶液,通過比較各成分峰面積響應的差異,來考察該方法的重復性. 各成分峰面積差異用相對標準偏差 (RSD,%) 表示,RA和MR的峰面積差異分別為0.40%和1.38%,該結果表明方法重復性良好.

2.3 精密度

取相應對照品溶液,在“1.6”項下的色譜條件下連續(xù)進樣6次,連續(xù)測定3 d,計算化合物峰面積的日內和日間精密度. MR的日內和日間精密度分別為1.20%和4.31%;RA的日內和日間精密度別為1.28%和1.36%. MR與RA的日內日間精密度均小于5%,表明該儀器精密度良好.

2.4 加樣回收率

精密稱取已知含量的藥材6份,加入適量對照品,按“2.2”項下制備加樣供試品溶液,結果見表1. MR與RA加樣回收率均在90%～110%之間,RSD<5%,均符合要求.

2.5 穩(wěn)定性實驗

于室溫下分別在0、2、4、6、8、12、24、36 h,取相應的供試品溶液,在“1.6”項下的液質聯(lián)用條件下進樣,計算0～36 h 各樣品之間的峰面積差異(RSD,%),MR與RA的峰面積的RSD值分別為2.10%和2.59%. 該結果表明,供試品在室溫下放置36 h內穩(wěn)定性良好.

2.6 含量測定

按照“1.5”項下的供試品溶液制備方法,分別制備不同產地的薄荷、丹參、迷迭香、夏枯草及紫蘇葉的供試品溶液 (n=3). 實驗結果表明,MR和RA在藥材中的含量與藥材的種類及藥材的產地有很大關系. 含量測定結果見表2.

圖2 RA及MR色譜圖

表1 MR與RA加樣回收率 (n=3)

3 討 論

3.1 甲醇濃度的選擇

稱取0.1 g藥材粉末,分別用0%,25%,50%,75%,100%的甲醇濃度作為提取劑,以1∶250的料液比,超聲30 min進行提取,發(fā)現(xiàn)使用50%甲醇提取效率最高. 所以,選擇50%的甲醇作為提取劑.

3.2 料液比的選擇

稱取0.1 g藥材粉末,用50%甲醇做提取溶劑,分別以1∶100,1∶150,1∶200,1∶250,1∶300,1∶400,1∶500的料液比,超聲30 min進行提取,發(fā)現(xiàn)MR與RA的最佳料液比不一致,經(jīng)綜合考慮,最終選擇了1∶250的料液比進行提取.

3.3 超聲時間的選擇

稱取0.1 g藥材粉末,使用50%甲醇做提取溶劑,1∶250的料液比,分別超聲15, 30,60,90,120 min進行提取,發(fā)現(xiàn)超聲15 min與30 min無顯著性差異,超聲時間超過30 min,樣品峰面積降低. 因此,最終選擇超聲時間為15 min.

表2 不同產地各種藥材中MR與RA的含量(n=3)

3.4 MR和RA在不同藥材中的含量

本研究采用單因素考察法,優(yōu)化了MR與RA在不同產地不同藥材中的提取方法,該方法簡便、快捷、準確、易于操作. 并采用UHPLC-MS/MS方法,對不同產地不同藥材中的RA與MR進行定性與定量研究,結果表明,同一產地不同藥材之間和同一藥材不同產地之間,MR與RA含量均有較大差異. 在本實驗中,MR在夏枯草藥材中的含量高于迷迭香、丹參、紫蘇葉和薄荷藥材;RA在迷迭香藥材中的含量高于薄荷、夏枯草、紫蘇葉和丹參藥材. 而且,從該研究結果還可得知,MR在迷迭香、薄荷、丹參、夏枯草和紫蘇葉中的含量均低于RA. 該研究首次比較了不同藥材之間MR與RA的含量,有利于了解不同藥材之間MR與RA含量的差異,便于以后在疾病的治療上更好地選擇質量較好的藥材.

4 結 論

本文采用快速、簡單、準確的樣品提取方法和UHPLC-MS/MS定性定量方法首次分析了不同產地不同藥材中MR與RA的含量. 研究結果表明,在測定的5種藥材中RA的含量遠遠大于MR,MR與RA在不同藥材及不同產地之間都具有較大差異. 在本實驗中,MR在夏枯草藥材中的含量高于迷迭香、丹參、紫蘇葉和薄荷藥材;RA在迷迭香藥材中的含量高于薄荷、夏枯草、紫蘇葉和丹參藥材.