二甲基乙二?；拾彼釋?duì)間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體生物學(xué)特性的影響*

王香云，張東偉

(浙江省湖州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 313000)

目前心肌梗死的發(fā)病率和病死率仍很高[1]，用干細(xì)胞治療心肌梗死是當(dāng)下的一種新理念，其通過(guò)多重不確定的機(jī)制來(lái)修復(fù)心臟[2]。其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)易獲得、免疫排斥低，已被廣泛研究[3]。但由于干細(xì)胞移植后的低歸巢率、高凋亡率等缺陷，使得干細(xì)胞治療效果大打折扣。而干細(xì)胞通過(guò)缺氧、藥物預(yù)處理及基因改造等方法可以增加療效，其中藥物預(yù)處理具有操作較容易、細(xì)胞耐受性較好等優(yōu)勢(shì)，被廣泛研究。二甲基乙二?；拾彼?DMOG)是一種缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的穩(wěn)定劑，可以使細(xì)胞在常氧狀態(tài)下高表達(dá)HIF-1α。外泌體(exosome)是一種由細(xì)胞分泌的納米囊泡，研究發(fā)現(xiàn)其可以起到與MSCs本身幾乎一致的生物學(xué)作用[4]。本研究采用不同濃度的DMOG對(duì)MSCs進(jìn)行預(yù)處理，以探討DMOG的最佳處理濃度，并分析DMOG預(yù)處理后exosome在體內(nèi)外試驗(yàn)中的生物學(xué)作用及其可能的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 清潔級(jí)6～8周齡C57BL/6小鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供；H9C2心肌細(xì)胞凍存細(xì)胞株購(gòu)于南京科佰生物科技有限公司；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)凍存細(xì)胞株購(gòu)于賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司。

1.1.2主要儀器與試劑 倒置相差顯微鏡(德國(guó) Leica公司)；低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)；低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；低溫超速離心機(jī)(美國(guó)Becman公司)；熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Corning公司)；胎牛血清(FBS，上海普飛生物技術(shù)有限公司)；Matrigel(美國(guó)BD公司)；Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen Life Technologies公司)；DMOG試劑(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；miR-210 mimic、antogomiR-210及對(duì)照(廣州市銳博生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1MSC的培養(yǎng)及鑒定 骨髓取自6周齡C57BL/6小鼠下肢長(zhǎng)骨骨髓，并采用全骨髓培養(yǎng)，傳代至第3～4代的小鼠MSCs采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表型，具體檢測(cè)包括CD31、CD29、CD34、CD44。

1.2.2MSC預(yù)處理 以第3～4代小鼠MSCs作為DMOG預(yù)處理對(duì)象，分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組計(jì)數(shù)并接種細(xì)胞1×107個(gè)/培養(yǎng)皿，首先用含有10%FBS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，觀察細(xì)胞狀態(tài)良好后準(zhǔn)備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。DMOG用DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋為250、500、1 000、1 500 μmol/L的終濃度。之后細(xì)胞按照DMOG濃度0、250、500、1 000、1 500 μmol/L共5組預(yù)處理24 h。

1.2.3MSC來(lái)源的外泌體提取與鑒定 同時(shí)收集實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后的條件培養(yǎng)基(細(xì)胞上清液)，通過(guò)超速離心法獲得exosomes。具體步驟:(1)細(xì)胞上清液在4 ℃下多步驟離心，300×g離心10 min、2 000×g離心10 min、12 000×g離心30 min，分別去除死細(xì)胞、細(xì)胞碎片及細(xì)胞微泡(microvesicles)，獲得的細(xì)胞上清液再使用100×103超濾管濃縮，4 000×g離心15 min，之后超速離心機(jī)下4 ℃ 100 000×g離心1 h，輕棄上清液，觀察沉淀物，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，重懸后繼續(xù)4 ℃ 100 000×g離心1 h。最終獲得沉淀用50～100 μL PBS重懸，凍存于-80 ℃待用。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)exosome表面標(biāo)記如CD63、CD9等，通過(guò)電鏡觀察exosome的典型形態(tài)和粒徑大小。

1.2.4miR-210 mimic轉(zhuǎn)染試驗(yàn) 分別在H9C2心肌細(xì)胞和HUVECs中轉(zhuǎn)染miR-210 mimic。具體步驟:HUVECs或H9C2細(xì)胞分別接種到24孔板，約1×105個(gè)/孔，細(xì)胞密度70%～90%，更換培養(yǎng)基。分別稀釋lipofectamine 2000和miR-210 mimic在25 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中，等比例混勻，待室溫孵育后，每孔加入50 μL混合液，常溫下培養(yǎng)3 d。

1.2.5體內(nèi)試驗(yàn)后小鼠心肌梗死模型和小鼠心功能測(cè)定 采用8周齡的雄性C57BL/6小鼠，開(kāi)胸后結(jié)扎冠脈左前降支，實(shí)驗(yàn)分為4組:對(duì)照組(Sham組)，DMOG預(yù)處理來(lái)源exosome(ExoDMOG)組，對(duì)照exosome(Exo)組，PBS組，采用雙盲法進(jìn)行，分5點(diǎn)注射。小鼠心功能檢測(cè):按心肌梗死后術(shù)后當(dāng)天(0 d)、術(shù)后3、7、14、28 d，通過(guò)二維M型心臟超聲分別對(duì)各組小鼠進(jìn)行心功能評(píng)價(jià)。

1.2.6組織學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)按雙盲進(jìn)行，收集心肌梗死后28 d各實(shí)驗(yàn)組小鼠心臟，甲醛固定，石蠟包埋，用于后續(xù)病理切片。梗死面積的評(píng)估是以結(jié)扎線以下500 μm，對(duì)后續(xù)的組織切片用Masson′s trichrome染色評(píng)估心肌梗死面積，并用Image-pro Plus軟件分析每個(gè)心臟切面的梗死區(qū)域及整個(gè)左心室面積，心肌梗死百分比=梗死區(qū)域面積/整個(gè)左心室面積×100%。

1.2.7免疫熒光染色 用于觀察梗死周邊區(qū)小動(dòng)脈密度及心肌細(xì)胞凋亡情況。(1)小動(dòng)脈密度觀察:收集心肌梗死后28 d各實(shí)驗(yàn)組小鼠的心臟，完成組織冰凍切片后用甲醛固定，TritonX-100破膜10 min，10%牛血清蛋白(10%BSA)室溫封閉1 h，羊抗鼠α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體、兔抗鼠肌鈣蛋白I(Troponin I)抗體共同4 ℃孵育過(guò)夜，之后孵育二抗、細(xì)胞核DAPI染色，在熒光顯微鏡下觀察、拍照，每個(gè)心臟隨機(jī)選取5個(gè)切面，統(tǒng)計(jì)高倍鏡下小動(dòng)脈密度。(2)心臟組織TUNEL染色:標(biāo)本制作方法同前，組織冰凍切片采用TUNEL染色，細(xì)胞核4′,6′-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，每個(gè)心臟隨機(jī)選取5個(gè)切面，在熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)TUNEL+細(xì)胞數(shù)及DAPI+細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞凋亡率=(TUNEL+細(xì)胞總數(shù))/(DAPI+細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.8HUVECs管腔形成實(shí)驗(yàn) HUVECs管腔形成實(shí)驗(yàn)在鋪有BD matrigel的96孔板上進(jìn)行。在相差顯微鏡下觀察HUVECs形成管腔的情況，并每隔1～2 h拍照，最后統(tǒng)計(jì)管腔長(zhǎng)度。

1.2.9H9C2心肌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) H9C2凋亡實(shí)驗(yàn)(TUNEL試驗(yàn))在6孔板上進(jìn)行，將H9C2細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理24 h，根據(jù)TUNEL試劑盒染色，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞數(shù)，最后計(jì)算凋亡率。

1.2.10miR-210抑制試驗(yàn) 采用特異性抑制miR-210表達(dá)的抑制劑antagomiR-210，在DMOG預(yù)處理的同時(shí)加入antagomiR-210，收集上述處理來(lái)源的exosome(ExoDMOG+ATM)。進(jìn)一步比較體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的差異，小鼠心肌梗死模型方法同前，實(shí)驗(yàn)分為Sham組、PBS組、ExoDMOG組、ExoDMOG+ATM組，評(píng)估心肌梗死后3、7、14、28 d小鼠心功能，收集28 d小鼠心臟組織行免疫熒光染色。

2 結(jié) 果

2.1MSC來(lái)源的exosome鑒定 通過(guò)電鏡觀察exosome的形態(tài)及大小，符合典型杯狀結(jié)構(gòu)，直徑約100 nm(圖1A)。通過(guò)Western blot檢測(cè)exosome表面相關(guān)標(biāo)記物CD63、CD9均陽(yáng)性(圖1B)。對(duì)收集的exosome采用二喹啉甲酸(BCA)進(jìn)行蛋白定量，隨著DMOG的濃度增加，exosome的分泌水平有增加的趨勢(shì)，其中DMOG濃度在1 000 μmol/L時(shí)增加最明顯，但進(jìn)一步提高DMOG濃度exosome的分泌減少，可能是DMOG過(guò)量帶來(lái)的副作用(圖1C)，由此未進(jìn)一步增加DMOG濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

A:電鏡下exosome鑒定；B:Western blot對(duì)exosome的鑒定；C:BCA蛋白定量分析比較不同濃度DMOG處理后exosome分泌水平；a:P<0.05，與control組比較
圖1 MSCs-Exo的鑒定及不同濃度DMOG對(duì)exosome分泌的影響

A:HUVECS管腔形成實(shí)驗(yàn)；B:HUVECS管腔形成實(shí)驗(yàn)分析圖；a:P<0.05，與control組比較
圖2不同濃度DMOG預(yù)處理MSCs來(lái)源的exosome對(duì)促血管新生的作用

2.2不同濃度DMOG預(yù)處理MSCs來(lái)源的exosome對(duì)促血管新生的作用 收集不同濃度DMOG預(yù)處理MSC分泌的exosome，進(jìn)行HUVECS管腔形成實(shí)驗(yàn)，根據(jù)濃度不同，試驗(yàn)分為control、250 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著DMOG濃度的增加，Exo促血管新生能力亦明顯提高，其中在1 000 μmol/L濃度下最明顯，表現(xiàn)為管腔形成長(zhǎng)度增加(圖2A、B)。

2.3不同濃度DMOG預(yù)處理MSCs來(lái)源的exosome對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用 比較不同濃度DMOG預(yù)處理后MSCs來(lái)源的exosome對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用的差異，在體外進(jìn)行H9C2細(xì)胞過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的凋亡實(shí)驗(yàn)。根據(jù)濃度不同，分為control、250 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 000 μmol/L組exosome對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用最明顯，表現(xiàn)為TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞比率最低(圖3A、B)。

A:TUNNEL實(shí)驗(yàn)；B:TUNNEL實(shí)驗(yàn)分析圖；a:P<0.05，與control組比較
圖3不同濃度DMOG預(yù)處理MSCs來(lái)源的exosome對(duì)心肌細(xì)胞抗凋亡的作用

2.4DMOG處理MSC來(lái)源的exosome可以改善小鼠心肌梗死后心功能 為了明確DMOG預(yù)處理來(lái)源exosome(ExoDMOG)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中是否擁有優(yōu)異的心肌保護(hù)作用，本研究通過(guò)左冠狀動(dòng)脈前降支永久結(jié)扎，建立小鼠急性心肌梗死模型，實(shí)驗(yàn)分為Sham組、Exo組、ExoDMOG組、PBS組，由于1 000 μmol/L濃度DMOG預(yù)處理來(lái)源的exosome在體外實(shí)驗(yàn)中生物學(xué)特性明顯，故ExoDMOG組的exosome來(lái)源于1 000μmol/L濃度DMOG預(yù)處理的MSCs來(lái)源的exosome。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用雙盲法進(jìn)行，在左前降支順利結(jié)扎后，在結(jié)扎線周圍心肌組織中立即注射exosome(約收集自2×107個(gè)MSCs)或同等劑量的PBS液，分5點(diǎn)注射，每點(diǎn)約10 μL。術(shù)后當(dāng)天(0 d)，心肌梗死后3、7、14、28 d，利用小動(dòng)物心臟超聲儀系統(tǒng)檢測(cè)各組小鼠的心功能改變并記錄結(jié)果，收集28 d的小鼠心臟標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)分析。心肌梗死后28 d，ExoDMOG組小鼠心功能均較對(duì)照Exo組有明顯改善，具體表現(xiàn)在減少心肌梗死后瘢痕形成(圖4A、B)，射血分?jǐn)?shù)(EF)增加[(48.54±7.6)%vs.(20.53±8.1)%，P<0.05](圖4C、D)，并且存活率明顯增加(圖4E)。

A:小鼠心肌Masson′s trichrome染色；B:Masson′s trichrome染色分析圖；C:小鼠心臟超聲；D:小鼠心臟超聲EF結(jié)果分析圖；E:生存分析圖；a:P<0.05
圖4 DMOG處理MSC來(lái)源的exosome可以改善小鼠心肌梗死后心功能

2.5DMOG預(yù)處理對(duì)miR-210在MSC內(nèi)和其分泌的exosome表達(dá)的影響 1 000 μmol/L濃度DMOG預(yù)處理后干細(xì)胞中及exosome中miR-210均大量增加，尤以exosome中升高為主(圖5A、B)。本研究選取miR-210作為DMOG預(yù)處理后對(duì)MSC分泌的exosome生物學(xué)效益的重要研究對(duì)象。

2.6miR-210與ExoDMOG擁有類似的生物學(xué)作用 miR-210在DMOG預(yù)處理MSC分泌的exosome中的表達(dá)明顯增加，促使猜測(cè)miR-210可能是其中最主要的生物學(xué)作用表現(xiàn)者。為此，在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)，分別在HUVECs和H9C2 中轉(zhuǎn)染miR-210 mimic，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組相比對(duì)照組促血管新生能力明顯增加，表現(xiàn)為管腔形成長(zhǎng)度增加(圖6A、B)，另外實(shí)驗(yàn)組H9C2在H2O2誘導(dǎo)下的凋亡率明顯降低(圖6C、D)。這與ExoDMOG的生物學(xué)作用相一致。

2.7antagomiR-210削弱ExoDMOG的生物學(xué)作用 為進(jìn)一步明確miR-210在ExoDMOG的作用，采用特異性抑制miR-210表達(dá)的抑制劑antagomiR-210。結(jié)果顯示，ExoDMOG+ATM組的小鼠心功能(EF值)較ExoDMOG組明顯降低，與PBS組相仿(圖7A、B)；同時(shí)，免疫熒光染色證實(shí)ExoDMOG+ATM組在心肌細(xì)胞保護(hù)和血管新生方面的作用也明顯降低，具體表現(xiàn)在TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較ExoDMOG組增加(圖7C、D)，α-SMA染色的小動(dòng)脈密度較ExoDMOG組減少(圖7E、F)。

A:MSCs細(xì)胞水平miR-210 PCR分析圖；B:exosome水平miR-210 PCR分析圖；a:P<0.05，與control組比較
圖5 DMOG預(yù)處理對(duì)miR-210在MSC細(xì)胞水平和exosome水平的影響

A:HUVECS管腔形成實(shí)驗(yàn)；B:HUVECS管腔形成實(shí)驗(yàn)分析圖；C:Western blot檢測(cè)Cleavd-caspase3表達(dá)差異；D:Cleavd-caspase3結(jié)果分析；a:P<0.05，與NC組比較
圖6 miR-210的生物學(xué)作用分析

A:小鼠心臟超聲；B:小鼠心臟超聲EF結(jié)果分析圖；C:小鼠心肌組織梗死周邊細(xì)胞TUNEL染色，箭頭所示為TUNEL+細(xì)胞(紅色)，細(xì)胞核為DAPI染色(藍(lán)色)，心肌組織Troponin I染色(綠色)；D:TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析；E:免疫熒光染色心鼠心肌組織心肌梗死后梗死周邊區(qū)小動(dòng)脈密度，細(xì)胞核DAPI染色(藍(lán)色)，小動(dòng)脈α-SMA染色(綠色)；F:小動(dòng)脈密度(α-SMA+細(xì)胞)結(jié)果分析；a:P<0.05
圖7 antagomiR-210削弱ExoDMOG的生物學(xué)作用

3 討 論

干細(xì)胞移植療法可改善心肌梗死后心功能，其可能通過(guò)旁分泌等多種機(jī)制發(fā)揮作用[2]。但由于移植后干細(xì)胞歸巢率低、凋亡率高等缺陷，使其治療效果并不明確。研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理干細(xì)胞可以增強(qiáng)干細(xì)胞移植后的功效，預(yù)處理的方法有很多，包括藥物、條件、基因修飾等，如缺氧條件預(yù)處理能提高干細(xì)胞修復(fù)心肌的能力[5-6]。由于藥物預(yù)處理操作簡(jiǎn)單，使其被廣泛研究。DMOG是一種HIF-1α的穩(wěn)定劑，在常氧條件下加入適當(dāng)濃度的DMOG可以使細(xì)胞中的HIF-1α處于穩(wěn)定狀態(tài)，類似于缺氧狀態(tài)。既往研究發(fā)現(xiàn)，DMOG預(yù)處理可以增強(qiáng)MSCs的促血管新生[7]，提高存活率[8]，促進(jìn)分化[9]等。

最新的研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞可以分泌大量被稱為exosome的納米顆粒。而exosome可能在MSC的旁分泌作用中扮演相當(dāng)重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)，exosome發(fā)揮多種生物學(xué)作用，包括促血管新生[10]、神經(jīng)再生[11]和修復(fù)心臟[12]等。如果exosome能被研發(fā)成為生物制劑用于治療疾病，可以成為干細(xì)胞治療的替代方法，可能成為未來(lái)醫(yī)學(xué)的研究方向。本研究通過(guò)不同濃度的DMOG預(yù)處理MSCs并收集exosome，發(fā)現(xiàn)在1 000 μmol/L濃度下exosome的分泌水平最高，但增加濃度未見(jiàn)進(jìn)一步升高，可能與藥物副作用相關(guān)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，1 000 μmol/L濃度預(yù)處理來(lái)源的exosome在體內(nèi)外心肌保護(hù)、血管新生作用上優(yōu)勢(shì)明顯。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照組，干細(xì)胞DMOG預(yù)處理分泌的exosome表達(dá)譜差異明顯，可以肯定的是DMOG處理后干細(xì)胞分泌的exosome中包含HIF-1α誘導(dǎo)的miRNA[13]，如miR-210，其由HIF-1α特異性調(diào)控[14]。miR-210被認(rèn)為可以改善血管新生[15-17]、保護(hù)細(xì)胞存活、抗凋亡[18-19]。與其他文獻(xiàn)報(bào)道一致，本研究發(fā)現(xiàn)DMOG預(yù)處理MSCs分泌的exosome中miR-210顯著表達(dá)。同時(shí)作者也發(fā)現(xiàn)通過(guò)體外轉(zhuǎn)染miR-210 mimic到受體細(xì)胞中，其結(jié)果與ExoDMOG的生物學(xué)作用相類似。然而加入miR-210的抑制劑antogomiR-210后，DMOG預(yù)處理收集的exosome(ExoDMOG+ATM),在心肌梗死模型中改善梗死后心功能、心肌細(xì)胞保護(hù)、血管新生方面較ExoDMOG明顯減弱。由此認(rèn)為，DMOG預(yù)處理MSCs分泌的exosome在血管新生、心肌保護(hù)作用方面表現(xiàn)更加優(yōu)異，其可能是通過(guò)miR-210來(lái)發(fā)揮生物學(xué)作用。

綜上所述，DMOG預(yù)處理MSCs來(lái)源的exosome擁有更佳的心臟保護(hù)能力，表現(xiàn)在體外實(shí)驗(yàn)中更好地促管腔形成、心肌細(xì)胞凋亡，以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中改善心肌梗死后小鼠心功能、小鼠存活率等。其可能的原因是在DMOG預(yù)處理?xiàng)l件下，HIF-1α得以穩(wěn)定，其下游的靶基因得以激活，DMOG預(yù)處理來(lái)源的exosome中miR-210的表達(dá)水平明顯上升。通過(guò)miR-210 mimic轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，其在血管新生、心肌細(xì)胞抗凋亡等方面與DMOG預(yù)處理來(lái)源的exosome具有相同的生物學(xué)作用。由此推測(cè)ExoDMOG的生物學(xué)作用可能主要通過(guò)miR-210實(shí)現(xiàn)。本研究也證實(shí)DMOG預(yù)處理是一種有效、安全的方式來(lái)提升干細(xì)胞來(lái)源的exosome對(duì)心肌梗死動(dòng)物模型的生物療效，可作為今后用于優(yōu)化exosome替代治療療效的一種方法。