miR-455-5p在上皮性卵巢癌中表達研究及其靶基因功能分析

呂博文 錢 鈞 王 杰 錢景榮 盧瑩瑩 蘇麗菊 楊桐樹 李文輝

上皮性卵巢癌是卵巢癌中最常見的病理類型，占全部卵巢癌患者的90%，由于其原發(fā)于盆腔深部，缺乏有效的診斷方法，70%患者發(fā)現(xiàn)時已處于癌癥晚期失去了最佳手術(shù)時機。最新研究顯示，上皮性卵巢癌患者病死率仍然較高，5年生存率僅為40%～50%[1-2]。迄今為止，上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機制仍不完全明了，探索上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋求有效的診斷治療方法一直以來都是卵巢癌研究的熱點。MicroRNA(miRNA)是一簇長度約為22個寡核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子，在植物、動物甚至一些病毒中高度保守。miRNA可以通過負向調(diào)控靶基因信使RNA(mRNA)穩(wěn)定性和/或抑制靶基因mRNA翻譯而發(fā)揮基因表達的負向調(diào)節(jié)作用[3-4]。大量研究證實，miRNA可以在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個階段發(fā)揮重要作用[6-8]。近年來累計的研究表明，miR-455-5p在多種腫瘤中發(fā)揮著重要作用，在子宮內(nèi)膜漿液性腺癌[9]、基底細胞癌[10]、喉癌[11]以及肝細胞癌[12]中，miR-455-5p的表達水平與患者臨床病理特征相關(guān)，可以作為預(yù)后及診斷的生物標志物；在黑色素細胞瘤中，miR-455-5p抑制CPEB1表達對腫瘤的轉(zhuǎn)移有促進作用[13]。然而，目前miR-455-5p在上皮性卵巢癌中的研究尚未見報道。本研究通過分析上皮性卵巢癌中miRNA表達數(shù)據(jù)，篩選miRNA差異表達譜，分析miR-455-5p在上皮性卵巢癌中表達情況并進行qRT-PCR驗證，隨后應(yīng)用生物信息學方法分析miR-455-5p靶基因參與的通路及功能，探討miR-455-5p對上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展的影響。

1 材料方法

1.1 miRNA數(shù)據(jù)

從美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫下載上皮性卵巢癌miRNA表達數(shù)據(jù)GSE83693中四對上皮性卵巢癌和正常卵巢上皮miRNA表達數(shù)據(jù)。

1.2 試劑

培養(yǎng)細胞總 RNA 提取試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；逆轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；人正常卵巢上皮細胞系IOSE-80細胞，上皮性卵巢癌細胞系 A2780、OVCAR3和SKOV-3細胞均購自中國科學院上海細胞庫。

1.3 方法

1.3.1 差異表達miRNA篩選及注釋 下載GEO數(shù)據(jù)庫GSE83693數(shù)據(jù)集原始數(shù)據(jù)，選擇上皮性卵巢癌數(shù)據(jù)4組(GSM2212808，GSM2212809，GSM2212810，GSM2212811)、正常卵巢上皮數(shù)據(jù)4組(GSM2212820，GSM2212821，GSM2212822，GSM2212823)。應(yīng)用MAS 5.0算法對原始數(shù)據(jù)進行標準化預(yù)處理。使用R語言Limma程序包進行差異表達分析，篩選閾值為：Fold Change(差異表達倍數(shù))≥|2.0|，P<0.05。應(yīng)用pheatmap程序包繪制熱圖對差異表達miRNA進行無監(jiān)督分層聚類。應(yīng)用在線生物信息分析工具Sanger_V1.0.8繪制差異表達基因火山圖。

1.3.2 KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析 應(yīng)用DIANA TOOLS數(shù)據(jù)庫對miR-455-5p的靶基因進行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，通路富集結(jié)果應(yīng)用R語言軟件ggplot2程序包繪制成柱狀圖。

1.3.3 GO(Gene oncology)功能注釋分析 篩選KEGG分析腫瘤相關(guān)通路涉及的靶基因，應(yīng)用DAVID(The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)進行基因GO功能注釋分析，設(shè)定閾值P<0.01，應(yīng)用R語言軟件ggplot2程序包繪制成柱狀圖。

1.3.4 細胞培養(yǎng) 人正常卵巢上皮細胞(IOSE-80)和上皮性卵巢癌細胞(A2780，OVCAR3，SKOV-3)置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.5 qRT-PCR驗證上皮性卵巢癌細胞中miR-455-5p的表達實驗 利用Trizol-離心柱法提取細胞總RNA，以相應(yīng)溶劑為對照(Blank)，取2 μL RNA溶液于Merinton SMA4000檢測，觀察A260/A280、A260/A230比值及連續(xù)波長吸收峰，并計算RNA溶液濃度，判斷RNA提取質(zhì)量：A260/A280>2.0且<2.3，則可以滿足后續(xù)qRT-PCR所需。參照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為c DNA，引物序列：miR-455-5p上游引物5′-GCC GTA TGT GCC TTT GGA CT-3′，下游引物5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；U6上游引物5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。反應(yīng)體系為20 μL：2×qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.2 μL，ROX染料 0.4 μL，RT反應(yīng)液(cDNA)2 μL，H2O 8 μL。反應(yīng)程序：擴增曲線：95℃ 5 min 1cycle；95℃ 5 s，60℃ 31 s 40 cycles。熔解曲線：95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s 。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 miRNA表達譜顯示miR-455-5p在上皮性卵巢癌中呈現(xiàn)顯著低表達

為探究miR-455-5p在上皮性卵巢癌中是否存在差異性表達，通過差異分析篩選出上皮性卵巢癌與正常卵巢上皮之間明顯差異表達的miRNA，分析miR-455-5p是否包含其中。差異分析結(jié)果顯示，共有明顯差異表達miRNA 101個，其中上調(diào)miRNA 34個，下調(diào)miRNA 67個，其中包含miR-455-5p(表1)。分層聚類熱圖(圖1)與差異表達火山圖(圖2)顯示，在所有差異表達miRNA中，miR-455-5p呈明顯低表達，與正常卵巢上皮樣本相比差異倍數(shù)為-2.923，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 上皮性卵巢癌與正常卵巢上皮差異表達miRNA聚類分析熱圖Figure 1 Heat map and unsupervised hierarchical cluster of differential expression miRNA between epithelial ovarian cancer samples and normal ovarian epithelial samplesNote: T for tumor tissue;N for normal tissue;Color shows the expression of miRNA was reduced from red to green，and miR-455-5p was noticed use red line.

表1 上皮性卵巢癌中差異表達miRNA信息Table 1 Information for miRNAs differentially expressed in epithelial ovarian cancer

Note：logFC>0 means up-regulate and logFC<0 means down-regulate in ovarian cancer compared with normal ovary epithelium.

圖2 上皮性卵巢癌與正常卵巢上皮差異表達miRNA火山圖Figure 2 Volcano plots for the differential expression miRNA between epithelial ovarian cancer samples and normal ovarian epithelial samplesNote：Volcano plots show the relationship between fold change and statistical significance.The red and green dots in the plot denote up and down regulated by mi-RNA with a fold change ≥|2.0| and a P<0.05.The differential expression of miR-455-5p is noticed using a red arrow.

2.2 miR-455-5p表達情況驗證

為驗證miR-455-5p在上皮性卵巢癌中的表達情況的預(yù)測結(jié)果，選擇上皮性卵巢癌細胞系三種(A2780，OVCAR-3，SKOV-3)，正常卵巢上皮細胞系一種(IOSE-80)作為對照，應(yīng)用qRT-PCR 檢測miR-455-5p表達情況。qRT-PCT結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌細胞A2780，OVCAR-3，SKOV-3中miR-455-5p表達量明顯低于正常卵巢上皮細胞IOSE-80，差異均有統(tǒng)計學意義(F=365.509，P<0.01)(圖3)。

2.3 miR-455-5p調(diào)控的靶基因KEGG通路富集分析

為研究miR-455-5p下調(diào)對上皮性卵巢癌的影響，應(yīng)用miRNA數(shù)據(jù)庫TarBase v7.0對miR-455-5p調(diào)控的靶基因進行預(yù)測，共預(yù)測出受miR-455-5p調(diào)控的靶基因241個，通過DIANA TOOLS對這241個靶基因進行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，這些靶基因主要參與的通路共5個，包括有TGF-β信號通路(TGF-beta signaling pathway)，Hippo信號通路(Hippo signaling pathway)，ECM-受體相互作用通路(ECM-receptor interaction pathway)，癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)通路(Transcriptional misregulation in cancer)，慢性粒細胞白血病(Chronic myeloid leukemia)(圖4)，這些通路均與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

圖4 miR-455-5p靶基因KEGG通路富集分析Figure 4 KEGG pathway enrichment analysis of miR-455-5p target genesNote：X axis.Gene Count；Y axis.KEGG pathway；Color shows P value which reduce from red to blue.

2.4 腫瘤相關(guān)通路中miR-455-5p靶基因的GO功能富集分析

為進一步分析miR-455-5p靶基因在上皮性卵巢癌中的功能，對參與腫瘤相關(guān)通路的靶基因進行GO功能注釋，結(jié)果顯示參與上述腫瘤相關(guān)通路的miR-455-5p靶基因共有13個(表2)，這13個靶基因主要參與蛋白質(zhì)磷酸化(Protein phosphorylation)，促進細胞增殖、遷移(Positive regulation of cell proliferation，positive regulation of cell migration)，抑制細胞凋亡(Negative regulation of apoptotic process)，促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Positive regulation of epithelial to mesenchymal transition，mesenchymal cell differentiation)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter，transcription factor binding，negative/positive regulation of transcription，DNA-templated)及調(diào)控細胞周期(Cell cycle arrest)等多項功能(圖4)，這些功能的失調(diào)與上皮性卵巢癌發(fā)生密切相關(guān)。

表2 腫瘤相關(guān)通路的miR-455-5p靶基因Table 2 miR-455-5p targeted genes in the KEGG pathway

圖5 腫瘤相關(guān)通路中miR-455-5p靶基因GO功能注釋分析Figure 5 GO functional annotation analysis of miR-455-5p targeted genes in cancer related signaling pathwayNote：X axis for Gene count;Y axis for GO functional annotation；Color shows P value reduced from red to blue.

3 討論

上皮性卵巢癌發(fā)病機制不明、缺乏有效早期診斷標志、死亡率居高不下，已成為婦科腫瘤治療過程中亟待解決的問題之一。目前，隨著研究的深入，miRNA已逐漸被認為是腫瘤診斷及治療的潛在生物學靶標。一些miRNA，如miR-200c、miR-30、miR-494等已證實在卵巢癌中存在差異表達并與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，可能成為潛在的診斷及治療靶點[14-15]。因此，尋找與上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNA，完善上皮性卵巢癌中miRNA表達及機制研究對于疾病的診治至關(guān)重要。

以往的研究表明，miR-455-5p在多種腫瘤中存在表達失調(diào)，可作為癌或抑癌基因參與疾病發(fā)展，例如在非小細胞肺癌中，miR-455-5p通過靶向抑制SOCO3表達促進腫瘤細胞增殖及轉(zhuǎn)移[16]；在乳腺癌中，miR-455-5p可以通過調(diào)節(jié)CDK14的表達發(fā)揮腫瘤抑制作用[17]。目前，關(guān)于miR-455-5p在上皮性卵巢癌中的研究尚未見報道，為研究miR-455-5p在上皮性卵巢癌中的表達情況，本研究通過分析上皮性卵巢癌miRNA表達情況，獲得差異表達miRNA譜，預(yù)測miR-455-5p的表達情況，分析結(jié)果顯示，miR-455-5p在上皮性卵巢癌中表達明顯下調(diào)，隨后的qRT-PCR驗證試驗證實了表達譜的預(yù)測，與正常卵巢上皮細胞相比，miR-455-5p在上皮性卵巢癌細胞中的表達明顯降低。

由于miRNA的功能主要是通過調(diào)控下游靶基因?qū)崿F(xiàn)的，為進一步研究miR-455-5p下調(diào)對上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展的影響，本研究利用生物信息學軟件對miR-455-5p的靶基因進行了KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)miR-455-5p的靶基因主要富集在TGF-β信號通路、Hippo信號通路、ECM-受體相互作用以及癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等通路，而以往研究已證實，這些通路的失調(diào)與腫瘤的發(fā)生密不可分，例如，在多種腫瘤中存在TGF-β信號傳導(dǎo)失調(diào)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，抑制其傳導(dǎo)信號是癌癥治療的新興策略[18]；在卵巢癌中，多種癌基因通過抑制Hippo信號通路促進腫瘤增殖、介導(dǎo)化療耐藥等[19-20]；在腎細胞癌中，通過調(diào)控EMC受體連接通路中相關(guān)蛋白的表達，可以發(fā)揮促進腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移的作用[21]。miR-455-5p的靶基因編碼參與這些通路的重要蛋白，當miR-455-5p表達下降時這些基因表達失控進而影響這些腫瘤相關(guān)通路導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。此外本研究還對參與這些腫瘤相關(guān)通路的靶基因進行了GO功能注釋分析，結(jié)果顯示，這些基因編碼的蛋白大多參與促進調(diào)控細胞增殖、轉(zhuǎn)移，抑制凋亡，調(diào)控蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄、磷酸化等腫瘤密切相關(guān)的功能，當miR-455-5p下調(diào)時，這些靶基因表達增多可能導(dǎo)致這些腫瘤相關(guān)功能的異常放大。

本研究通過篩選上皮性卵巢癌中miRNA差異表達譜，并從組織及細胞水平證實miR-455-5p在上皮性卵巢癌中表達呈顯著下調(diào)；通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)miR-455-5p的靶基因編碼的蛋白參與了多種腫瘤相關(guān)通路及功能，說明miR-455-5p下調(diào)在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。然而，目前本研究僅對miR-455-5p靶基因的功能進行了初步的探討，下一步，我們將著重對miR-455-5p在上皮性卵巢癌中的功能及機制進行實驗研究。未來我們還將著重進行上皮性卵巢癌中miR-455-5p失調(diào)機制的探討。miR-455-5p及其靶蛋白的相關(guān)研究有望為上皮性卵巢癌早期診斷、預(yù)后評估及臨床治療提供新的靶點。