中江縣丹參連作土壤細(xì)菌多樣性研究

陳 章，王強(qiáng)鋒，陳 強(qiáng)，劉軼豪，張凌子

( 1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息與農(nóng)村經(jīng)濟(jì)研究所，四川 成都 610066; 2. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，四川 成都 610066; 3. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，四川 溫江 611130)

【研究意義】丹參(SalviamiltiorrhizaBge)為多年生草本唇形科鼠尾草屬植物，以根入藥，對(duì)心血管系統(tǒng)疾病療效顯著，是四川的主要道地中藥材[1]。近年來，隨著中醫(yī)藥大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，丹參人工栽培面積快速擴(kuò)大，但連作障礙卻成為制約優(yōu)質(zhì)丹參生產(chǎn)的重要因素，因此亟需解決連作難題，促進(jìn)丹參產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展。【前人研究進(jìn)展】王剛云和李先恩等[2-3]研究表明，大部分丹參連作障礙的發(fā)生與多種病原菌有關(guān)，且屬于土傳病害。近年來對(duì)丹參的研究，主要集中于丹參栽培，包括種植方式與密度[4]、生防菌劑應(yīng)用與丹參品質(zhì)[5-7]，連作土壤浸提物變化[8-9]，以及丹參輪作[10-11]和丹參不同連作年限的土壤微生物變化[12-14]等方面。目前僅有少許研究丹參連作過程中正常生長(zhǎng)丹參根際與非根際土壤、患病丹參根際與非根際土壤真菌類群差異[12]，但細(xì)菌類群變化未見報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本論文采用可培養(yǎng)技術(shù)和PCR-DGGE技術(shù)，開展丹參GMP基地連作土壤細(xì)菌群落特征研究，旨在弄清楚丹參連作根際和非根際土壤細(xì)菌群落變化，為進(jìn)一步解決丹參連作障礙提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集

采樣點(diǎn)在四川省中江縣石泉鄉(xiāng)GMP丹參種植基地，土壤類型為石灰性紫色土壤，土壤丹參連作8年。分別采集正常生長(zhǎng)和患病丹參各10株連同植株與土壤一起裝入無菌采樣袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。按照患病丹參根際(HD1)和非根際(HD2)，正常生長(zhǎng)丹參根際( CK1)和非根際(CK2)收集土樣。

1.2 可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性

1.2.1 土壤細(xì)菌的分離 采用稀釋涂布平板法[15]。將土壤制成10-1～10-7系列稀釋懸液，取10-5、10-6、10-7梯度，采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板表面涂布，37 ℃培養(yǎng)2～3 d，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行劃線純化，結(jié)合鏡檢獲得供試細(xì)菌純培養(yǎng)，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面保存4 ℃冰箱備用。

1.2.2 菌株DNA提取 將純化的菌株接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)8 h。將菌液轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管，4 ℃、10 000 r·min-1離心2 min，棄上清液，加入200 μl 1×TE緩沖液，再加入2 μl 20 mg·mL-1的溶菌酶和2 μl 10 mg·mL-1的蛋白酶K，37 ℃水浴1 h，后續(xù)步驟參照陳強(qiáng)等[16]的方法。

1.2.3 16S rDNA PCR-RFLP分析 16S rDNA序列擴(kuò)增引物及反應(yīng)體系參見文獻(xiàn)[17]。PCR產(chǎn)物用4種限制性內(nèi)切酶HaeⅢ、HinfⅠ、MspⅠ及TaqⅠ在37 ℃(TaqⅠ在65 ℃)酶切8 h。酶切反應(yīng)體系為10 μl，其中包括1 μl酶(10 U·μl-1)，1 μl 10×Buffer，1 μl BSA(1 mg·mL-1)，5 μl 16S rDNA的PCR產(chǎn)物和2 μl ddH2O。酶切產(chǎn)物用2 %的瓊脂糖凝膠在80 V電壓條件電泳分離2.5 h，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，圖譜采用NTSYS軟件，用非加權(quán)平均連鎖法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析[12]。

1.2.4 16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 采用生物瓊脂糖凝DNA膠回收試劑盒(EZ-10 Spin Column PAGE Gel DNA Extraction Kit)對(duì)已擴(kuò)增的16S rDNA PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后送生基因測(cè)序公司測(cè)序。在NCBI中將菌株16S rDNA序列BLAST比對(duì)，取與之相似的菌株16S rDNA序列，用MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

1.3 免培養(yǎng)細(xì)菌多樣性

1.3.1 土壤總DNA提取 參見文獻(xiàn)[12]，土樣加入9 mL DNA 提取液混勻，再加入450 μl 溶菌酶(20 mg·mL-1)，37 ℃水浴30 min，其間搖動(dòng)數(shù)次；然后加入50 μl蛋白酶K (10 mg·mL-1)，37 ℃水浴30 min，后續(xù)步驟參見Zhou 等[19]的方法進(jìn)行。

1.3.2 PCR-DGGE 采用嵌套式PCR擴(kuò)增，第一輪： 進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增[17]，然后用特異引物GC-F984/R1378擴(kuò)增第二輪獲得大約430 bp的片段用于DGGE分析[20]。

取20 μl第2輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE，采用Bio-Rad公司的DcodeTM基因突變檢測(cè)系統(tǒng)，DGGE參數(shù)為：8 %聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度梯度35 %～65 %，150 V電壓下預(yù)電泳10 min，隨后在85 V的固定電壓，60 ℃下電泳11 h。電泳結(jié)束后銀染[21]，條帶克隆測(cè)序。

1.3.3 DGGE圖譜分析 DGGE圖譜采用Bio-rad的Quantity One分析軟件進(jìn)行微生物多樣性分析[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性

從供試丹參種植土壤共分離出46株細(xì)菌純培養(yǎng)物，其中正常生長(zhǎng)丹參根際土壤(CK1)17株，正常生長(zhǎng)丹參非根際土壤(CK2)8株；患病丹參根際土壤(HD1)12株，患病丹參非根際土壤(HD2)9株。菌株編號(hào)ZJZG代表正常根際土壤(CK1)，ZJZF代表正常非根際土壤(CK2)，ZJHG代表患病根際土壤(HD1)，ZJHF代表患病非根際土壤(HD2)。從丹參根際土壤分離的可培養(yǎng)細(xì)菌高于非根際土壤，說明根系分泌物對(duì)土壤細(xì)菌有較大的影響。

提取土壤基因組DNA，1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，條帶清晰、整齊，無拖尾現(xiàn)象，說明土壤DNA提取質(zhì)量較高。以土壤細(xì)菌基因組DNA為模板擴(kuò)增16S rDNA片段，獲得1500 bp的特異性片段。酶切圖譜進(jìn)行聚類分析，在50 %的水平上，全部菌株聚在一起；在79 %相似水平處，全部供試菌株被分成分為7個(gè)遺傳群(圖1)，其中，ZJHF06，ZJHG09，ZJHF09 和ZJZF04分別單獨(dú)成群；群Ⅰ由來源于4種土樣的27個(gè)菌株組成； ZJHF08，ZJHG06，ZJHG07組成群Ⅲ； ZJZG06和ZJZG10組成群Ⅵ。從4種土壤中分離的細(xì)菌，既有細(xì)菌處于同一個(gè)遺傳群，也有細(xì)菌構(gòu)成特有的遺傳群。

選取12個(gè)細(xì)菌為代表菌株，其16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹形成了5個(gè)分支(圖2)。分支1為芽孢桿菌屬(Bacillus)，分支2為短桿菌屬(Brevibacterium)，分支3為拜葉林克氏菌屬(Beijerinckia)，分支4為假單胞菌屬(Pseudomonas)?？梢?，中江丹參連作土壤細(xì)菌主要類群為芽孢桿菌屬細(xì)菌(Bacillus)。不同生長(zhǎng)狀態(tài)的丹參土壤，可培養(yǎng)細(xì)菌也表現(xiàn)出了差異，其中，短桿菌屬和拜葉林克氏菌屬出現(xiàn)在患病根際土壤；而假單胞菌屬出現(xiàn)在丹參正常生長(zhǎng)的根際和非根際土壤。

圖1 細(xì)菌16S rDNA PCR-RFLP UPGMA 樹狀圖Fig.1 UPGMA dendrogram generated from the positive bacteriaof 16S rDNA PCR-RFLP

2.2 免培養(yǎng)細(xì)菌多樣性

2.2.1 土壤總DNA提取及16S rDNA擴(kuò)增 土壤總DNA純化后，經(jīng)0.8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，大于23 kb，條帶清晰、整齊，無拖尾現(xiàn)象，質(zhì)量較好。土壤總DNA經(jīng)過巢式PCR，第一輪獲得大小約1500 bp的16S rDNA片段，陰性對(duì)照無擴(kuò)增條帶，第二輪獲得約430 bp的片段，與預(yù)期一致。

2.2.2 DGGE圖譜分析 變性梯度凝膠電泳結(jié)果表明，不同樣品間DGGE條帶強(qiáng)度和遷移位置都有所不同(圖3)?；疾〉⒏H土壤(HD1)與其他土壤的條帶差異很大。其中，相比正常生長(zhǎng)丹參根際土壤(CK1)，條帶XB2，XB3，XB4，XB5為患病丹參根際土壤(HD1)所特有，而XA1，XD6，XD7為其它3種土樣所特有，這說明患病丹參根際土壤細(xì)菌類群發(fā)生較大變化。

采用UPGMA對(duì)供試土壤DGGE圖譜進(jìn)行聚類(圖4)，供試樣品形成3個(gè)分支，CK1和CK2為1個(gè)分支，與患病丹參土壤樣品HD1和HD2明顯分離開。正常生長(zhǎng)和患病丹參種植土壤，不同土壤樣品的DGGE條帶存在差異，說明丹參種植過程中，根際與非根際細(xì)菌類群發(fā)生了顯著變化，尤其是患病丹參的根際和非根際差異極大，表明其細(xì)菌類群在連作過程中已經(jīng)發(fā)生較大的變化。

圖2 代表菌株的16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences of the representative isolates

圖3 土壤細(xì)菌PCR-DGGE圖譜Fig.3 PCR-DGGE profiles of the soil bacterial community

圖4 土壤細(xì)菌DGGE條帶圖譜聚類分析Fig.4 Cluster analysis based on DGGE bands profiles

2.2.3 DGGE條帶克隆測(cè)序分析 選取7個(gè)典型DGGE條帶進(jìn)行克隆測(cè)序，絕大多數(shù)條帶為未培養(yǎng)細(xì)菌(Uncultured bacterium)，占所有條帶的71.43 %；僅有2個(gè)條帶為可培養(yǎng)菌，條帶XB2代表了可培養(yǎng)的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，條帶XB3代表了為可培養(yǎng)的堅(jiān)強(qiáng)腸球菌(Enterococcusdurans)，其相似性達(dá)99 %(表1)。

表1 DGGE條帶的序列相似性比對(duì)

3 討 論

盡管傳統(tǒng)的板分離技術(shù)只能獲得環(huán)境微生物總數(shù)的0.1 % ～10.0 %[23]，不利于研究環(huán)境樣品的微生物多樣性，但稀釋平板法可通過分離、純化得到純菌株，鑒定明確分類地位，這對(duì)于弄清不同種植方式對(duì)丹參土壤細(xì)菌群落的影響具有積極意義。本研究分離獲得的46個(gè)菌株，雖然只分布在芽孢桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、拜葉林克氏菌屬(Beijerinckia)和假單胞菌屬(Pseudomonas)，但研究結(jié)果較好地揭示出了不同處理間細(xì)菌種群差異，且以芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)種群，這有助于進(jìn)一步篩選促進(jìn)丹參生長(zhǎng)的有益菌株。

與此同時(shí)，應(yīng)用PCR-DGGE免培養(yǎng)技術(shù)分析了土壤細(xì)菌群落，其結(jié)果顯示，PCR-DGGE結(jié)果與純培養(yǎng)結(jié)果完全不同，代表性條帶大多為不可培養(yǎng)細(xì)菌，僅有2個(gè)條帶代表了可培養(yǎng)的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，堅(jiān)強(qiáng)腸球菌(Enterococcusdurans)，而這2個(gè)菌株未在純培養(yǎng)物中出現(xiàn)。相關(guān)研究表明，植物在連作過程中，其根系分泌物和殘落物亦會(huì)對(duì)根際微生物群落產(chǎn)生影響[26-27]。PCR-DGGE能較好地反映丹參患病土壤和正常土壤細(xì)菌類群的差異，盡管大多數(shù)條帶都是未鑒定細(xì)菌(Uncultured bacterium)，這與林貴兵的研究相似[11]，也說明丹參連作障礙的發(fā)生機(jī)理極為復(fù)雜。

4 結(jié) 論

本研究表明，不同的丹參種植土壤樣品間，既有分類地位相同的細(xì)菌種類存在，也有各自特有的細(xì)菌種群，這為進(jìn)一步探明丹參連作障礙發(fā)生機(jī)理，進(jìn)而控制連作障礙提供微生物學(xué)理論依據(jù)。