紅麻線粒體基因atp6過表達載體的構建與轉(zhuǎn)化

韋美玲，廖小芳，李枝玲，周步進，鄭 杰，孔祥軍，劉一丁，李宏偉，周瑞陽*

(1.廣西大學農(nóng)學院， 廣西 南寧 530004；2.廣西農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所， 廣西 南寧 530007)

【研究意義】紅麻(HibiscuscannabinusL.)是錦葵科(Malvaceae)木槿屬(Hibiscus)一年生韌皮纖維作物，其莖稈和韌皮纖維已廣泛應用于造紙、紡織、汽車制造及家具等領域，是我國重要的經(jīng)濟作物[1-2]。紅麻具有耐旱、易栽培等特點，適宜種植區(qū)域廣，且具有極大的生物產(chǎn)量和較強的二氧化碳吸收能力。因此，紅麻被認為是21世紀最具潛力的經(jīng)濟作物[3]。紅麻以收獲莖稈或韌皮纖維為主要栽培目的，其雜種優(yōu)勢十分明顯。2002年，周瑞陽教授在海南冬繁的紅麻野生型UG93后代中發(fā)現(xiàn)一株雄性不育突變體，當即以栽培種為父本與之雜交(測交)，發(fā)現(xiàn)部分F1代表現(xiàn)完全雄性不育，證實該突變株屬于細胞質(zhì)雄性不育(CMS)類型[4]，此后于2003年選育出高抗紅麻炭疽病的CMS系K03A及其相應的保持系K03B，并實現(xiàn)紅麻三系配套[5]，于2008年選育出世界上第一個由CMS系配制的紅麻雜交種紅優(yōu)1號[6]。已有研究表明，植物CMS與線粒體基因atp6密切相關，紅麻三系雜交種雖已成為國家麻類產(chǎn)業(yè)技術體系的主推品種，但迄今關于紅麻CMS的分子機理仍未闡明。因此，構建紅麻線粒體基因atp6過表達載體遺傳轉(zhuǎn)化體系，對紅麻線粒體基因的遺傳轉(zhuǎn)化及功能研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】最早發(fā)現(xiàn)atp6基因?qū)χ参顲MS具有調(diào)控作用的是在玉米CMS-T的rrn26基因和atp6基因部分序列共轉(zhuǎn)錄時，編碼一個與線粒體內(nèi)膜密切相關的毒性蛋白，導致玉米CMS[7-8]。隨后發(fā)現(xiàn)油菜Pol型CMS系中atp6/orf224共轉(zhuǎn)錄引起油菜CMS-Pol型CMS[9-10]。同時，水稻CMS-BT的orf79基因和CMS-HL的orfH79基因與線粒體atp6基因共轉(zhuǎn)錄，編碼一個N端與COX1相似的毒性膜蛋白，導致水稻CMS-HL型和CMS-BT型CMS[11]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)芥菜atp6/orf228共轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼的毒性蛋白與atp6/orf263基因編碼的膜蛋白分別導致芥菜CMS-Hau型和CMS-Tour型CMS[12-13]，甜菜preSatp6基因編碼產(chǎn)生35 kD膜蛋白引起甜菜CMS-Owen型CMS[14]。李剛[15]采用iTRAQ(同重標簽相對與絕對定量)標記紅麻CMS系L23A和保持系L23B花藥線粒體蛋白，發(fā)現(xiàn)ATP6在不育系中的表達量顯著低于保持系，推測ATP6對紅麻花藥發(fā)育發(fā)揮重要作用。在同質(zhì)異核不育系P3A中，atp6基因的編碼區(qū)(CDS)序列與保持系P3B相比缺失30 bp，基于CDS序列差異特征對紅麻現(xiàn)有的CMS系、保持系、F1和F2代及104份種植資源進行檢測，證實不育系中30 bp的缺失與紅麻細胞質(zhì)雄性不育密切相關[16]。廖小芳[17]用Northern blotling對紅麻質(zhì)核同源的UG93A和UG93B的atp6基因進行轉(zhuǎn)錄本分析，發(fā)現(xiàn)不育系比保持系多一個大小為2.0 kb的轉(zhuǎn)錄本，且atp6基因在不育系中的表達量顯著低于保持系，推測atp6基因可能與紅麻CMS密切相關?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關于紅麻atp6基因過表達載體遺傳轉(zhuǎn)化體系構建的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】以紅麻UG93A花藥cDNA為模板，通過同源克隆技術克隆atp6基因的CDS全長序列；利用In-Fusion基因融合技術構建pBI121-atp6-EGFP植物過表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化野生型煙草，經(jīng)抗性篩選和目的基因PCR驗證轉(zhuǎn)基因煙草，為紅麻線粒體基因的遺傳轉(zhuǎn)化和功能研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017年5月至2018年4月在廣西大學農(nóng)學院綜合樓植物遺傳育種實驗室進行。紅麻不育系UG93A、植物表達載體pBI121及野生型煙草種子為本課題組保存提供；根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞、大腸桿菌感受態(tài)DH5α細胞和高保真酶購自北京全式金生物技術有限公司；紅麻花藥總RNA提取試劑盒購自北京華越洋公司，限制性內(nèi)切酶KPnI、XbaI和M×Buffer購自TaKaRa公司。PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和標準DNA-Marker購自南京諾唯贊生物科技有限公司和北京艾德萊生物科技有限公司，引物合成由深圳華大基因科技有限公司完成，菌液測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物合成 通過Premier 5.0設計atp6、EGFP及pBI121載體上游引物序列，具體序列信息如表1。

1.2.2atp6基因過表達載體構建與轉(zhuǎn)化 (1)過表達基因片段克隆。根據(jù)試劑盒說明提取紅麻UG93A的總RNA(北京華越洋生物科技有限公司)，參照全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將UG93A總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以此為模板，用引物組合eF-atp6-F/eF-atp6-R擴增atp6基因CDS全長序列。

表1 本研究所用引物序列

注：下劃線部分為與pBI121載體同源序列。

Note:The sequences with a line are homologous sequences of PBI121 vector.

PCR反應體系50.0 μl：cDNA 2.5 μl，10×PCR Buffer 25.0 μl，Primer F(eF-atp6F) 1.5 μl，Primer R(eF-atp6R) 1.5 μl，ddH2O補足50.0 μl。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，進行30個循環(huán)；72 ℃復性10 min，4 ℃保存；最后用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用DNA膠回收試劑盒回收目的片段，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)目的載體構建。提取本課題組構建的pBI121-FullHcpdil5-2a-EGFP載體質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶XbaI和KpnI對該載體進行雙酶切。酶切體系50.0 μl：10×Buffer 5.0 μl，XbaI 2.5 μl，KpnI 2.5 μl，質(zhì)粒DNA 1.0 μg，ddH2O補足50.0 μl。切下FullHcpdil5-2a基因后得到線性載體pBI121，用DNA膠回收試劑盒回收切下的線性載體pBI121。將回收到的atp6基因全長片段與上述線性載體pBI121進行同源重組反應，其反應體系為：線性載體(pBI121)4.0 μl，插入片段(atp6基因)0.7 μl，5×CE Multis Buffer 4.0 μl，Exnase Multis 2.0 μl，ddH2O 9.3 μl。用移液槍上下輕微吹打幾次混勻，37 ℃反應30 min，反應結束立即置于冰浴中冷卻5 min直接進行大腸桿菌轉(zhuǎn)化。

(3)目的條帶檢測與測序。在無菌超凈工作臺上，隨機挑取白色菌落8個，置于盛有1 mL LB液體培養(yǎng)基(加入終濃度0.1 mg/mL的Kan)的2 mL離心管中；37 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h；按照目的基因擴增反應體系及程序進行菌液PCR檢測；1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，有目的條帶則為陽性菌落；在超凈工作臺上，將每個陽性克隆菌液分為2份，每份加入150.0 μl 60 %甘油，混勻，其中一份隨機選取4個陽性克隆并編號，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，另一部分菌液-80 ℃保存?zhèn)溆?。利用DNAMAN 8對測序結果進行分析。選擇正確的克隆進行質(zhì)粒提取，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞，為農(nóng)桿菌侵染煙草葉盤法作準備。

(4)過表達載體質(zhì)粒雙酶切驗證。選定上述測序成功的一個菌樣，于超凈工作臺上吸取200.0 μl置于盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基(加入終濃度0.1 mg/mL的Kan)的200 mL錐形瓶中。37 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h；根據(jù)試劑盒說明提取質(zhì)粒，進行雙酶切，置于PCR儀中進行37 ℃酶切反應3 h，最后用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測雙酶切PCR產(chǎn)物，對過表達載體構建進行驗證。

(5)過表達載體轉(zhuǎn)化煙草。選取比較健壯的煙草非轉(zhuǎn)基因無菌苗，摘取葉片，用無菌打孔器分成小塊，轉(zhuǎn)移至煙草葉片預培養(yǎng)基中25 ℃暗培養(yǎng)3 d。將制備好的農(nóng)桿菌工程菌液侵染煙草葉片。將預培養(yǎng)后的煙草葉片轉(zhuǎn)移至200 mL玻璃瓶中，用農(nóng)桿菌工程菌液懸浮侵染10 min；棄菌液，將煙草葉片轉(zhuǎn)移至濾紙上吸干葉片表面水分；最后，將煙草葉片轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基上鋪一層無菌濾紙)，25 ℃ 暗培養(yǎng)3 d。將共培養(yǎng)后的煙草葉片取出轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，用無菌水漂洗(漂洗4～5次，每次15 min)，再用含有500 mg/L頭孢霉素的無菌水漂洗(漂洗3次，每次10 min)；倒去漂洗液，將煙草葉片置于無菌吸水紙上，瀝干煙草葉片表面水分；將煙草葉片接種于芽誘導培養(yǎng)基上，在光照強度2000 lx、光照16 h/黑暗8 h交替的條件下26 ℃培養(yǎng)；每隔12 d，將煙草葉片愈傷組織繼代1次，直至長出不定芽。當轉(zhuǎn)基因煙草不定芽長2～3 cm時，切下不定芽，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中誘導不定芽生根，待轉(zhuǎn)基因幼苗的不定根長5～6 cm時，練苗移栽，進行陽性轉(zhuǎn)基因煙草檢測。

2 結果與分析

2.1 目的基因的克隆結果

從圖1可看出，以紅麻不育系UG93A的cDNA為模板克隆atp6基因的CDS全長，擴增產(chǎn)物大小為1182 bp。從圖2可看出，不育系UG93A的atp6基因CDS序列與保持系UG93B相比，atp6基因的CDS中有24 bp缺失和3 bp插入，而與紅麻同質(zhì)異核的CMS系P3A相比，不育系UG93A在atp6基因起始密碼子的下游第59 bp處缺失6個堿基(GTTTTT)，推測該位點可能是紅麻線粒體基因重組的活躍位點，即atp6基因與紅麻CMS密切相關。

2.2 過表達載體的構建結果

對保存的pBI121-FullHcpdil5-2a-EGFP載體進行雙酶切，切下片段長度為1314 bp的FullHcpdil5-2a基因，回收長度約為14 829 bp的線性載體pBI121(圖3)。將回收的線性pBI121與atp6基因連接獲得重組載體pBI121-atp6-EGFP，將重組載體連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR檢測陽性克隆(圖4)。將陽性菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，提取陽性質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，以過表達載體基因pBI121-atp6-EGFP載體質(zhì)粒作為陽性對照，結果顯示雙酶切切下的目的片段與連接的目的片段(atp6基因)大小一致(圖5)，說明過表達載體構建正確，可用于后續(xù)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。

M：DNA分子質(zhì)量標準(DL 2000)；1：atp6基因 M：DNA marker(DL 2000)；1：atp6 gene圖1 目的基因的PCR擴增電泳結果Fig.1 PCR amplification electrophoresis of the target gene

圖2 紅麻UG93A和UG93B的atp6基因序列比對Fig.2 Similarity matching of atp6 gene sequence between UG93A and UG93B in Kenaf

M：DNA分子質(zhì)量標準(AL 15 000)；1：pBI121-Full Hcpdil5-2a-EGFP載體基因；2：線性載體片段pBI121(13 233 bp)及Hcpdil5-2a基因(1314 bp)M：DNA marker(AL 15 000)；1：Gene of pBI121-Full Hcpdil5-2a-EGFP vector；2：The linearized pBI121 vector fragment(13 233 bp) and gene of Hcpdil5-2a(1314 bp)圖3 pBI121-Full Hcpdil5-2a-EGFP載體的雙酶切鑒定結果Fig.3 Restriction enzyme digestion of pBI121-Full Hcpdil5-2a-EGFP vector

2.3 農(nóng)桿菌介導的侵染葉盤法轉(zhuǎn)化煙草

2.3.1 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草 將過表達載體pBI121-atp6-EGFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，以保存的煙草K346為轉(zhuǎn)基因受體，采用農(nóng)桿菌侵染葉盤法進行轉(zhuǎn)化，以未侵染農(nóng)桿菌的野生型煙草為陰性對照，煙草葉盤的芽誘導和根誘導培養(yǎng)階段如圖6所示。其中，圖6-A為芽誘導時期的野生型煙草葉盤(陰性對照)，出芽較快且芽點較多；圖6-B的葉盤經(jīng)過pBI121-atp6-EGFP農(nóng)桿菌侵染處理，放于含有抗生素的培養(yǎng)基中進行抗性芽篩選培養(yǎng)，出芽慢且芽點明顯變少。說明芽誘導階段轉(zhuǎn)基因煙草抗性芽獲得率較低。圖6-C(陰性對照)和圖6-D為煙草的根誘導培養(yǎng)階段，與野生型對照(圖6-C)相比，轉(zhuǎn)基因植株(圖6-D)生長緩慢，根生長也較慢且較少。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株的鑒定 將篩選所得

M：DNA分子質(zhì)量標準(DL2000)；2～14：正確連接載體基因pBI121-atp6-EGFPM：DNA marker(DL2000)；2-14：Correct connecting vector genes pBI121-atp6-EGFP圖4 pBI121-atp6-EGFP載體的PCR驗證結果Fig.4 PCR varification of pBI121-atp6-EGFP vector

到的抗性植株(pBI121-atp6-EGFP：簡稱B)分別用3對不同的引物組合(ef-atp6-F/EGFP-R、ef-atp6-F/ef-atp6-R和pBI121-Z-F/ef-atp6-R)進行PCR檢測，篩選陽性植株。其中，引物組合ef-atp6-F/EGFP-R是以目的基因atp6的上游序列為正向引物，以表達載體pBI121多克隆位點的EGFP為反向引物，擴增出目的片段約1681 bp；引物組合ef-atp6-F/ef-atp6-R是以atp6基因CDS序列為特異引物，擴增出目的片段約1182 bp；引物組合pBI121-Z-F/ef-atp6-R是以pBI121載體序列為正向引物，以atp6基因下游序列為反向引物，擴增出目的片段約1206 bp。從圖7可看出，以野生型植株和ddH2O為陰性對照、過表達載體質(zhì)粒為陽性對照，用3對不同的引物組合對經(jīng)Kan抗性篩選的4株轉(zhuǎn)基因植株(B1、B2、B3和B4)進行PCR擴增，共獲得2株含pBI121-atp6-EGFP(B)的T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株B1和B2。

3 討 論

3.1 atp6基因與植物CMS的關系

M：DNA分子質(zhì)量標準(AL 15000)；1：載體基因質(zhì)粒pBI121-atp6-EGFP雙酶切片段atp6(1182 bp)；2：對照：載體質(zhì)粒pBI121-atp6-EGFPM：DNA marker(AL 15000)；1：Restriction fragment of atp6(1182 bp) from vector gene plasmid pBI121-atp6-EGFP；2：Control: pBI121-atp6-EGFP vector plasmid圖5 pBI121-atp6-EGFP過表達載體的雙酶切鑒定結果Fig.5 Identified by restriction enzyme digestion of pBI121-atp6-EGFP overexpression vector

A和B為煙草葉盤芽誘導培養(yǎng)，其中A為野生型煙草芽，B為轉(zhuǎn)基因煙草抗性芽；C和D為煙草根誘導培養(yǎng)，其中C為野生型煙草根誘導生長，D為轉(zhuǎn)基因煙草植株根誘導生長Induction culture of leaf disc bud of tobacco with A and B，A was wild type tobacco bud，B was transgenic resistant bud；Root induction culture of tobacco with C and D，C was root induction of wild type tobacco，D was root induction of transgenic plants圖6 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草的誘導培養(yǎng)Fig.6 Induced culture of tobacco by leaf disc method

M1：DNA分子質(zhì)量標準(AL 15000)；1：質(zhì)粒pBI 121-atp6-EGFP(1681 bp)；2：WT；3：H2O；4～7(B1-B4)：煙草鑒定材料，其中4和5(B1和B2)為pBI121-atp6-EGFP轉(zhuǎn)基因材料(1681 bp)；M2：DNA分子質(zhì)量標準(DL2000)；8：質(zhì)粒pBI121-atp6-EGFP(1182 bp)；9：WT；10：H2O；11～14(B1-B4)：煙草鑒定材料，其中11和12(B1和B2)為pBI121-atp6-EGFP轉(zhuǎn)基因材料(1182 bp)；15：質(zhì)粒pBI121-atp6-EGFP(1206 bp)；16：WT；17：H2O；18～21(B1-B4)：煙草鑒定材料，其中18和19(B1和B2)為pBI121-atp6-EGFP轉(zhuǎn)基因材料(1206 bp)M1：DNA marker(AL 15000)；1：pBI 121-atp6-EGFP(1681 bp)；2：WT；3：H2O；4-7(B1-B4)：Identification of transgenic plant，4 and 5(B1 and B2)：transgenic plants of pBI121-atp6-EGFP(1681 bp)；M2：DNA marker(DL2000)；8：pBI121-atp6-EGFP(1182 bp)；9：WT；10：H2O；11-14(B1-B4)：Identification of transgenic plant，11 and 12(B1 and B2)：Transgenic plants of pBI121-atp6-EGFP(1182 bp)；15：pBI121-atp6-EGFP(1206 bp)；16：WT；17：H2O；18-21(B1-B4)：Identification of transgenic plant，18 and 19(B1 and B2)：Transgenic plants of pBI121-atp6-EGFP(1206 bp)圖7 轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株的鑒定結果Fig.7 PCR identification of transgenic positive plants

已有研究表明植物雄性不育與線粒體DNA的變異緊密相關[18-19]?；蛑亟M產(chǎn)生嵌合基因或新的閱讀框，出現(xiàn)新的蛋白基因表達產(chǎn)物或引起正常線粒體基因轉(zhuǎn)錄、RNA編輯和蛋白翻譯異常，造成線粒體能量代謝或ATP復合體蛋白亞基異常，使線粒體發(fā)生功能紊亂，從而產(chǎn)生CMS[20]。atp6是植物線粒體呼吸鏈復合體V的亞基，作為呼吸鏈上重要組成部分，呼吸異常導致能量供應不足，而在小孢子發(fā)育過程中需要大量能量，能量供應不足導致花粉敗育[21]。在玉米[8]、油菜[9]、水稻[11]、芥菜[12]和苧麻[22]等植物中均發(fā)現(xiàn)atp6基因?qū)е轮参顲MS。前期對紅麻花粉發(fā)育過程的研究表明，atp6在紅麻花粉發(fā)育過程中發(fā)揮非常關鍵的作用[15]，暗示atp6CMS與紅麻CMS密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)，與紅麻保持系UG93B序列比對，UG93A 的atp6基因CDS有24 bp缺失和3 bp插入，與紅麻的CMS P3A相比，UG93A在atp6基因起始密碼子的下游第59 bp處少6個堿基(GTTTTT)，推測該位點可能是紅麻線粒體基因重組的活躍位點，進一步表明atp6基因與紅麻CMS密切相關。關于atp6基因與紅麻CMS的更深層次關系本課題組正在探究。

3.2 過表達載體的構建為紅麻基因功能研究打下基礎

目前，紅麻CMS的分子機理研究雖取得較大進展，但關于紅麻CMS核質(zhì)作用的分子機制仍未清楚，對紅麻CMS相關atp6基因的研究不夠透徹[23]。為了進一步驗證和分析紅麻UG93S的CMS相關基因atp6功能，本研究以紅麻不育材料UG93A的cDNA為模板利用同源克隆技術克隆atp6基因序列，通過In-Fusion融合技術研究方法成功構建pBI121-atp6-EGFP植物過表達載體，并以農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草，獲得2株轉(zhuǎn)基因陽性煙草植株；利用3對引物組合對轉(zhuǎn)基因陽性植株進行鑒定，其中兩對引物是利用pBI121表達載體序列與目的基因序列組合的方式進行鑒定，可有效避免單一使用目的基因鑒定轉(zhuǎn)基因植株易造成的假陽性現(xiàn)象，且操作省時簡便。構建過表達載體是研究紅麻atp6基因的關鍵步驟[24]，轉(zhuǎn)基因煙草的成功獲得為后續(xù)從分子蛋白表達、細胞定位及生物學形態(tài)等層面開展atp6基因與紅麻CMS功能驗證研究提供材料基礎[25-26]。

4 結 論

從紅麻不育系UG93A中獲得atp6基因CDS全長1182 bp，并以UG93A中atp6基因cDNA為模板成功構建pBI 121-atp6-EGFP過表達載體，轉(zhuǎn)化野生型煙草后獲得2株轉(zhuǎn)基因陽性煙草植株。構建的紅麻線粒體基因atp6過表達載體遺傳轉(zhuǎn)化體系，可用于指導后續(xù)atp6基因調(diào)控紅麻CMS分子機理研究。