毛細(xì)支氣管炎患兒外周血Treg細(xì)胞及Th1/Th2細(xì)胞因子檢測(cè)及臨床意義

唐艷麗 李萬(wàn)樂(lè) 熊升華 等

[摘要] 目的 探討毛細(xì)支氣管炎患兒外周血CD4+CD25+ Treg細(xì)胞及腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-4、8、10水平變化及臨床意義。 方法 選取2016年6月～2017年6月于本院兒科治療的毛細(xì)支氣管炎患兒80例，初次發(fā)作喘息患兒為輕癥組（A組），合并呼吸衰竭或心力衰竭患兒為重癥組（B組），另選取同時(shí)期健康體檢者40例為正常對(duì)照組（C組），應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定外周血CD4+CD25+ Treg細(xì)胞比例，ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-8、IL-4和IL-10表達(dá)水平，比較各組不同指標(biāo)間的差異。 結(jié)果 治療前，毛細(xì)支氣管炎患兒CD4+CD25+ Treg細(xì)胞比例明顯低于正常對(duì)照組（P<0.05）;血清TNF-α、IL-8水平明顯高于對(duì)照組（P<0.05），血清IL-4、IL-10水平明顯低于對(duì)照組（P<0.05）;治療1周后，Treg細(xì)胞呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，A組Treg細(xì)胞比例明顯高于B組（P<0.05）;血清TNF-α、IL-8水平較前明顯下降，IL-4、IL-10水平較前明顯上升（P<0.05）。 結(jié)論 毛細(xì)支氣管炎患兒病情嚴(yán)重程度與Th1/Th2平衡的紊亂程度具有相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] 毛細(xì)支氣管炎;嬰幼兒;調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;細(xì)胞因子

[中圖分類號(hào)] R725.6? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）05-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the changes of peripheral blood CD4+CD25+ Treg cells and tumor necrosis α （TNF-α）， interleukin（IL）-4， 8， 10 in children with bronchiolitis and their clinical significance. Methods A total of 80 children with bronchiolitis who treated in the Department of Pediatrics in our hospital from June 2016 to June 2017 were enrolled. The children with initial onset of wheezing were set as mild group（group A）. The patients combined with respiratory failure or heart failure were set as the severe group（group B）. Another 40 healthy controls were selected as the normal control group （group C） in the same period. The percentage of CD4+CD25+ Treg cells in peripheral blood was determined by flow cytometry. The expressions of serum TNF-α， IL-8， IL-4 and IL-10 were detected by ELISA. Different indicators of each group were compared. Results Before treatment， the proportion of CD4+CD25+ Treg cells in children with bronchiolitis was significantly lower than that in the normal control group（P<0.05）. The levels of serum TNF-α and IL-8 in children with bronchiolitis were significantly higher than those in the control group（P<0.05）. The levels of IL-4 and IL-10 in children with bronchiolitis were significantly lower than those of the control group（P<0.05）. After 1 week of treatment， Treg cells showed an increasing trend. The proportion of Treg cells in group A was significantly higher than that in group B（P<0.05）. The levels of serum TNF-α and IL-8 were significantly lower than those before， and the levels of IL-4 and IL-10 were significantly higher than those before（P<0.05）. Conclusion The severity of children with bronchiolitis is correlated with the disorder degree of Th1/Th2 balance.

[Key words] Bronchiolitis; Infants; Regulatory T cells; Cytokines

毛細(xì)支氣管炎（bronchiolitis）是嬰幼兒期常見(jiàn)的呼吸道疾病，好發(fā)于2歲以內(nèi)，如不及時(shí)干預(yù)，遠(yuǎn)期預(yù)后不佳，部分患兒可發(fā)展為哮喘[1]。越來(lái)越多的研究顯示，毛細(xì)支氣管炎是感染性和變態(tài)反應(yīng)性炎癥交雜的臨床綜合征。Th1/Th2細(xì)胞比例在毛細(xì)支氣管炎患者存在失衡，促炎性細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-8）表達(dá)增加，抑炎性細(xì)胞因子（如IL-4、IL-10）表達(dá)下降。已有研究證實(shí)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+ regulatory T cell，CD4+CD25+ Treg cell）參與了毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病機(jī)制，因其具有免疫抑制功能，其數(shù)量低下和功能紊亂可導(dǎo)致免疫抑制功能的異常。毛細(xì)支氣管炎反復(fù)發(fā)作，易出現(xiàn)氣道重塑，部分可發(fā)展為哮喘，降低患兒生活質(zhì)量，目前尚缺乏明確有效的對(duì)因治療措施。與以往研究證實(shí)哮喘與毛細(xì)支氣管炎之間存在相似的免疫功能紊亂相符。因此，對(duì)其進(jìn)行深入研究具有重要臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料

所有入組患兒監(jiān)護(hù)人均知情同意，隨機(jī)選取2016年6月～2017年6月于本院兒科住院病房確診的毛細(xì)支氣管炎初次發(fā)作喘息的患兒為研究對(duì)象（A組），患兒年齡≥28 d，≤24月，排除支氣管異物、心源性哮喘、先天性喉喘鳴、嗜酸粒細(xì)胞性肺炎、胃食管反流等疾病引起的喘息。各組研究對(duì)象診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合《實(shí)用兒科學(xué)》第7版。毛細(xì)支氣管炎合并呼吸衰竭或心力衰竭患兒為重癥患兒（B組），另隨機(jī)選取40例同期同年齡組健康體檢嬰幼兒作為正常對(duì)照組（C組）。對(duì)照組嬰幼兒均在2個(gè)月內(nèi)未患感染性疾病，既往無(wú)反復(fù)呼吸道感染病史，無(wú)過(guò)敏史，無(wú)先天性心臟病、寄生蟲，無(wú)腫瘤、自身免疫性疾病，未使用激素和免疫抑制劑。三組嬰幼兒年齡、性別及體重比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

1.2 方法

分別采集A、B組患兒入院后第1天（發(fā)作期采血，且采血前未使用激素）及治療后7 d的靜脈血，C組患兒體檢時(shí)抗凝靜脈血6 mL，3 mL靜脈血以3000 r/min離心10 min，提取上清液，置于-20℃保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫雙抗體夾心（ELISA）法測(cè)定各組兒童血清中TNF-α、IL-8、IL-4、IL-10的水平;儀器為美國(guó)伯樂(lè)680酶聯(lián)儀，試劑盒均由廣州威佳科技有限公司提供，嚴(yán)格遵照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行相關(guān)操作，按照繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出TNF-α、IL-8、IL-4、IL-10值。

另3 mL靜脈血在室溫24 h內(nèi)用于細(xì)胞分離，應(yīng)用Ficoll梯度離心法分離外周血單核淋巴細(xì)胞，然后用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成5×106/mL細(xì)胞懸液備用;按照熒光抗體試劑盒說(shuō)明書，使用美國(guó)B-D公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀測(cè)定Treg細(xì)胞水平。

1.3觀察指標(biāo)

毛細(xì)支氣管炎患兒常規(guī)予以激素、霧化平喘、補(bǔ)液等對(duì)癥治療，連用1周。觀察并比較治療前和治療1周后外周血CD4+CD25+ Treg細(xì)胞水平及血清TNF-α、IL-8、IL-4、IL-10水平變化。而健康對(duì)照組嬰幼兒僅在入組時(shí)測(cè)定1次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、匯總并應(yīng)用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FCM檢測(cè)CD4+CD25+ Treg細(xì)胞結(jié)果

采集治療前后各組嬰幼兒外周血，按照流式細(xì)胞術(shù)操作流程，依次檢測(cè)各組外周血CD4+CD25+ Treg細(xì)胞水平（CD4+CD25+ Treg/CD4+ T%），見(jiàn)表2。A組為（3.29±0.41）%，B組為（2.14±0.12）%，C組為（3.52±0.31）%，B組明顯低于C組，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），B組低于A組，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。治療7 d后，A組為外周血CD4+CD25+ Treg細(xì)胞水平為（3.31±0.38）%，B組為（2.96±0.65）%，C組為（3.52±0.31）%，B組明顯低于A組，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），A組與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 各組外周血Th1/Th2細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 ELISA法檢測(cè)各組嬰幼兒TNF-α、IL-4的結(jié)果? 在治療前后，對(duì)各組嬰幼兒血清TNF-α、IL-4水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。治療前，B組TNF-α水平明顯高于C組及A組;B組IL-4水平明顯低于C組及A組;治療1周后，A組TNF-α水平明顯低于B組;A組IL-4水平高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2.2 各組嬰幼兒外周血IL-8、IL-10細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果? 在治療前后，對(duì)各組嬰幼兒血清IL-8、IL-10進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。治療前，B組IL-8水平明顯高于C組及A組;B組IL-10水平明顯低于C組及A組;在治療1周后，A組IL-8水平明顯低于B組;A組IL-10水平高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

毛細(xì)支氣管炎多見(jiàn)于2歲以下嬰幼兒，是一種急性感染性疾病;感染累及直徑75～300 μm的細(xì)支氣管，急性炎癥、黏膜水腫、上皮細(xì)胞壞死、黏液分泌增多致細(xì)支氣管狹窄與阻塞是該病的病理基礎(chǔ)。既往研究證實(shí)，25%～50%毛細(xì)支氣管炎患兒病愈后可出現(xiàn)癥狀復(fù)發(fā)，多表現(xiàn)反復(fù)喘息發(fā)作，其中30%最終可發(fā)展為哮喘，其具體發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，其中免疫失衡可能在發(fā)病過(guò)程中扮演重要角色[2-4]。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在維持機(jī)體免疫平衡方面起著重要作用，具有免疫負(fù)向調(diào)節(jié)功能，能夠抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的分化、增殖及其活性，其數(shù)量低下和功能紊亂可導(dǎo)致多種自身免疫性疾病的發(fā)生[5-7]。Zhu YF等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在患者的肺泡灌洗液中，因CD4+CD25+調(diào)節(jié)性Treg細(xì)胞比值偏低，出現(xiàn)機(jī)體免疫抑制功能異常，從而導(dǎo)致了毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn)，治療前，B組患兒外周血Treg細(xì)胞水平較正常對(duì)照組明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異（P<0.05），A組與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示毛細(xì)支氣管炎患兒外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平紊亂，其數(shù)量越低，表明病情越嚴(yán)重，可能預(yù)后不佳。治療后，Treg細(xì)胞水平明顯上升，與A組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），提示毛細(xì)支氣管炎患兒治療后，Treg細(xì)胞水平可一定程度恢復(fù)，與臨床癥狀緩解有直接關(guān)系。

既往研究[9]證實(shí)，毛細(xì)支氣管的發(fā)病與病毒感染密切相關(guān)，機(jī)體出現(xiàn)Th1/Th2免疫失衡，這種動(dòng)態(tài)平衡一旦被打破，釋放大量炎性細(xì)胞因子，介導(dǎo)機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)，參與毛細(xì)支氣管炎的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。Mosmann TR等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Th1細(xì)胞主要分泌促炎性細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-8;Th2細(xì)胞則主要分泌抑炎性細(xì)胞因子，如IL-4、IL-10，細(xì)胞因子本身是Th1/Th2分化的最有力的調(diào)節(jié)因素。近年來(lái)毛細(xì)支氣管炎嬰兒與動(dòng)物模型的研究表明，喘息反復(fù)發(fā)作與炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)。病毒感染時(shí)導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-8）表達(dá)增加。TNF-α及IL-8作為炎癥介質(zhì)參與毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病過(guò)程[11]。TNF-α是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生的具有腫瘤殺傷作用的細(xì)胞因子，并且對(duì)機(jī)體炎癥和免疫應(yīng)答有調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究也證實(shí)[12-14]，呼吸道合胞病毒毛細(xì)支氣管炎患兒外周血檢測(cè)中不僅存在Th1/Th2和IFN-γ/IL-4的調(diào)節(jié)失衡，也存在TGF-β/IL-17和IL-10/IL-17失衡。

已有研究證實(shí)[15-16]，IL-4在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著非常關(guān)鍵的作用，不僅可促進(jìn)B細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生IgE，還可以通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮因子的表達(dá)，使炎性細(xì)胞在炎癥局部浸潤(rùn)增加。另有報(bào)道GSI可通過(guò)調(diào)節(jié)Notch相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)IL-4含量發(fā)生變化，引起哮喘患兒體內(nèi)Th2優(yōu)勢(shì)向Th1應(yīng)答轉(zhuǎn)變，從而減輕哮喘氣道炎癥[17]。IL-10是Th2細(xì)胞因子中重要的下調(diào)因子，對(duì)氣道炎癥具有抑制作用，可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。IL-10有減輕呼吸道炎癥的作用，這可能對(duì)哮喘和毛細(xì)支氣管炎的治療有潛在應(yīng)用價(jià)值。另有研究證實(shí)，IL-10水平上升也可以促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與C組比較，B組患兒急性期血清TNF-α、IL-8水平明顯增高，IL-4、IL-10水平明顯下降，A組細(xì)胞因子含量改變不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示毛細(xì)支氣管炎急性期Th2類細(xì)胞因子受抑制，Th1細(xì)胞功能亢進(jìn)，存在Th1/Th2功能失調(diào)，其程度與病情嚴(yán)重有直接關(guān)系。經(jīng)治療后，B組毛細(xì)支氣管炎患兒血清TNF-α、IL-8水平較前下降，與A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;IL-4、IL-10水平有所恢復(fù)，但仍低于C組。本研究結(jié)果也證實(shí)毛細(xì)支氣管炎病情嚴(yán)重程度與Th1/Th2平衡的紊亂程度呈正相關(guān)性。

綜上所述，毛細(xì)支氣管炎患兒的免疫功能可能受到損害，其損害程度與病情密切相關(guān)。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，這提示臨床治療方面，可適當(dāng)應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑，可能對(duì)提高療效、縮短病程及遠(yuǎn)期預(yù)后有重要意義。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、TNF-α、IL-8、IL-4和IL-10水平異常與毛細(xì)支氣管炎患兒疾病進(jìn)展相關(guān)，也可作為毛細(xì)支氣管炎治療療效評(píng)估的指標(biāo);后續(xù)研究可針對(duì)毛細(xì)支氣管患兒遠(yuǎn)期預(yù)后展開(kāi)[18]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 羅征秀，徐秀娟. 毛細(xì)支氣管炎診治進(jìn)展[J]. 中華實(shí)用兒科臨床雜志，2017，32（2）：253-255.

[2] 李賓，吳福玲，馮學(xué)斌. 呼吸道合胞病毒毛細(xì)支氣管炎患兒外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與Th17細(xì)胞功能變化及意義[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2012，28（4）：426-428.

[3] Thwaaites RS，Ito K，Chingono JM，et al. Nasosorption as a minimally invasive sampling procedure：Mucosal viral load and inflammation in primary RSV bronchiolitis[J]. J Infect Dis，2017，215（8）：1240-1244.

[4] Shin YH，Kim GR，Lee KS，et al. Clinical predictors of chest radiographic abnormalities in yong children hospitalized with bronchiolitis：a single center study[J]. Korean J Pediatr，2016，59（12）：471-476.

[5] Piltas G，Rudensky AY. Regulatory T Cells：Differentiation and Function[J]. Cancer Immunol Res，2016，4（9）：721-725.

[6] Stelmaszczyk-Emmel A. Regulatory T Cells in children with allergy and asthma：it is time to act[J]. Respir Physiol Neurobiol，2015，209（4）：59-63.

[7] Bin Dhuban K，Kormete M，S Mason E，et al. Functional dynamics of Foxp3（+）regulatory T cells in mice and humans[J]. Immunol Rev，2014，259（1）：140-158.

[8] Zhu YF，Cai XH，Zhu JY，et al. Study of CD4+CD25+ Regulatory T cells and expression of Foxp3 mRNA in bronchiolitis and glucocorticoid regulation[J]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2009，89（22）：1563-1566.

[9] 孫平平，馬少春. Th1/Th2失衡及毛細(xì)支氣管炎特異性免疫治療的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際免疫學(xué)雜志，2017，40（1）：113-116.

[10] Mosmann TR，Cherwinski H，Bond MW，et al. Two types of murine helper T cell clone.I.Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins[J]. J Immunol，1986，136（7）：2348-2357.

[11] Kapadia SB，Gentile D，Howe-Adams J，et al. Relationship between local TNF protein levels and severity of illness during respiratory syncytial virus infection in hospitalized infants[J]. J Allergy Clin Immun，2002，109（Suppl）：341.

[12] 李超乾，徐永健，鐘小寧，等. 不同Th1/Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞學(xué)的變化[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2002，18（6）：575-577，585.

[13] 武平，韓瑞敏. 甲基強(qiáng)的松龍對(duì)呼吸道合胞病毒毛細(xì)支氣管炎患兒血清Th17/Treg平衡及其細(xì)胞因子的影響[J]. 濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，38（6）：426-429.

[14] 孟珊珊，于金燕，閆冰迪. 過(guò)敏性哮喘患者調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞對(duì) Th17 細(xì)胞和Th19 細(xì)胞的影響[J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志，2015，31（1）：93-97.

[15] Mukherjee S，Rutter K，Watson L，et al. Adverse effects of bronchodilators in infants with brochiolitis[J]. The journal of pediatric pharmacology and therapeutics：JPPT：the Official Journal of PPAG，2015，20（1）：70-71.

[16] McCallum GB，Morris PS，Grimwood K，et al. Three-weekly doses of azithromycin for indigenous infants hospitalized with brochiolitis：A multicentre randomized，placebo-controlled trial[J]. Frontiers in Pediatrics，2015，3（4）：32.

[17] Hassan MA，Eldin AM，Ahmed MM. T-helper2/T-helper1 imbalance in respiratory syncytial virus bronchiolitis in relation to disease severity and outcome[J]. Egypt Immunol，2008，15（2）：153-160.

[18] 徐恩會(huì)，耿剛. 淺析毛細(xì)支氣管炎發(fā)展為哮喘的危險(xiǎn)因素[J].兒科藥學(xué)雜志，2018，24（9）：62-64.

（收稿日期：2018-10-30）