新型二維高效液相色譜測定人血清伏立康唑濃度方法的建立與應用*

王新茗，張仲林，袁明勇

1.成都醫(yī)學院 藥學院(成都 610500)；2.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 藥學部(成都 610500)

伏立康唑是三唑類的抗真菌藥物，是氟康唑衍生物，具有抗菌譜廣，抗菌效力強等特點，是治療侵襲性念珠菌、曲霉菌的主要藥物[1-2]。但伏立康唑受遺傳代謝影響，個體間藥動學參數(shù)差異較大，利福平、卡馬西平、西咪替丁、他克莫司等許多藥物會影響伏立康唑血藥濃度[3]，可能發(fā)生藥物不良反應，且伏立康唑具有非線性藥代動力學特征[4]，因此對伏立康唑進行治療藥物監(jiān)測(therapeutic drug monitoring，TDM)十分重要[5]。目前伏立康唑血藥濃度檢測方法多為高效液相色譜法和質譜法[6-7]，質譜法具有極佳的檢測靈敏度，但成本高，難以推廣。傳統(tǒng)高效液相色譜法具有一定經(jīng)濟性，但存在前處理復雜，色譜柱易被血清內(nèi)源性物質損壞等問題。二維高效液相色譜通過技術及設備的改進，簡化樣品前處理過程，更為有效地解決復雜體系樣品的分析問題，適用于高通量檢測，被廣泛應用于復雜樣品及血藥濃度分析[8]。本研究旨在建立快速、簡便、準確的新型全自動二維高效液相色譜測定伏立康唑血藥濃度的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

二維高效液相色譜(2D-HPLC)由FLC-2420全自動二維液相色譜耦合儀(湖南德米特儀器有限公司)和LC-20AT色譜模塊(日本島津)構成；SPD-10A檢測器(日本島津)；TDZ4-WS 臺式低速離心機(湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司)；XW-80A旋渦混合器(上海馳唐電子有限公司)；Mini-15K微型高速離心機(杭州奧盛儀器有限公司)；PWC124電子分析天平(英國艾德姆公司)。

1.2 藥品與試劑

伏立康唑對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：J27M6F1，供含量測定用，含量98%)；醋酸銨、三乙胺、三氟乙酸、高氯酸、磷酸銨均為分析純；乙腈、甲醇均為色譜純；空白馬血清(Gibco)、空白血清和患者血清由成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院臨床科室提供。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 第一維色譜系統(tǒng)(LC1)為島津LC-20AT，第二維色譜系統(tǒng)(LC2)的色譜泵為島津LC-20AT四元低壓色譜泵。第一維色譜柱(LC1 column)為ASTON SC2柱(4.6 mm×25 mm,5 μm)；流動相為V20 mmol/L磷酸銨∶V乙腈∶V甲醇=3∶1∶1，磷酸調(diào)pH=5.4)，流速∶1.2 mL/min。第二維色譜柱(LC2 column)為SHIMADZU C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為10 mmol/L醋酸銨(三乙胺調(diào)pH7.0)∶10mmol/L醋酸銨(三氟乙酸調(diào)pH3.0)∶甲醇∶乙腈=30∶10∶10∶50(V∶V∶V∶V)，流速為1.0 mL/min，中間柱(Middle column)為ASTON SH柱(3 mm×10 mm，5 μm)，輔助流動相為純水。檢測波長256 nm，運行時間9 min，溫度：40 ℃，進樣量：200 μL。檢測流程：色譜耦合儀通過設置的時間程序，自動將色譜狀態(tài)分為富集凈化、捕獲、轉移和分析。富集凈化：一維色譜柱對進樣樣品進行萃取和富集；捕獲：目標物即將通過一維色譜柱時，中間柱開始截取與目標物有關的部分(中心切割技術)；轉移：中間柱將目標物轉移至二維色譜柱；分析：二維色譜柱繼續(xù)對樣品分析，中間柱和萃取柱在LC1在線清洗(圖1)。

圖1 FLC-2420分析過程及程序設置

1.3.2 對照品溶液的配制 精密稱取伏立康唑對照品14.1 mg，用25%甲醇定容至10 mL，制得1.41 mg/mL對照品母液，取上述母液2 mL用25%甲醇再次稀釋至10 mL得對照品溶液(282 μg/mL)，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 血清樣品預處理 血液樣品3 000 r/min離心5 min，離心半徑12.3 cm，精密量取待測血清樣品300 μL至1.5 mL的EP管，加入10%高氯酸900 μL，渦旋振蕩30 s后，14 500 r/min，離心8 min，離心半徑6 cm，取上清液1 000 μL至進樣瓶，加入5.0 mol/L磷酸銨100 μL調(diào)節(jié)pH，渦旋振蕩15 s，進樣200 μL，以外標法定量分析。

2 結果

2.1 專屬性考察

取空白馬血清、對照品加空白馬血清、空白人血清、患者血清，按“1.3.3”項下方法前處理后，按“1.3.1”項色譜條件進行分析，空白馬血清、空白人血清在目標峰處無干擾，伏立康唑與雜質分離較好，保留時間為8.1 min。空白血清色譜圖中此處未發(fā)現(xiàn)干擾，血清內(nèi)源性物質及其他雜質已完全分離不影響樣品的含量測定(圖2)。

圖2 伏立康唑高效液相色譜圖 注：A：空白馬血清；B：對照品+空白馬血清；C：空白人血清；D：患者血清

2.2 基質效應

取空白人血清和空白馬血清按“1.3.3”項下方法預處理后，加入適量母液配置成對應濃度樣本(0.28、0.70、2.82、16.92 μg/mL)，按“1.3.1”項下方法測得的峰面積與同濃度標準品的峰面積相比，計算基質效應，馬血清與人血清基質效應符合要求，兩者無明顯差異(表1)。

表1 基質效應考察結果

2.3 線性

用空白馬血清將伏立康唑對照溶液稀釋成系列濃度溶液(0.28、0.70、1.41、2.82、5.64、11.28、22.56 μg/mL)，構成標準曲線的7個點，按“1.3.3”項下方法處理，“1.3.1”項下色譜條件分析，以伏立康唑的峰面積比值(Y)對伏立康唑濃度(X)進行線性回歸，結果伏立康唑在0.28～22.56 μg/mL與峰面積呈良好的線性關系，其回歸方程為Y=104 251X+8 279.72(r=0.999 9)。最低定量限為0.28 μg/mL(S/N>10，RSD<10%)，檢測限為0.04 μg/mL(S/N=3)完全滿足臨床伏立康唑血藥濃度檢測要求。

2.4 回收率與精密度

用空白馬血清將伏立康唑對照品溶液稀釋成高、中、低及定量下限(16.92、2.82、0.70、0.28 μg/mL)4個濃度的質控溶液，按“1.3.3”項方法處理樣品，“1.3.1”項下色譜條件進樣，每個濃度每日平行測定5份樣品，連續(xù)測定3日，將測得的伏立康唑峰面積代入標準曲線方程，計算伏立康唑的精密度和方法回收率；將預處理后質控樣品測得峰面積與同濃度標準品的峰面積相比，得提取回收率。本方法的日內(nèi)、日間RSD均<9%，方法回收率99.01%～104.62%(RSD<9%)，提取回收率>85%(RSD<8%)，符合生物樣品分析要求(表2)。

表2 血清中伏立康唑精密度(RSD)、方法回收率

2.5 轉移穩(wěn)定性試驗

二維高效液相色譜將目標物從LC1轉移至LC2的準確性和穩(wěn)定性由轉移回收率和轉移精密度來表示，將282 μg/mL對照品母液在“1.3.1”項下的色譜條件進行檢測，進樣體積5 μL，得到的峰面積與在LC2模式下單獨通過分析柱所得的峰面積進行比較，設置6組平行，計算轉移回收率為98.31%，RSD為1.25%。表明二維高效液相色譜轉移回收率高且穩(wěn)定。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取高、中、低及定量下限4個濃度的伏立康唑質控溶液各5份，在室溫放置24 h，冷凍10 d及反復凍融3次取出復溫，按“1.3.3”項操作處理后，按“1.3.1”項色譜條件測定，伏立康唑RSD均<9%，表明室溫放置24 h、冷凍10 d及反復凍融3次對伏立康唑測定結果無影響，滿足臨床血藥濃度監(jiān)測。取“2.2”項高、中、低及定量下限4個濃度的伏立康唑質控溶液各5份，按“2.3”項操作處理后，室溫放置24 h，RSD均<9%表明樣品經(jīng)處理后室溫放置24 h對檢測無影響(表3)。

表3 穩(wěn)定性試驗

2.7 臨床應用

案例1：患者劉某，男性，53歲，痰培養(yǎng)出白假絲酵母菌，使用伏立康唑膠囊(四川美大康華藥業(yè)有限公司)，首日400 mg po q12 h，序貫200 mg po q12 h，3 d后送檢伏立康唑血藥谷濃度，檢測值為0.415 μg/mL，低于治療濃度(1 μg/mL)，請臨床藥師會診，是否增加伏立康唑的劑量？臨床藥師會診時發(fā)現(xiàn)患者有肺結核，正在使用利福噴丁，考慮伏立康唑血藥濃度過低的原因可能是利福噴丁與伏立康唑的相互作用所導致，建議停用伏立康唑，更換成棘白菌素類的抗真菌藥物。臨床予以采納，患者后續(xù)感染控制，好轉出院。

案例2：患者楊某，女性，89歲，痰培養(yǎng)出克柔假絲酵母菌，使用伏立康唑(輝瑞)，首日負荷劑量330 mg ivgtt q12 h，序貫200 mg ivgtt q12 h，用藥第10 d出現(xiàn)精神、食欲、睡眠差，予以完善相關檢查和對癥處理后癥狀仍持續(xù)，請多學科會診，臨床藥師會診時發(fā)現(xiàn)患者合并使用奧美拉唑，奧美拉唑對CYP2C19具有抑制作用，可能升高伏立康唑血藥濃度，導致神經(jīng)系統(tǒng)不良反應，建議檢測伏立康唑血藥濃度。經(jīng)檢測該患者的伏立康唑血藥谷濃度為17.78 μg/mL，遠超過治療參考谷濃度上限(5.0 μg/mL)，建議暫停使用伏立康唑。患者停藥后精神癥狀逐漸好轉，未再進行抗真菌治療，原發(fā)疾病治療好轉后出院。

該方法具有檢測快速，操作簡便，結果準確的特點，確定的線性范圍能滿足伏立康唑血藥濃度監(jiān)測需要，可以作為臨床分析人血清中伏立康唑血藥濃度的方法。

3 討論

TDM起源于上個世紀八十年代，是臨床藥學一個重要分支學科[9]。TDM對提高藥物治療效果和預防不良反應的發(fā)生具有重要意義，是目前新形勢下提升藥學服務能力和開展個體化藥物治療的一項重要舉措。

目前檢測伏立康唑血藥濃度的方法多為高效液相色譜法及質譜法[10-11]，兩種方法對樣品純凈度要求高，而血液樣本成分復雜，通常需要經(jīng)過復雜的前處理才能進行檢測，增加操作負擔和誤差。傳統(tǒng)高效液相色譜法使用紫外檢測器，檢測靈敏度有時不能滿足需要，需對樣品進行氮吹、復溶等操作對樣品進行富集[12]，增加操作步驟及誤差，也降低了報告的及時性；質譜法檢測靈敏度能滿足臨床檢測需求，但質譜儀價格昂貴，檢測成本高，不適用于臨床應用。

本研究建立的新型二維高效液相色譜測定伏立康唑血藥濃度方法，利用全自動二維色譜高效的自動化在線樣品處理能力，樣品無需復雜的前處理，沉淀蛋白后直接進樣，富集和凈化均由二維色譜自動化完成，9 min即可完成萃取、轉移及分析，能為臨床快速出具檢測結果。

傳統(tǒng)高效液相色譜法多采用內(nèi)標法進行定量，以消除樣品前處理的誤差。本方法由于樣品進入分析柱前已凈化，雜質干擾小，高度自動化也使人工操作誤差降低，使用外標法就能進行精準定量，避免添加內(nèi)標物的繁瑣操作，也使臨床批量樣本檢測時的可操作性更強。

二維高效液相色譜的一維流路和二維流路分別負責樣品的萃取和分析，輔助流動相(水)受時間程序控制，在萃取和轉移初期增加一維流路的極性，可將待測物富集于色譜中避免流失。故增加進樣量不會影響峰型，且靈敏度會提高，使用紫外檢測器就能滿足檢測需要，檢測成本較質譜法和免疫法低，利于臨床開展使用；樣品進入分析階段后，中間柱與萃取柱立即啟動清洗程序，完成樣品的檢測后，色譜柱已清洗完成，可立即檢測下一樣品，保證本系統(tǒng)連續(xù)分析時的可靠性，縮短等待時間。

綜上所述，該方法檢測成本低、自動化程度高、檢測快速、靈敏度及準確性好，可以滿足臨床報告及時性、準確性和測定范圍等要求，可以作為伏立康唑TDM的有效方法。