阿托伐醌通過(guò)ROS介導(dǎo)的自噬抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的研究

蘭景彬，楊 鈴，潘克儉

1.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院(成都610500)

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)高發(fā)的惡性消化道腫瘤之一，盡管結(jié)直腸癌的診斷和治療都已取得了一些進(jìn)展，但其發(fā)病和病死率仍逐年上升，是全球癌癥致死的主要原因之一[1]。迄今為止，結(jié)直腸癌的主要治療方法是手術(shù)切除與放化療結(jié)合，但由于結(jié)直腸癌的易復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，常導(dǎo)致治療失敗，因此尋找高效的抗癌藥物成為迫切需解決的臨床問(wèn)題[2]。目前，傳統(tǒng)的抗癌藥物選擇性低、毒性大，而新藥開(kāi)發(fā)成本高、周期長(zhǎng)且成功率低，所以近年來(lái)“舊藥新用”給結(jié)直腸癌治療提供了新的思路。阿托伐醌是一種萘醌類(lèi)化合物，具有廣譜的抗原蟲(chóng)活性，長(zhǎng)期以來(lái)主要用于治療卡氏肺囊蟲(chóng)肺炎和瘧疾等疾病[3-4]。目前，研究發(fā)現(xiàn)阿托伐醌在甲狀腺癌[5]、前列腺癌[6]等惡性腫瘤中具有很好的抗腫瘤效應(yīng)，但其在結(jié)直腸癌的治療研究中尚未見(jiàn)報(bào)道。此外，細(xì)胞自噬屬于Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，其相關(guān)機(jī)制研究已成為腫瘤治療的一個(gè)研究新熱點(diǎn)。因此，本研究擬采用人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞和HCT116細(xì)胞為研究對(duì)象，探究阿托伐醌對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的抑制作用及作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、HCT116(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所)；噻唑藍(lán)(MTT)和3-甲基腺嘌呤(3-MA)(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)；阿托伐醌(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、乙酰半胱氨酸(NAC)和羥基氯喹(CQ)[購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司]；活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)；胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(購(gòu)自以色列BI公司)；蛋白質(zhì)預(yù)染Marker(購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司)；Atg5siRNA(購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3、β-actin、LC3、p62、Beclin-1單克隆抗體(購(gòu)自Cell Signaling Technology公司)；鼠二抗、兔二抗均購(gòu)自成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PVDF膜、ECL顯影液(購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SW480、HCT116細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)于37 ℃，5%CO2下培養(yǎng)，隔天換液，用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2 細(xì)胞活力 實(shí)驗(yàn)將SW480、HCT116細(xì)胞分別接種于96孔板(密度為3×103個(gè)/孔)，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組給予DMEM培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度(0.12、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L)阿托伐醌的DMEM培養(yǎng)基，放入37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，另設(shè)置不含細(xì)胞僅有培養(yǎng)基的空白對(duì)照孔。藥物處理完畢后，避光下每孔加入5 mg/mL的MTT試劑20 μL，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)4 h，而后棄去液體，每孔加入150 μL的DMSO振蕩溶解，以空白對(duì)照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.2.3 細(xì)胞克隆 形成實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞接種于無(wú)菌6孔板中，接種密度為100個(gè)細(xì)胞/孔，鋪勻后于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁后，加入2 mL含不同濃度(0、4、8 μmol/L)阿托伐醌的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d更換一次培養(yǎng)基，2周后終止培養(yǎng)，棄六孔板中培養(yǎng)液，用PBS小心清洗3次，加入1 mL的4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，然后棄去多聚甲醛，并用PBS清洗3次，加入1 mL的結(jié)晶紫染液，室溫染色20 min，PBS清洗結(jié)晶紫，觀察細(xì)胞克隆情況并拍照。

1.2.4 免疫熒光檢測(cè) 自噬體的形成參照文獻(xiàn)[7]方法，在6孔板中放入多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的蓋玻片，然后將結(jié)直腸癌細(xì)胞以合適的密度接種到蓋玻片上，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的阿托伐醌，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，0.5%TritonX-100室溫通透20 min，PBS清洗3次，5 min/次。然后用含3%牛血清白蛋白的PBS封閉30 min，4 ℃下用LC3一抗孵育過(guò)夜，隨后用FITC-熒光二抗室溫孵育1 h，熒光顯微鏡下過(guò)LC3抗體免疫熒光強(qiáng)弱檢測(cè)細(xì)胞自噬體的形成。

1.2.5 活性氧(ROS)的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)熒光探針DCFH-DA標(biāo)記的用阿托伐醌處理后的細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的表達(dá)情況。參考試劑盒方法，將用阿托伐醌處理好后的結(jié)直腸癌細(xì)胞用以雙無(wú)培養(yǎng)基稀釋成終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA溶液進(jìn)行懸浮，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，每5 min顛倒混勻1次，使得細(xì)胞與探針能充分接觸，然后將處理過(guò)的細(xì)胞清洗并重新懸浮在PBS中，用流式細(xì)胞儀測(cè)量DCF熒光強(qiáng)弱。

1.2.6 免疫印跡檢測(cè) 蛋白表達(dá)收集藥物處理后的細(xì)胞，按1×106個(gè)細(xì)胞/mL的密度加入含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液100 μL，渦旋振蕩混勻，于冰上裂解30 min， 4 ℃下以轉(zhuǎn)速13 000 r/min，離心半徑7 cm，離心15 min，取上清液進(jìn)行蛋白定量，加入5×上樣緩沖液制成電泳樣品，于沸水浴中加熱10 min。將制好的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，用濕轉(zhuǎn)法把膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液37 ℃下封閉1 h，而后用稀釋好的目的蛋白相應(yīng)一抗于4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST洗滌膜以去除殘留未結(jié)合的一抗后，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌5次，10 min/次，加入ECL顯影劑后曝光儀成像觀察蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 阿托伐醌抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿托伐醌可增強(qiáng)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞和HCT116細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)毒性，細(xì)胞活力下降，且呈藥物濃度依賴(lài)性(圖1A)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著阿托伐醌濃度的增加，SW480細(xì)胞和HCT116細(xì)胞的克隆數(shù)逐漸減少(圖1B)。以上結(jié)果表明，阿托伐醌能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，且呈濃度依賴(lài)性。

注：A：MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)阿托伐醌處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后的細(xì)胞活力(與對(duì)照組相比，ns：差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；B：細(xì)胞克隆形成情況及細(xì)胞克隆數(shù)的統(tǒng)計(jì)(與對(duì)照組相比，**P<0.01)

2.2 阿托伐醌對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響

采用免疫印跡法檢測(cè)阿托伐醌處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后凋亡相關(guān)標(biāo)志蛋白的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿托伐醌處理結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞和HCT116細(xì)胞后，Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3等凋亡相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化，表明凋亡不是阿托伐醌抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，提示阿托伐醌可能通過(guò)其他機(jī)制抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖(圖2)。

圖2 Western Blot檢測(cè)阿托伐醌處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后凋亡相關(guān)標(biāo)志蛋白的變化

2.3 阿托伐醌促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬

免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3A)顯示，阿托伐醌處理結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞和HCT116細(xì)胞后，胞內(nèi)LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)增加，表明阿托伐醌能促進(jìn)自噬體的形成；與此同時(shí)，采用自噬阻斷劑氯喹(CQ)與阿托伐醌共處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后，CQ與阿托伐醌共處理組的LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)較阿托伐醌單獨(dú)處理組和CQ單獨(dú)處理組多，說(shuō)明阿托伐醌能激活完整的自噬流。此外，蛋白免疫印跡也檢測(cè)了阿托伐醌處理細(xì)胞后自噬相關(guān)標(biāo)志蛋白的變化，結(jié)果顯示，阿托伐醌處理結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞和HCT116細(xì)胞后，自噬相關(guān)基因LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達(dá)增加，p62表達(dá)減少(圖3B)；且較阿托伐醌或CQ單獨(dú)處理，CQ與阿托伐醌共處理后LC3-Ⅱ的表達(dá)增加(圖3C)，這與免疫熒光的結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，阿托伐醌能夠明顯激活結(jié)直腸癌細(xì)胞的自噬水平。

圖3 阿托伐醌促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬

注：A：免疫熒光檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中的LC3熒光斑點(diǎn)；B：Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)標(biāo)志蛋白的變化；C：阿托伐醌與自噬抑制劑氯喹(CQ)共處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后檢測(cè)LC3-Ⅱ表達(dá)情況

2.4 阿托伐醌激活自噬進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖

采用siRNA沉默自噬相關(guān)基因Atg5后檢測(cè)阿托伐醌對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比， Atg5沉默組細(xì)胞活力有明顯回升(圖4A)。且與阿托伐醌單獨(dú)處理相比，3-MA與阿托伐醌的共處理組的細(xì)胞克隆數(shù)增加(圖4B)。以上結(jié)果表明，阿托伐醌能通過(guò)激活結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。

圖4 阿托伐醌激活自噬進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖

注：A：MTT法檢測(cè)siRNA沉默Atg5后阿托伐醌對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞活力的影響(與siNC組比較，ns：差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,**P<0.01)；B：3-MA抑制自噬后阿托伐醌對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞克隆形成的影響(與對(duì)照組相比，**P<0.01；阿托伐醌組與阿托伐醌和3-MA的共處理組相比，**P<0.01)

2.5 阿托伐醌促進(jìn)ROS的產(chǎn)生進(jìn)而激活結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬

采用DCFH-DA探針檢測(cè)胞內(nèi)ROS的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿托伐醌能誘發(fā)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)(圖5A)。且加入ROS清除劑NAC能抑制阿托伐醌誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬(圖5B)。以上結(jié)果說(shuō)明，阿托伐醌通過(guò)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而激活細(xì)胞自噬，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。

圖5 阿托伐醌促進(jìn)ROS的產(chǎn)生進(jìn)而激活結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬

注：A：阿托伐醌處理結(jié)直腸癌后胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況(與對(duì)照組相比，**P<0.01)；B：阿托伐醌與ROS清除劑NAC共處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后自噬標(biāo)志蛋白的變化

3 討論

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)第三高發(fā)的惡性腫瘤，同肺癌、乳腺癌并列世界三大癌癥，由于結(jié)直腸癌的早期診斷較困難，加之結(jié)直腸癌具有無(wú)限增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，所以多數(shù)結(jié)直腸癌患者在明確診斷時(shí)己經(jīng)進(jìn)入中晚期。盡管目前結(jié)直腸癌的治療已趨向于手術(shù)治療、輔助化療和放療的綜合療法，但其對(duì)中晚期結(jié)直腸癌患者的效果不佳，且治療后的各種并發(fā)癥發(fā)生仍然較多，因此進(jìn)一步尋找治療結(jié)直腸癌的新型藥物具有重要意義。目前，較不良反應(yīng)大的傳統(tǒng)化療藥物和研發(fā)困難的新藥相比，重新利用現(xiàn)存藥物并找出其新應(yīng)用已成為治療腫瘤的一大新研究方向。近年來(lái)，一些美國(guó)FDA批準(zhǔn)的抗感染藥物被研究發(fā)現(xiàn)具有很好的抗癌活性，其中阿托伐醌這種長(zhǎng)期被用于抗寄生蟲(chóng)的藥物就顯示出對(duì)甲狀腺癌[5]、乳腺癌[8]具有抑制作用。本研究證實(shí)了阿托伐醌能夠有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，并呈藥物濃度依賴(lài)性。腫瘤細(xì)胞常因凋亡缺陷或細(xì)胞周期異常而導(dǎo)致惡性增殖，激活腫瘤細(xì)胞凋亡可抑制腫瘤細(xì)胞增殖治療癌癥[9]。為研究阿托伐醌抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，本研究采用免疫印跡法檢測(cè)阿托伐醌處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后凋亡情況的發(fā)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3等凋亡相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化，說(shuō)明阿托伐醌抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制不是凋亡而可能是通過(guò)其他機(jī)制。

近年來(lái)，有研究[10]表明，治療腫瘤的藥物除了能引起腫瘤細(xì)胞凋亡，還可誘導(dǎo)其發(fā)生自噬等其他非凋亡形式的細(xì)胞死亡。自噬是一種進(jìn)化上保守的細(xì)胞內(nèi)自我防御機(jī)制，可清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，并重新利用以滿(mǎn)足細(xì)胞本身的代謝需要[11]。自噬作為一種復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)降解方式，在細(xì)胞死亡中具有兩重性，溫和的自噬可促進(jìn)細(xì)胞存活，而過(guò)度的自噬則將誘發(fā)細(xì)胞死亡，被稱(chēng)為自噬性死亡[12]。因此，自噬在抗腫瘤藥物治療中發(fā)揮著非常重要的作用。本研究采用免疫熒光和免疫印跡分別檢測(cè)了阿托伐醌處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后自噬體的形成以及自噬相關(guān)標(biāo)志蛋白的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿托伐醌處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后，胞質(zhì)中LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)明顯增加，自噬相關(guān)標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達(dá)增加，p62的表達(dá)減少，且在加入自噬抑制劑氯喹后，胞內(nèi)LC3-Ⅱ的表達(dá)進(jìn)一步增加，這提示阿托伐醌能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，在阿托伐醌處理結(jié)直腸癌細(xì)胞的同時(shí)，沉默自噬相關(guān)基因Atg5或加入自噬抑制劑3-MA可抑制阿托伐醌對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用，表明阿托伐醌是通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。

自噬能被病原體感染[13]、營(yíng)養(yǎng)壓力[14]以及氧化應(yīng)激[15]等多種刺激因素所激活。其中，活性氧成為了近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。活性氧是細(xì)胞有氧代謝產(chǎn)生的一類(lèi)性質(zhì)比較活潑的含氧化合物的總稱(chēng)，這些化合物會(huì)破壞不同細(xì)胞過(guò)程所必需的生物大分子，同時(shí)又在重要生物事件所需的氧化還原信號(hào)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[16]。研究[17]表明，過(guò)量ROS的產(chǎn)生能誘發(fā)氧化應(yīng)激，破壞細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡，引起細(xì)胞損傷。研究[18]顯示，ROS可通過(guò)調(diào)控mTOR、p53的相關(guān)信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐醌處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后ROS的表達(dá)增加，且在阿托伐醌處理結(jié)直腸癌細(xì)胞的同時(shí)加入ROS清除劑NAC可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬的發(fā)生，表明阿托伐醌能通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬。

綜上所述，阿托伐醌可通過(guò)誘導(dǎo)ROS介導(dǎo)的自噬抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，為結(jié)直腸癌的治療提供了新的研究思路。