基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡和遺傳算法優(yōu)化番茄紅素發(fā)酵培養(yǎng)基

王 強，馮玲然，余曉斌

（1.河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉(xiāng)453007；2.江南大學 生物工程學院 江蘇 無錫 214122）

番茄紅素是一種重要的類胡蘿卜素，在生物體中具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力等生理功能[1-3]。目前，番茄紅素市場尚處于發(fā)展階段，主要體現(xiàn)在昂貴的價格和日益擴增的市場需求方面。根據(jù)Global Industrial Analysts公司的報告，類胡蘿卜素的全球市場價值將在2017年達到13億美元。天然提取法仍是目前獲得番茄紅素的主要途徑，但也面臨著植物中色素含量低和純化工藝復雜等問題。盡管化學合成番茄紅素成本低廉，但是其副產物多，產品難以達到食品安全的要求。近年來，隨著生物技術的蓬勃發(fā)展，利用微生物發(fā)酵生產番茄紅素受到越來越多人的關注[4]。然而，低產量帶來的高成本仍然是發(fā)酵法生產番茄紅素規(guī)?；a的重要限制因素，雖然已經(jīng)有部分企業(yè)實現(xiàn)了番茄紅素的工業(yè)化生產，但番茄紅素產量仍需進一步提升。

適宜的培養(yǎng)基可顯著提高發(fā)酵產物的產量，不同菌株對發(fā)酵培養(yǎng)基的要求不同，同一菌株在誘變前后對發(fā)酵基質的要求往往也會發(fā)生改變。在已報道的文獻中，番茄紅素發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分及各組分的含量有較大差異，這說明三孢布拉霉的酶系豐富，可利用的碳氮源非常廣泛[5-7]。然而，這也給之后的研究者造成了困惑，不得不重新優(yōu)化培養(yǎng)基的組成，在培養(yǎng)基的選擇上參考價值較低，通常需要重新優(yōu)化，而合適的培養(yǎng)基優(yōu)化方法就顯得格外重要。番茄紅素發(fā)酵培養(yǎng)基多數(shù)采用天然培養(yǎng)基，成分復雜，各因素之間相互影響，使試驗因素與結果之間具有較強的離散型，培養(yǎng)基各組分與產量之間存在著非線性關系，常規(guī)方法建立的數(shù)學模型往往不能準確的描述這種關系，試驗結果不盡如人意。人工神經(jīng)網(wǎng)絡技術（Artificial Neural Network，ANN）是對人類大腦的一種物理結構上的模擬。誤差反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡 （Error Back Propagation Neural Network，BPN）是人工神經(jīng)網(wǎng)絡中應用極廣的重要模型之一，在擬合復雜的非線性關系方面具有顯著優(yōu)勢，并且對輸入輸出端點數(shù)沒有顯著，已廣泛應用于發(fā)酵工業(yè)，如培養(yǎng)基優(yōu)化[8-9]、發(fā)酵過程控制[10]等。遺傳算法（Genetic Algorithms，GA）是一種基于自然選擇學說和遺傳學原理的群體尋優(yōu)算法，將繁殖、雜交、變異、競爭、選擇等概念引入算法，非常適合與BP神經(jīng)網(wǎng)絡相結合尋求最優(yōu)解[11-12]。

為了提高發(fā)酵生產水平，人們首先考慮的是優(yōu)良菌種的選育。在完成菌種選育之后，發(fā)酵工藝的優(yōu)化則是另一項基礎而重要的任務。發(fā)酵工藝優(yōu)化的實質是考察各變量對優(yōu)化目標的影響，以獲得影響因子與目標值之間的關系，進而確定最優(yōu)發(fā)酵條件。本研究以誘變育種得到的番茄紅素高產突變株B.trisporaI5（-）和正菌為發(fā)酵菌種，基于 BP（Back Propagation）神經(jīng)網(wǎng)絡模擬發(fā)酵培養(yǎng)基各組分含量與番茄紅素產量之間的函數(shù)關系，再用遺傳算法優(yōu)化番茄紅素發(fā)酵培養(yǎng)基的組成。

1 材料與方法

1.1 菌種

實驗室保藏的三孢布拉霉菌Blakeslea trisporaNRRL 2895（+）和番茄紅素高產突變株Blakeslea trisporaI5（-）。

1.2 培養(yǎng)基

1）固體培養(yǎng)基。 5°麥芽汁，瓊脂 20 g/L，pH 自然，1×105Pa 滅菌 20 min。

2）種子培養(yǎng)基（g/L）。玉米粉 47，黃豆粉 23，KH2PO40.5，維生素 B10.002，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.3，1×105Pa 滅菌 20 min[13]。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L，優(yōu)化前）。 玉米粉 19，黃豆粉 44， 大豆油 80，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 0.6，維生素 B10.002，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.5，1×105Pa滅菌20 min[13]。

1.3 培養(yǎng)方法

1）固體培養(yǎng)。菌種涂布或劃線接種于固體平板后，25 ℃培養(yǎng) 4～5 d。

2）種子培養(yǎng)。將生長4 d的孢子用無菌生理鹽水洗下，調整B.trispora（+）和B.trispora（-）孢子濃度分別為105mL-1和106mL-1。各吸取正、負菌孢子1 mL分別接種于50 mL種子培養(yǎng)基，25℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。

3）發(fā)酵培養(yǎng)。 將正、負菌種子液以 1∶5（v∶v）的比例混合后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為10%。25℃、180 r/min培養(yǎng)120 h，在發(fā)酵48 h時添加0.1 g/L的2-甲基咪唑（番茄紅素環(huán)化酶抑制劑）。

1.4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型設計

1.4.1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型本試驗以發(fā)酵培養(yǎng)基的組成作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡的輸入，番茄紅素的體積產量作為輸出，采用3層網(wǎng)絡。一般輸入層為多個變量，輸出變量為一個或多個，但為了使模型更好，訓練過程更方便，通常選一個輸出變量。輸入層包括碳源、氮源、植物油、磷酸二氫鉀、硫酸鎂，分別標記為X1、X2、X3、X4、X5；隱層的節(jié)點數(shù)n通過試驗確定；輸出層為番茄紅素體積產量，標記為Y。模型的拓撲結構為5-n-1，見圖1。隱層節(jié)點數(shù)的選擇是影響B(tài)P網(wǎng)絡模型性能的重要因素之一，但目前尚無理論方法確定隱層節(jié)點數(shù)，一般通過經(jīng)驗公式和試錯法確定。為了保證足夠高的模擬性能和泛化能力，通常在滿足精度要求的情況下盡可能選擇較少的節(jié)點數(shù)[14]。通過試錯法確定隱層節(jié)點數(shù)，即通過試驗，以模型預測值與實際測量值之間的誤差大小為標準，選取合適的節(jié)點數(shù)。BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型建模和遺傳算法尋優(yōu)均在Matlab R2012b軟件中進行。

圖1 拓撲結構為5-n-1的BP神經(jīng)網(wǎng)絡圖Fig.1 Topology of BP network 5-n-1

1.4.2 數(shù)據(jù)樣本為了獲得典型的數(shù)據(jù)樣本，參照正交設計思想，設計49組試驗，隨機選取其中40組作為訓練樣本，另外9組作為檢驗樣本，49組試驗設計及結果如表1所示。其中，每組設置3個重復，番茄紅素產量取平均值。將輸入樣本和輸出樣本的樣本數(shù)值分別導入Matlab，分別賦予變量名inputdata和 outputdata，并保存為 sample.mat。

表1 BP網(wǎng)絡的訓練樣本Table 1 Training sample of BP network g/L

續(xù)表1

1.4.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡程序代碼將原始樣本數(shù)據(jù)導入MATLAB后，隨機分為訓練樣本（40個）和檢驗樣本 （9個）。分別試驗在1～20個隱層節(jié)點數(shù)情況下，預測結果與實際結果的誤差絕對值之和，由此確定隱層節(jié)點數(shù)。之后，對樣本建模，輸入層向隱含層傳遞的函數(shù)用tansig（S型正切函數(shù)），隱含層向輸出層傳遞的函數(shù)選用purelin（純線性函數(shù)），訓練函數(shù)選擇traingdx。源程序如下

1）確定隱層節(jié)點數(shù)程序

load sample%導入原始樣本

data=inputdata'；%矩陣轉置

result=outputdata'；

n=randperm（49）；%1-49 隨機排列

p=data（：，n（1：40））；%取 40 個樣本用于訓練

t=result（：，n（1：40））；

test=data（：，n（41：49））；%取剩余 9 個樣本用于檢驗

b=result（：，n（41：49））；

save bpdata%將上述變量保存于bpdata.mat

[pn，pp]=mapminmax（p）；%歸一化處理

minp=pp.ymin；

maxp=pp.ymax；

[tn，tt]=mapminmax（t）；

mint=tt.ymin；

maxt=tt.ymax；

fori=1：20%循環(huán)

net =newff （pn，tn，i，{'tansig'，'purelin'}，'traingdx'）；%構建神經(jīng)網(wǎng)絡

net.divideParam.trainRatio=100/100；%修改訓練樣本比例

net.divideParam.valRatio=0/100；

net.divideParam.testRatio=0/100；

net.trainParam.epochs=2000；%最大訓練次數(shù)

net.trainParam.lr=0.05；%學習步長

net.trainParam.goal=0.00001；%學習目標

net=train（net，pn，tn）；%訓練函數(shù)

testn=mapminmax（'apply'，test，pp）；%歸一化測試樣本

an=sim（net，testn）；%預測

a=mapminmax（'reverse'，an，tt）；%反歸一化

sse=sum（（b-a）.^2） %誤差平方和

r（i）=norm（sse）；%輸出不同隱層節(jié)點數(shù)下的誤差平方和

end

2）BP神經(jīng)網(wǎng)絡建模程序

load bpdata

[pn，pp]=mapminmax（p）；

minp=pp.ymin；

maxp=pp.ymax；

[tn，tt]=mapminmax（t）；

mint=tt.ymin；

maxt=tt.ymax；

net=newff （pn，tn，12，{'tansig'，'purelin'}，'traingdm'）；

net.divideParam.trainRatio=100/100；

net.divideParam.valRatio=0/100；

net.divideParam.testRatio=0/100；

net.trainParam.epochs=20000；

net.trainParam.lr=0.05；

net.trainParam.goal=0.00001；

net=train（net，pn，tn）；

testn=mapminmax（'apply'，test，pp）；

an=sim（net，testn）；

a=mapminmax（'reverse'，an，tt）；

figure（1）

plot（a，'：og'）

hold on

plot（b，'-*'）；

legend（'預測產量 '，'實際產量 '）

title（'BP網(wǎng)絡預測和實際產量'）

xlabel（'樣本 '）

ylabel（'番茄紅素產量（g·L^{-1}）'）

save net

1.5 遺傳算法的尋優(yōu)設計

上述BP神經(jīng)網(wǎng)絡對發(fā)酵培養(yǎng)基組成與番茄紅素體積產量之間的關系進行建模，預測培養(yǎng)基成分不同含量下番茄紅素的產量。為了獲得各組分的最優(yōu)含量，本文采用遺傳算法（Genetic Algorithm）進行尋優(yōu)。

在MATLAB R2012b中輸入命令optimtool打開優(yōu)化工具箱，求解器選擇GA-Genetic Algorithm，變量數(shù)選擇5，變量上下限分別為[20 4 20 0.8 0.2]和[50 16 50 2 0.8]，初始種群20，種群類型選雙精度，種群選擇方法選Roulette，交叉點選單點交叉，交叉概率為0.8，變異概率選0.05，進化代數(shù)為100，其他保持默認。適應度函數(shù)為@fit，函數(shù)代碼如下

function fitness=fit（x）

load net

x=x'；

xn=mapminmax（'apply'，x，pp）；

yn=sim（net，xn）；

y=mapminmax（'reverse'，yn，tt）；

fitness=-y；

1.6 生物量和番茄紅素產量的測定

發(fā)酵結束后，取10 mL發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗滌3次。菌絲體干重的測定采用稱重法，105℃烘干至恒重后稱重。番茄紅素的測定則將洗滌后的菌絲體在40℃真空干燥后研磨破壁，然后用石油醚萃取至菌絲體無色，合并萃取液用于番茄紅素含量的測定。番茄紅素的測定采用比色法，萃取液經(jīng)適當稀釋后在502 nm波長下測定吸光值，并用標準曲線計算番茄紅素質量濃度[15]。見圖2。

圖2 番茄紅素標準曲線Fig.2 Standard curve of lycopene

2 結果與分析

2.1 碳源種類對生物量和番茄紅素產量的影響

碳源不僅是構成細胞和番茄紅素的碳骨架，也是維持細胞生命活動的重要能量來源，常見的碳源包括糖類、有機酸、低級醇、油脂等。針對已有文獻報道及B.trispora的生長特性，本文選取玉米粉、麥芽糊精、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖這5中常見碳源，每種碳源3個濃度水平，考察其對B.trispora產番茄紅素及生物量的影響。其中，碳源低、中、高質量濃度水平分別為20、30、40 g/L，結果如圖3所示。由圖可知，玉米粉對番茄紅素產量和生物量的影響均明顯優(yōu)于其他碳源。因此，選擇玉米粉作為碳源進行后續(xù)試驗。

圖3 不同碳源對番茄紅素產量發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of different carbon source on lycopene fermentation

2.2 氮源種類對生物量和番茄紅素產量的影響

氮源用于細胞物質（如蛋白質、核酸等）和含氮代謝物的合成，常見的氮源可以分為有機氮源和無機氮源兩類。無機氮源主要包括銨鹽、硝酸鹽、氨水等；有機氮源主要包括黃豆粉、玉米漿、黃豆餅粉、蛋白胨、棉籽餅粉、酵母粉等。本論文選取黃豆粉、玉米漿干粉、蛋白胨、硝酸鈉、硫酸銨這五種常見氮源，每種氮源選取3個濃度水平，考察其對番茄紅素產量和生物量的影響。由于黃豆粉中氮的利用率較低，其低、中、高濃度水平分別為 20、30、40 g/L；其它氮源的低、中、高濃度水平分別為 6、10、12 g/L，結果如圖4所示。有機氮源對番茄紅素產量和生物量的影響明顯優(yōu)于無機氮源，且玉米漿干粉的效果最佳。因此，玉米漿干粉被選為后續(xù)試驗的氮源。

圖4 不同氮源對番茄紅素發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of different nitrogen source on lycopene fermentation

2.3 不同植物油對生物量和番茄紅素產量的影響

植物油作為輔助碳源經(jīng)常被用于工業(yè)發(fā)酵中，如抗生素的生產等，植物油可被微生物分泌的胞外脂肪酶分解，進而吸收利用。本試驗選取棉籽油、大豆油、花生油、菜籽油、亞麻籽油和橄欖油這6中常見植物油，每種植物油選取低、中、高3個濃度水平，分別為30、40、50 g/L，考察其對生物量和番茄紅素產量的影響，結果見圖5。在添加大豆油或亞麻籽油的情況下，單位菌體番茄紅素產量較其它試驗組高，但亞麻籽試驗組的生物量明顯低于大豆油試驗組。因此，綜合考慮單位菌體番茄紅素產量和生物量，選擇大豆油作為輔助碳源進行后續(xù)試驗。

圖5 不同植物油對番茄紅素發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of different plant oils on lycopene fermentation

2.4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型的建立與檢驗

根據(jù)碳源、氮源、植物油種類的選擇試驗結果，本試驗選取玉米粉、玉米漿干粉、大豆油、磷酸二氫鉀、硫酸鎂作為輸入變量，變量的取值范圍如表1所示。采用3層BP神經(jīng)網(wǎng)絡進行建模，輸入層傳遞函數(shù)為tansig，輸出層傳遞函數(shù)為purelin，訓練函數(shù)為traingdx。由于確定了輸入層節(jié)點數(shù)、輸出層節(jié)點數(shù)、傳遞函數(shù)和層數(shù)等參數(shù)，所以隱層的節(jié)點數(shù)將在很大程度上決定網(wǎng)絡性能。為了獲得更好的網(wǎng)絡性能，依次選擇1～20個隱層節(jié)點數(shù)，經(jīng)過2 000次訓練后，得到相應的誤差平方和，結果如圖6所示。當隱層節(jié)點數(shù)為12和17時，誤差平方和較小，選取這兩個節(jié)點數(shù)做進一步訓練，結果表明，隱層節(jié)點數(shù)為12時誤差平方和最小。因此，選擇12個隱層節(jié)點數(shù)對BP神經(jīng)網(wǎng)絡進行2萬次的訓練，訓練目標為均方誤差達到10-5，學習步長為0.05。網(wǎng)絡經(jīng)過19 848次迭代后均方誤差達到目標值，網(wǎng)絡性能達到穩(wěn)定，訓練曲線如圖7所示。

圖6 不同隱層節(jié)點數(shù)下的BP神經(jīng)網(wǎng)絡的誤差平方和Fig.6 Sum squared error of BP neural network in different hidden layer nodes

圖7 BP網(wǎng)絡訓練曲線Fig.7 Training curve of BP network

為了進一步確定網(wǎng)絡的模擬性能和泛化能力，將檢驗樣本的自變量輸入模型，經(jīng)過模擬仿真后得到預測值，比較預測值與實際值的差別，結果如圖8所示。

圖8 檢驗樣本預測產量與實際產量比較Fig.8 Comparison of simulation and actual production of test sample

從誤差曲線可以看出，預測值與實際值之間的誤差非常小，正負誤差均在4%范圍內，二者的吻合度非常高。因此，所建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型穩(wěn)定且泛化能力較強，可用于估算培養(yǎng)基成分不同含量下番茄紅素產量。

2.5 利用遺傳算法優(yōu)化培養(yǎng)基組成

在BP神經(jīng)網(wǎng)絡建模成功后，利用BP網(wǎng)絡捕獲的輸入與輸出之間的映射關系，作為遺傳算法的適應度函數(shù)。再根據(jù)訓練數(shù)據(jù)樣本確定5種培養(yǎng)基組分的變化范圍（搜索空間），在搜索空間內隨機選擇20種組合作為初始群里，經(jīng)過不斷的選擇、交叉、變異操作，直到滿足終止條件（見圖 9（a））。最終，當玉米粉、玉米漿干粉、大豆油、磷酸二氫鉀、硫酸鎂的含量分別為 41.2、8.93、26.5、1.39、0.46 g/L 時， 獲得番茄紅素產量最大預測值1.27 g/L（見圖9（b））。與初始培養(yǎng)基相比，變化較大的為玉米粉和大豆油的質量濃度，玉米粉的質量濃度從初始培養(yǎng)基的19 g/L增加到優(yōu)化后的41.2 g/L，大豆油的質量濃度從初始培養(yǎng)基的80 g/L減少到優(yōu)化后的26.5 g/L。二者均作為碳源，其中玉米粉是較易利用的碳源，在發(fā)酵過程前期，微生物將優(yōu)先利用玉米粉快速生長，在發(fā)酵中后期，隨著玉米粉的逐漸耗盡，微生物開始大量利用大豆油作為碳源維持生命活動。大豆油的添加雖然可以延長發(fā)酵周期，促進產物形成，但是過量的大豆油也會影響溶氧、pH等。為了驗證預測結果的可靠性，以此組合作為培養(yǎng)基的配方，做3組重復試驗，測定番茄紅素的實際產量。結果表明，在此條件下，番茄紅素的單位菌體番茄紅素質量濃度和生物量分別為28.1 mg/g和44.4 g/L，體積產量為1.25±0.02 g/L，與預測值的相對誤差不超過5%，較優(yōu)化前（0.95±0.02 g/L）提高了 31.6%。因此，BP 神經(jīng)網(wǎng)絡模型可以很好的模擬發(fā)酵培養(yǎng)基各組分含量與番茄紅素產量的關系，與遺傳算法相結合，可以快速得到培養(yǎng)基的最優(yōu)組成。

圖9 遺傳算法尋優(yōu)軌跡Fig.9 Evolution of generations for lycopene production process optimization

3 討論

在碳源的選擇中，玉米粉固形物含量高，有利于絲狀真菌的附著和蔓延，因此生物量較大。而其他可溶性碳源由于固形物含量低，菌絲體容易結團，嚴重影響傳質和攝氧，從而影響菌絲體的生長和番茄紅素的合成。此外，玉米粉不僅含有豐富的碳水化合物，還含有多種生長因子和微量元素，更有利于番茄紅素的合成。在氮源的比較中，無機氮源質量穩(wěn)定，但成分單一，缺乏營養(yǎng)物質，作為唯一氮源效果往往不好。在有機氮源中，玉米漿干粉不僅氨基酸含量豐富，還含有多種微量元素、生物素等，而且較玉米漿成分更加穩(wěn)定，有利于菌體的生長和番茄紅素的合成。當快速利用碳源消耗殆盡時，植物油可為微生物的生長提供碳骨架和能量來源，延長發(fā)酵周期。在番茄紅素的發(fā)酵生產過程中，植物油的分解產物乙酰輔酶A不僅可進入三羧酸循環(huán)，為細胞生長提供能量，還可作為脂肪和番茄紅素合成的共同前體物質。因此，植物油的添加不僅可明顯提高生物量，還可以顯著促進番茄紅素的合成。

單因素試驗忽略了不同培養(yǎng)基成分之間的交互作用，可能會錯過最優(yōu)條件，而且試驗次數(shù)很多；響應面優(yōu)化法通常用的模型是二次多項式，在實際應用中，只能用到2～3個水平；正交設計和均勻設計都會受到因素的限制。遺傳算法已被證實非常適用于多因素多水平、非線性優(yōu)化的問題，但遺傳算法存在容易丟失歷史數(shù)據(jù)的問題。人工神經(jīng)網(wǎng)絡能很好的捕獲和訓練數(shù)據(jù)，它允許用戶直接用一種穩(wěn)定的形式來訪問歷史數(shù)據(jù)，這正好彌補了遺傳算法的缺點。因此，人工神經(jīng)網(wǎng)絡可以幫助研究者處理歷史數(shù)據(jù)，獲得培養(yǎng)基組分與產物之間的一種隱函數(shù)關系，遺傳算法可利用這種函數(shù)關系作為適應度函數(shù)，從而快速搜索得到最優(yōu)解。利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡和遺傳算法相結合優(yōu)化培養(yǎng)基組成的報道很多，Nagata等[16]利用人工神經(jīng)網(wǎng)路和遺傳算法優(yōu)化海因酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成，獲得的最大產量比多項式優(yōu)化結果高出14%；Weuster-botz等[17]利用遺傳算法優(yōu)化甲酸脫氫酶發(fā)酵培養(yǎng)基，甲酸脫氫酶的產量提高了50%；Sivapathasekaran等[18]采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡和遺傳算法相結合優(yōu)化生物表面活性劑的發(fā)酵培養(yǎng)基，其產量提高了約70%。

4 結 語

本研究采用拓撲結構為5-12-1的BP神經(jīng)網(wǎng)絡建立培養(yǎng)基各組分含量與番茄紅素產量的網(wǎng)絡模型，很好的模擬了它們之間關系，與遺傳算法相結合，快速得到了培養(yǎng)基的最優(yōu)組成，經(jīng)驗證，番茄紅素產量較優(yōu)化前提高了31.6%。因此，BP神經(jīng)網(wǎng)絡結合遺傳算法是番茄紅素乃至其它代謝產物發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的有力工具。