木聚糖酶EvXyn11TSN端區(qū)域?qū)ζ淠蜔嵝载暙I的生物信息學(xué)分析

臧 嘉，李 闖，王 瑞，吳 芹，鄔敏辰

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

木聚糖酶（xylanases，EC 3.2.1.8）從木聚糖分子主鏈的內(nèi)部隨機切割β-1，4-D-木糖苷鍵，產(chǎn)生帶有或無側(cè)鏈基團的寡聚木糖?；谝患壗Y(jié)構(gòu)的同源比對及疏水簇分析，大多數(shù)木聚糖酶歸屬糖苷水解酶10和11家族[1]。目前商品化的木聚糖酶多數(shù)為最適溫度Topt在40～55℃的中溫酶，然而酶在使用過程中如紙漿漂白 （～70℃）和飼料加工 （～80℃）等經(jīng)常會遭遇或需要高溫環(huán)境[2]。因此，耐熱性差已成為制約木聚糖酶發(fā)展的瓶頸。

影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的因素有：N或C末端、二硫鍵、鹽橋、氫鍵和氨基酸相互作用等[3]。EvXyn11TS是已發(fā)現(xiàn)的11家族中極少數(shù)耐熱木聚糖酶之一[4]。本實驗室前期研究表明，EvXyn11TS耐熱性與其N端區(qū)域密切相關(guān)。文獻[2]用EvXyn11TSN端38個氨基酸替換AuXyn11A N端33個殘基，雜合酶AEXynM的Topt和耐熱性分別提高了20和30℃，表明EvXyn11TSN端對酶溫度特性的重要性。文獻[5]利用定點突變證實了EvXyn11TSN端二硫鍵（Cys5-Cys32）是其具有高耐熱性的主要因素。用EvXyn11TSN端42個氨基酸替換AoXyn11A對應(yīng)的37個殘基獲雜合酶AEx11A，再去除AEx11A N端二硫鍵獲突變酶AEx11AC5T[6]。分析表明，AoXyn11A N端區(qū)域替換前后的Topt分別為50和75℃，而AEx11AC5T的Topt為60℃，由此可見，EvXyn11TSN端對其耐熱性的影響是多因素協(xié)同作用的結(jié)果。

本研究擬采用生物學(xué)程序或軟件分析比對EvXyn11TS與同一家族其他木聚糖酶的一級和三維結(jié)構(gòu)尤其是在N端區(qū)域的異同點，以期解析EvXyn11TSN端區(qū)域的耐熱性機制，為與其一級結(jié)構(gòu)同源性高、比活性高和酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的中溫木聚糖酶的耐熱性改造提供理論基礎(chǔ)。

1 分析方法

1.1 11家族木聚糖酶的獲取

以EvXyn11TS序列（GenBank：ACB87631） 為模板，在 GenBank 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中借助BLAST搜尋與模板一級結(jié)構(gòu)同源性大于55%、不同來源的11家族木聚糖酶，去除重復(fù)和不完整序列，并查閱相關(guān)文獻，獲一級結(jié)構(gòu)完整且溫度特性已知的30種木聚糖酶。

1.2 木聚糖酶一級結(jié)構(gòu)的分析

運 用 ClustalW2 程 序 （http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/）將EvXyn11TS和30種木聚糖酶進行多序列同源比對。使用MEGA 5.1軟件（http：//www.megasoftware.net/）構(gòu)建木聚糖酶進化樹，從中選擇包含EvXyn11TS在內(nèi)的代表性耐熱和中溫酶。使用DNAMAN 6.0軟件對代表性酶N端區(qū)域的異同點進行分析和比對。

1.3 木聚糖酶三維結(jié)構(gòu)的同源建模

在 PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/） 中查找木聚糖酶的晶體結(jié)構(gòu)；對晶體結(jié)構(gòu)未知的，以EvXyn11TS晶體結(jié)構(gòu) （PDB：2VUL）為模板，運用MODELLER 9.11 程 序 （http：//salilab.org/modeller/）和PyMOL軟件（http：//pymol.org/）對酶三維結(jié)構(gòu)進行同源建模和分析。

1.4 木聚糖酶三維結(jié)構(gòu)的分析

運用 Gromacs 4.5 程序包（http：//www.gromacs.org/）對木聚糖酶三維結(jié)構(gòu)進行分子動力學(xué)模擬。使用g_rmsf軟件計算酶分子各個氨基酸的根均方漲落（RMSF）值，將其導(dǎo)入木聚糖酶三維結(jié)構(gòu)文件中，采用B-FITTER和Excel軟件計算和處理B-factor值，按照氨基酸序號繪制B-factor圖譜。通過比對耐熱與中溫酶的B-factor值，找出兩類酶差異性大的區(qū)域。使用g_rms軟件計算酶的根均方偏差（RMSD）值，分析β-折疊股A1對酶耐熱性的貢獻。 使用 PIC 軟件（http：//crick.mbu.iisc.ernet.in/） 對木聚糖酶N端的二硫鍵、鹽橋和疏水性作用等進行分析和比對。采用 PoPMuSiC在線程序（http：//dezyme.com/）預(yù)測EvXyn11TSN端各個氨基酸飽和突變前后酶蛋白折疊自由能的變化值（ΔΔG）。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶進化樹的構(gòu)建

基于多序列同源比對，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建了木聚糖酶的進化樹（圖1），計算模型選擇Poisson Correction，使用 Bootstrap 檢測（Replications=10 000）以確保進化樹具有較高的可信性。根據(jù)酶蛋白的親緣關(guān)系，將它們分為A、B兩組。A組為18種原核生物木聚糖酶，與EvXyn11TS的同源性均大于60%；B組為13種真核生物木聚糖酶。EvXyn11TS、Tfl08 和 Umi17 為耐熱酶[4，7-8]，其余 28 種為中溫酶。

圖1 31種11家族木聚糖酶的進化樹Fig.1 A phylogenetic tree of 31 xylanases belonging to family 11

2.2 代表性木聚糖酶的選擇

從進化樹中選擇了涵蓋不同種屬來源的，且一級結(jié)構(gòu)同源性分布廣的8種代表性耐熱和中溫木聚糖酶（圖1以粗字體表示），用以分析和比對它們在N端的異同點。2種耐熱酶EvXyn11TS和Umi17的Topt分別為 75℃和 80℃；6種中溫酶 Ssp02、Cfi12、Bsu15、Tre20、Aor27 和 Vda29 的Topt在 45～55℃（表 1）。一級結(jié)構(gòu)比對顯示，7種酶分別與EvXyn11TS的序列同源性分布在55.3%～74.4%。

2.3 木聚糖酶N端區(qū)域的異同點

2.3.1 N端區(qū)域的比對 將8種代表性木聚糖酶進行了多序列同源比對（圖2）。相對于其他區(qū)域，8種酶在N端 （紅線框出部分）總體序列的保守性極差，而耐熱酶EvXyn11TS和Umi17兩者序列的同源性相對較高，推測11家族木聚糖酶的耐熱性與其N端密切相關(guān)。此外，耐熱酶的N端存在一個二硫鍵（藍線框出部分），且比中溫酶多出一個β-折疊股A1。

表1 8種代表性木聚糖酶的溫度特性Table 1 Temperature properties of eight representative xylanases

文獻[15]研究表明，蛋白質(zhì)構(gòu)象的剛性是評價其耐熱性的一個重要指標，與蛋白質(zhì)各位點處氨基酸的B-factor值成負相關(guān)性。基于此，運用Gromacs 4.5對4種酶的三維結(jié)構(gòu)進行了分子動力學(xué)模擬（300 K，15 ns），其中酶分子 N 端（1～51 個氨基酸，以EvXyn11TS一級結(jié)構(gòu)的序號為基準）的B-factor圖譜如圖3所示。由圖3可見，3種中溫酶多個位點處氨基酸的B-factor值明顯高于EvXyn11TS的，表明后者N端的剛性或耐熱性較高，與文獻[2，6]相符。

圖2 8種代表性11家族木聚糖酶的多序列比對Fig.2 Multiple alignment of eight representative 11 family xylanases

圖3 EvXyn11TS和中溫木聚糖酶N端各位點處氨基酸的B-factor值Fig.3 B-factor values of amino acids at the N-termini of EvXyn11TSand mesophilic xylanases

2.3.2 氨基酸組成Kumar等[3]統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，耐熱菌中蛋白質(zhì)的Arg、Glu、Leu和Pro（稱為耐熱有利氨基酸） 含量高于常溫菌， 而 Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp和Gly（稱為耐熱不利氨基酸）低于常溫菌，這可能是由于在高溫環(huán)境下某些氨基酸不穩(wěn)定或側(cè)鏈太小對整個蛋白質(zhì)剛性造成不利的影響[16]。本研究統(tǒng)計了8種木聚糖酶N端的氨基酸組成 （表2）。結(jié)果顯示，EvXyn11TSN端的耐熱有利和不利氨基酸含量分別為13.7%和54.9%，其他酶的耐熱有利和不利氨基酸含量分別小于7%和大于60%，推測N端耐熱有利或不利氨基酸含量的顯著差異是EvXyn11TS耐熱性高的原因之一。

2.3.3 β-折疊股A1RMSD值是指在模擬高溫下某一時刻的蛋白構(gòu)象與初始構(gòu)象之間所有原子的根均方偏差值，RMSD值越小，蛋白質(zhì)構(gòu)象的剛性越強或熱穩(wěn)定性越高[5]。圖2顯示了耐熱酶EvXyn11TS或Umi17較中溫酶在N端區(qū)域多出一個β-折疊股A1。對EvXyn11TS去除A1前后的三維結(jié)構(gòu)進行了分子動力學(xué)模擬（500 K，10 ns），模擬過程到達平衡后（>5 ns），去除 A1的EvXyn11TS的RMSD值明顯高于EvXyn11TS的（圖4），表明前者構(gòu)象的剛性顯著降低。文獻[17]曾在木聚糖酶AoXyn11A的N末端引入由5個氨基酸組成的β-折疊股，增加該部位與β-折疊股A2的相互作用，提高了酶的剛性和熱穩(wěn)定性。

表2 8種木聚糖酶N端耐熱有利和不利氨基酸的含量Table 2 Contents of amino acids at the N-termini of 8 xylanases favorable and unfavorable to thermostability %

圖4 EvXyn11TS去除β-折疊股A1前后的RMSD值Fig.4 RMSD values of EvXyn11TSbefore and after removing β-strand A1

2.3.4 氨基酸的相互作用8種木聚糖酶的鹽橋和二硫鍵數(shù)目統(tǒng)計顯示，2種耐熱酶EvXyn11TS（圖5）和Umi17 N端均包含2個鹽橋和1個二硫鍵，而6種中溫酶僅Cfi12擁有1個鹽橋。文獻[18]獲得了耐熱性提高的突變木聚糖酶XylAG13R，三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，D11與R13形成的鹽橋?qū)δ蜔嵝杂写龠M作用。文獻[19]在AoXyn11A的N端引入1個二硫鍵，所獲突變酶AoXyn11AM的Topt有一定的提高。

圖5 EvXyn11TSN端區(qū)域的鹽橋和二硫鍵Fig.5 Salt bridges and disulfide bond at the N-terminus of EvXyn11TS

在11家族木聚糖酶N端區(qū)域，2個芳香族氨基酸苯環(huán)之間距離小于7.0 ?時產(chǎn)生相互作用，通過錨定酶分子N端的β-折疊股B1、B2和A2來增強該區(qū)域的剛性，進而提高酶的熱穩(wěn)定性。通過對8種木聚糖酶N端三維結(jié)構(gòu)的分析和比對，耐熱酶EvXyn11TS和Umi01包含相對較多的這種相互作用，如EvXyn11TS13和18位的氨基酸為Phe，兩者的相互作用增強了B1與B2間的剛性（圖6）。文獻[20]研究發(fā)現(xiàn)，在中溫酶中引入芳香族氨基酸（T11Y）顯著提高了酶的熱穩(wěn)定性。

圖6 EvXyn11TSN端區(qū)域Phe13-Phe18的相互作用Fig.6 Interaction between Phe13and Phe18at the N-terminus of EvXyn11TS

2.3.5 特殊氨基酸His的咪唑環(huán)是良好的氫供體和受體，較其他氨基酸更易形成氫鍵[21]。EvXyn11TSN端在14位存在一個His，在三維結(jié)構(gòu)上His14不僅能與Gly16和Phe17形成主鏈-主鏈氫鍵，也能與Leu34形成主鏈-側(cè)鏈氫鍵；而6種中溫酶有4種在對應(yīng)位點處非His。文獻[22]在“Pro理論”中指出，在主鏈構(gòu)象不發(fā)生驟變的前提下，向β-轉(zhuǎn)角或無規(guī)卷曲處引入Pro，能通過降低去折疊時的熵來提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。在α-葡萄糖苷酶耐熱性的研究中，文獻[23]分別將位于其loop結(jié)構(gòu)中的4個氨基酸突變?yōu)镻ro，結(jié)果表明，其中有三個突變酶的熱穩(wěn)定性得到了不同程度的提高。EvXyn11TSN端存在2個位于9和26位的Pro，分別處于連接β-折疊股A1與B1以及B2與A2的loop結(jié)構(gòu)的β-轉(zhuǎn)角處。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)由氨基酸突變產(chǎn)生的ΔΔG為正值時，則認為突變前其構(gòu)象穩(wěn)定[24]。EvXyn11TSN端的His14除突變?yōu)?Ile和Tyr時 ΔΔG幾乎無變化外（分別為0和-0.03 kcal/mol），突變?yōu)槠渌?7種氨基酸時ΔΔG為正值；Pro9和Pro26分別突變?yōu)槠渌我庖环N氨基酸時ΔΔG均為正值。由此推測His14、Pro9和Pro26的存在使EvXyn11TS具有較低的折疊自由能，是其具有耐熱性的關(guān)鍵因素。

3 結(jié) 語

木聚糖酶尤以11家族的是工業(yè)應(yīng)用最廣泛的酶類之一。如何提高木聚糖酶的耐熱性以適應(yīng)使用過程中的高溫環(huán)境，已成為當(dāng)前研究的熱點。本研究基于11家族耐熱和中溫木聚糖酶在N端區(qū)域的差異性分析，預(yù)測了EvXyn11TSN端區(qū)域可能賦予其高耐熱性的主要因素有：較高的耐熱有利氨基酸含量、多出的β-折疊股A1、較多的氨基酸相互作用及特殊氨基酸的存在等。本文對EvXyn11TSN端耐熱機制的解析，將為中溫木聚糖酶的耐熱性改造提供新的思路。