酪氨酸氧化產(chǎn)物誘導(dǎo)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷

冉玉梅，李竹青，丁寅翼，趙 琪，施用暉，2，樂國偉*，2

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

食品中的蛋白質(zhì)在加工、儲存及運(yùn)輸過程中，不可避免的會(huì)受到高溫、擠壓、剪切力等物化因素的作用，或者在自由基和脂質(zhì)過氧化物的存在下發(fā)生氧化修飾[1-2]。蛋白質(zhì)氧化修飾不僅降低食品的感官品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值，其氧化產(chǎn)物可能危害人體健康。在肉制品和奶制品的加工過程中都會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)氧化修飾[3-4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，攝入氧化蛋白質(zhì)會(huì)導(dǎo)致小鼠血液和組織中自由基水平顯著升高，丙二醛含量顯著增加，抗氧化酶活性下降[5]。

酪氨酸廣泛存在于蛋白質(zhì)含量豐富的食品中，在加工過程中，容易被氧化修飾成雙酪氨酸和3-硝基酪氨酸，雙酪氨酸與多種神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)，雙酪氨酸會(huì)促進(jìn)β-淀粉樣蛋白的形成和核突觸蛋白聚集，它們分別是阿爾茨海默病腦部老年斑和帕金森患者路易小體的主要成分，具有神經(jīng)毒性[6-7]。3-硝基酪氨酸也具有神經(jīng)毒性，會(huì)損傷多巴胺神經(jīng)元，造成神經(jīng)功能障礙[8]。

前期研究表明氧化酪蛋白和酪氨酸氧化產(chǎn)物會(huì)造成動(dòng)物機(jī)體組織出現(xiàn)氧化損傷[9-10]。食入酪氨酸氧化產(chǎn)物是否會(huì)在腦組織中積累尚不清楚。本文作者在探討食源性酪氨酸氧化產(chǎn)物對大鼠腦部氧化還原狀態(tài)及空間學(xué)習(xí)記憶的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

酪氨酸氧化產(chǎn)物 （TOP，tyrosine oxidation products）：實(shí)驗(yàn)室自制[10]；Trizol裂解液：美國Biomiga公司；熒光染料SBY：南京諾唯贊生物科技有限公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶：美國Promega公司；DEPC、基因引物：上海捷瑞生物工程有限公司。3-硝基酪氨酸（3-NT）、雙酪氨酸（Dityr）和 β-淀粉樣蛋白（Aβ40）試劑盒：廈門慧嘉生物科技有限公司；丙二醛（MDA）和4-羥基壬烯醛（4-HNE）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

ANY-maze動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)：美國Stoeling公司；動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)裝置：上海欣軟信息科技有限公司；7900HT Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)：美國ABI公司；5804R高速冷凍離心機(jī)：德國Effendorf公司；超低溫冷凍冰箱：美國INVETRO公司；One drop：上海天美科學(xué)儀器有限公司；PCR基因擴(kuò)增儀：美國MJ公司。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

4周齡清潔級雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分成4組：Control組（正常日糧，n=10） 、Tyr組（添加 0.44%酪氨酸，n=10）、TOP1組（添加0.22%酪氨酸氧化產(chǎn)物，n=10）、TOP2組 （添加0.44%酪氨酸氧化產(chǎn)物，n=10）。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為23±2℃，濕度為60%，采用12/12 h循環(huán)光照。飼養(yǎng)期間大鼠可自由采食和飲水。飼喂24周后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮（Morris water maze）是1981年由Richard G.Morris建立，主要用于測試動(dòng)物海馬依賴性空間學(xué)習(xí)與記憶能力。實(shí)驗(yàn)強(qiáng)迫動(dòng)物游泳并學(xué)會(huì)尋找隱藏在水中的平臺，以測試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對空間位置覺和方向覺的學(xué)習(xí)與記憶能力[11]。

水迷宮裝置是一個(gè)圓形塑料游泳池，直徑180 cm。如圖1所示。水溫保持在25±0.5℃。游泳池分為 4個(gè)象限，分別標(biāo)記為 North，South，East和West。實(shí)驗(yàn)中所用的逃生平臺直徑為12 cm。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，保持環(huán)境安靜，房間內(nèi)物件擺放要給動(dòng)物提供空間線索。

經(jīng)典的Morris水迷宮分為定位航行實(shí)驗(yàn)（Place Navigation）和空間探索實(shí)驗(yàn)（Probe Trial）兩部分。

1）定位航行實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)是將平臺沒于水面下1 cm，并用白色無毒染料將水染成白色不透明狀，保證不能從水面直接看到隱藏在水下的平臺。該實(shí)驗(yàn)用于訓(xùn)練大鼠學(xué)會(huì)尋找隱藏在水面下的平臺。定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)4 d，訓(xùn)練時(shí)由實(shí)驗(yàn)者將大鼠面向池壁輕輕地放入水池中讓其自由游泳。每只大鼠每天訓(xùn)練4次（分別從4個(gè)象限放入水中），每次時(shí)間間隔不得少于30 min。記錄大鼠尋找到隱藏在水面下平臺的時(shí)間，即逃避潛伏期（Escape latency），并讓其在平臺上熟悉記憶周圍環(huán)境15 s。最大游泳時(shí)間限度為60 s，若大鼠在60 s內(nèi)未能找到平臺，由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)大鼠爬上平臺并讓其熟悉記憶周圍環(huán)境20 s。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用干凈的毛巾將大鼠擦干并讓其待在溫暖的地方。

2）空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，撤出平臺，讓大鼠自由探索60 s。記錄其在60 s內(nèi)在各個(gè)象限中的停留時(shí)間，以及穿越原平臺所在象限的次數(shù)及在該象限中的游泳路程。該實(shí)驗(yàn)用于檢測大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺后，對平臺空間位置的記憶能力。

圖1 Morris水迷宮裝置示意圖Fig.1 Diagram of Morris water maze

1.4.2 組織取樣和處理行為學(xué)結(jié)束后，處死大鼠，解剖取海馬組織。其中一半的海馬組織用生理鹽水按重量體積比為1∶10制成組織勻漿液，4℃，4 000 r/min離心10 min，取上清，-80℃保存。另一半海馬組織按50 mg組織加入1 mL Trizol的比例加入Trizol溶液，勻漿，-80℃保存，用于提取RNA。

1.4.3 海馬組織各生化指標(biāo)的測定Dityr、3-NT、Aβ40、MDA、4-HNE均嚴(yán)格按照說明書操作，蛋白含量以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Bradford法測定[12]。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析采用Trizol法提取海馬組織中總的RNA，用One drop測定RNA的260 nm/280 nm吸光度比值 （1.8～2.0表示純度符合要求）。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測目的基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of the primers

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖形繪制。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。運(yùn)用單/雙因素方差分析 （ANOVA），Turkey檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，顯著性水平為p＜0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 酪氨酸氧化產(chǎn)物對大鼠Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶的影響

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)用于檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。李竹青等人研究發(fā)現(xiàn)長期攝食氧化酪蛋白會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激[9]。長期慢性的氧化應(yīng)激會(huì)損傷腦部，尤其是海馬等敏感部位，從而影響動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶[13]。

由圖1（a）可知，在定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠第1天的逃避潛伏期沒有顯著差異（p＞0.05），但是TOP1組（44.08±6.70）s和 TOP2組（46.86±7.15）s高于 Control組（41.40 ± 7.24）s。Control組、Tyr組和TOP2組大鼠從第2天開始，逃避潛伏期顯著低于第1天（p＜0.05），TOP1組從第3天開始潛伏期顯著低于第1天（p＜0.05）。第3天各組大鼠的逃避潛伏期都顯著低于第p天（p＜0.05），組間沒有顯著性差異 （p＜0.05），TOP1 組 （18.28 ± 3.16） s、TOP2 組（19.57±4.56）s高于 Control組（14.00±3.96）s和Tyr組（15.56±4.15）s。各組大鼠第4天的逃避潛伏期與第3天相比都沒有顯著性差異（p＞0.05），但是和第3天呈現(xiàn)相同的趨勢，TOP1組 （16.06±2.62）s、TOP2組 （17.44 ± 3.18）s高于 Control組（12.56± 2.12）s和 Tyr組（10.24± 2.89）s。 總體來看，經(jīng)過4 d的訓(xùn)練，各組大鼠潛伏期都隨著時(shí)間的延長顯著下降（p＜0.05）。從第1天到第3天，下降明顯，從3天到第4天，下降趨勢減緩。各組大鼠呈現(xiàn)相似的學(xué)習(xí)曲線，最終都能夠?qū)W會(huì)尋找逃生平臺，但是酪氨酸氧化產(chǎn)物組大鼠潛伏期略高于正常組大鼠，表明酪氨酸氧化產(chǎn)物可能在一定程度上損傷了其空間學(xué)習(xí)能力。

由圖1（b）可知，空間探索實(shí)驗(yàn)中，在原平臺象限的停留時(shí)間，TOP1組和TOP2組顯著低于Control組和 Tyr組（p＜0.05）。 Tyr組與 Control組、TOP1 組和TOP2組之間都沒有顯著性差異（p＞0.05）。如圖1（c）所示，統(tǒng)計(jì)大鼠在原平臺象限的游泳路程，TOP1組、TOP2 組顯著低于 Control組 m（p＜0.05），但是與Tyr組相比沒有顯著性差異 （p＞0.05）。Tyr組與Control組之間、TOP1組與TOP2組之間都沒有顯著性差異（p＞0.05）。 由圖 1（d）可知，各組大鼠進(jìn)入原平臺象限的次數(shù)呈現(xiàn)與停留時(shí)間相同的趨勢。結(jié)果顯示TOP1組和TOP2組大鼠不能準(zhǔn)確定位原平臺所在位置，表明酪氨酸氧化產(chǎn)物損害了大鼠的空間記憶能力。

2.2 酪氨酸氧化產(chǎn)物對大鼠海馬組織中氧化產(chǎn)物的影響

Dityr和3-NT是蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基氧化修飾的產(chǎn)物，它們能特異性的反映蛋白質(zhì)氧化程度[14]。Aβ的含量與Dityr相關(guān)。Dityr在Cu2+的作用下可以促進(jìn)Aβ的形成，而Aβ是阿爾茨海默病患者老年斑塊的主要成分，具有神經(jīng)毒性[15]。由圖2可知，飼喂酪氨酸氧化產(chǎn)物24周后，TOP1組和TOP2組大鼠海馬組織中蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物Dityr、3-NT含量顯著高于 Control組和 Tyr組（p＜0.05），并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。同時(shí)，TOP1組和TOP2組Aβ40含量也顯著高于 Control組和 Tyr組（p＜0.05）。

MDA和4-HNE是兩個(gè)強(qiáng)毒力的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，是判斷機(jī)體脂質(zhì)過氧化的常用指標(biāo)[16]。在組織中積累不僅會(huì)直接造成細(xì)胞損傷，還會(huì)通過與蛋白質(zhì)、酶等發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而進(jìn)一步影響組織正常生理功能。由圖3可知，酪氨酸氧化產(chǎn)物導(dǎo)致大鼠海馬組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物明顯積累。TOP1組和TOP2組的MDA、4-HNE含量都顯著高于Control組和Tyr組（p＜0.05），酪氨酸氧化產(chǎn)物對4-HNE含量的影響呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。

綜上，長期攝入酪氨酸氧化產(chǎn)物導(dǎo)致大鼠海馬組織氧化還原狀態(tài)失衡，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物積累，氧化產(chǎn)物的積累會(huì)損傷大鼠海馬組織細(xì)胞功能，從而導(dǎo)致其海馬依賴性空間學(xué)習(xí)記憶障礙。

圖2 酪氨酸氧化產(chǎn)物對大鼠海馬組織中蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物的影響（±s，n=10）Fig.2 Effects of tyrosine oxidation products on oxidative protein in rat hippocampus

圖3 酪氨酸氧化產(chǎn)物對大鼠海馬組織中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的影響（±s，n=10）Fig.3 Effects of tyrosine oxidation products on lipid peroxides in rat hippocampus

2.3 酪氨酸氧化產(chǎn)物對大鼠海馬組織抗氧化和炎癥相關(guān)基因的影響

由圖4可知，TOP1組和TOP2組大鼠海馬組織中Nrf2的表達(dá)較Control組和Tyr組顯著上調(diào) （p＜0.05）；TOP2組Nrf2的表達(dá)較TOP1組也顯著上調(diào)（p＜0.05）。Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子。正常生理?xiàng)l件下，Nrf2與Keap1結(jié)合存在于細(xì)胞核內(nèi)。當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2從Keap1上解離下來并與抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合，調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和II相解毒酶等的表達(dá)。Nrf2-ARE是體內(nèi)抗氧化重要的通路，該通路的激活能夠保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[17]。

圖4 酪氨酸氧化產(chǎn)物對大鼠海馬組織抗氧化和炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響（±s，n=10）Fig.4 Effcets of tyrosine oxidation products on expression of antioxidation and inflammation related genes in hippocmapus

此外，TOP1組和TOP2組海馬組織中 NF-κB的表達(dá)較 Control組和 Tyr組顯著上調(diào)（p＜0.05）；同時(shí)TOP2組的NF-κB表達(dá)較TOP1組也顯著上調(diào)（p＜0.05）。此外，TOP1組和 TOP2組的 iNOS表達(dá)也顯著高于 Control組和 Tyr組（p＜0.05），但 TOP1 組和TOP2組之間沒有顯著性差異（p＞0.05）。氧化應(yīng)激除了啟動(dòng)Nrf2防御機(jī)制外，還會(huì)激活NF-κB，活化的NF-κB能夠誘導(dǎo)促炎因子iNOS的過量表達(dá)，iNOS可以持續(xù)催化產(chǎn)生大量的一氧化氮 （NO），過量的NO不僅會(huì)造成蛋白質(zhì)硝基化，還會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[18]，從而造成大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙。

2.4 海馬組織基因表達(dá)與相應(yīng)氧化損傷指標(biāo)的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，MDA 與 Nrf2（r=0.796，p＜0.05）、NF-κB（r=0.884，p＜0.05）、iNOS（r=0.763，p＜0.05）成顯著正相關(guān)；HNE 與 Nrf2（r=0.709，p＜0.05）、NF-κB（r=0.862，p＜0.05）、iNOS（r=0.711，p＜0.05）成顯著正相關(guān)；Dityr與 Nrf2（r=0.854，p＜0.05）、NF-κB（r=0.878，p＜0.05）、iNOS（r=0.764，p＜0.05）成顯著正相關(guān)；3-NT 與 Nrf2（r=0.843，p＜0.05）、NF-κB（r=0.857，p＜0.05）、iNOS（r=0.764，p＜0.05）成顯著正相關(guān)；同時(shí)Aβ40 與 Dityr（r=0.694，p＜0.05）也呈現(xiàn)正相關(guān)。

3 討論

酪氨酸廣泛存在于富含蛋白質(zhì)的食品中，其酚羥基極易受到氧化，造成酪氨酸氧化產(chǎn)物在食品中積累，長期食入酪氨酸氧化產(chǎn)物會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體組織出現(xiàn)氧化應(yīng)激，氧化產(chǎn)物在組織細(xì)胞中積累。氧化應(yīng)激會(huì)造成機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)和酶等氧化修飾，蛋白質(zhì)氨基酸氧化修飾不僅影響組織細(xì)胞正常生理功能，還會(huì)產(chǎn)生很多有害物質(zhì)，例如色氨酸氧化形成的犬尿氨酸具有神經(jīng)毒性，會(huì)損傷小鼠新物體識別記憶并增加其焦慮情緒。而酪氨酸氧化生成雙酪氨酸和3-硝基酪氨酸。3-硝基酪氨酸會(huì)造成神經(jīng)元丟失，損傷多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)，它們都與阿爾茨海默病、帕金森病等多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。前期研究表明，長期攝食氧化酪蛋白會(huì)造成小鼠機(jī)體組織氧化應(yīng)激和學(xué)習(xí)記憶能力下降。長期攝入酪氨酸氧化產(chǎn)物（包括雙酪氨酸和3-硝基酪氨酸等）會(huì)造成大鼠肝腎和心肌組織出現(xiàn)氧化損傷。食入酪氨酸氧化產(chǎn)物是否會(huì)在腦組織中積累并影響腦部功能，尚不清楚。本文通過長期飼喂實(shí)驗(yàn)，初步探討了酪氨酸氧化產(chǎn)物對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶及海馬組織的影響。

酪氨酸氧化產(chǎn)物飼喂24周后，大鼠在Morris水迷宮空間的定位航行實(shí)驗(yàn)階段，尋找隱藏平臺的時(shí)間比正常組和Tyr組大鼠都要長，表明其空間學(xué)習(xí)能力可能受到一定程度的損傷。在空間探索實(shí)驗(yàn)階段，酪氨酸氧化產(chǎn)物組的大鼠穿越原平臺所在象限的次數(shù)及其在該象限的停留時(shí)間均顯著低于正常組大鼠，表明酪氨酸氧化產(chǎn)物損害了大鼠的空間記憶能力。同時(shí)酪氨酸氧化產(chǎn)物組大鼠海馬組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物及蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物均出現(xiàn)明顯積累，MDA、4-HNE、Dityr、3-NT、Aβ40 的含量均顯著高于Control組，表明酪氨酸氧化產(chǎn)物誘導(dǎo)大鼠海馬組織出現(xiàn)氧化應(yīng)激。由此推測酪氨酸氧化產(chǎn)物誘導(dǎo)海馬組織氧化應(yīng)激，造成氧化產(chǎn)物的積累可能是造成大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力減退的重要原因。本文進(jìn)一步檢測了抗氧化關(guān)鍵基因和炎癥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，酪氨酸氧化產(chǎn)物組大鼠海馬組織中 Nrf2、NF-κB和 iNOS的表達(dá)較Control組都顯著上調(diào)。Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，Nrf2的激活可以調(diào)控下游抗氧化基因和蛋白的表達(dá)，從而啟動(dòng)機(jī)體防御機(jī)制以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷。氧化應(yīng)激激活Nrf2的同時(shí)也激活了NF-κB，活化的NF-κB進(jìn)一步激活下游炎癥相關(guān)基因iNOS的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷或凋亡。酪氨酸氧化產(chǎn)物組大鼠出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶障礙表明機(jī)體自身的防御機(jī)制不足以抵抗酪氨酸氧化產(chǎn)物導(dǎo)致的氧化損傷。

4 結(jié)語

酪氨酸氧化產(chǎn)物的長期暴露誘導(dǎo)大鼠海馬組織氧化應(yīng)激、氧化產(chǎn)物在海馬組織中積累，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)與記憶能力障礙。本文只是初步探討了酪氨酸氧化產(chǎn)物對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響，但其具體的損傷機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。總之，食品中蛋白質(zhì)氨基酸的氧化修飾及其產(chǎn)物對人體健康的影響需要受到更多的關(guān)注，本文為改進(jìn)蛋白質(zhì)食品加工條件提供了一定的理論依據(jù)，對人們健康飲食具有一定的指導(dǎo)意義。