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    草魚腦細(xì)胞原代培養(yǎng)

    2019-04-25 04:45:28郭本月魏萬權(quán)袁小琛梁旭方
    漁業(yè)研究 2019年2期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)腦細(xì)胞原代

    周 怡,郭本月,魏萬權(quán),袁小琛,梁旭方

    (1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266000;2.青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司,山東 青島 266000;3.青島瑪斯特生物技術(shù)有限公司,山東 青島 266000;4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,湖北 武漢 430070)

    構(gòu)建細(xì)胞體外培養(yǎng)體系是魚類生理代謝機(jī)制研究的重要手段。與活體實(shí)驗(yàn)相比,采用魚類培養(yǎng)細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象不僅實(shí)驗(yàn)成本低,可以精確控制實(shí)驗(yàn)條件,重復(fù)性、均一性也較好,還可以同時(shí)提供大量生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象[1-2]。這些優(yōu)點(diǎn)使得魚類細(xì)胞在生物學(xué)研究領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用,已被應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、病毒學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、腫瘤學(xué)以及資源保護(hù)等方面[3-5]。因此,深入研究魚類細(xì)胞培養(yǎng),不僅能推動(dòng)魚類生理相關(guān)理論研究,在實(shí)際應(yīng)用方面也具有一定意義。

    神經(jīng)細(xì)胞系是開展神經(jīng)發(fā)育生物學(xué)及生理機(jī)制研究的重要工具。近期國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了多種魚類腦細(xì)胞的培養(yǎng)工作,包括卡特拉魚、羅非魚、海鱸魚、玳瑁石斑魚、青石斑魚以及斜帶石斑魚等[6-12]。研究者多采用離體腦細(xì)胞進(jìn)行病毒感染及污染物毒理學(xué)研究,其應(yīng)用遠(yuǎn)不及哺乳動(dòng)物廣泛。本研究參考其他魚類相關(guān)研究成果,初步探討了草魚腦細(xì)胞的原代培養(yǎng)技術(shù),以期為研究魚類腦部生理規(guī)律及其調(diào)控機(jī)制提供新的技術(shù)和思路。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    草魚購于湖北仙桃排湖漁場(chǎng),暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水系統(tǒng),選取健康且體表無損傷的個(gè)體,平均體重(187.50±8.42)g。

    1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

    L-15液體培養(yǎng)基、胰蛋白酶均為Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清(FBS)為Hyclone公司產(chǎn)品;CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay為Promega公司產(chǎn)品。青霉素、鏈霉素、兩性霉素分別配制成母液,經(jīng)0.22 μm濾過除菌,分裝,-20℃保存。PBS緩沖液:0.01M Na2HPO4、0.01M NaH2PO4、0.15M NaCl,pH 7.2,高壓滅菌,4℃保存。4.0%臺(tái)盼藍(lán)母液,用濾紙過濾,4℃保存,使用時(shí)用PBS將其濃度稀釋至0.4%。

    1.3 細(xì)胞原代培養(yǎng)

    實(shí)驗(yàn)草魚冰上麻醉,剪斷鰓部脈弓,放血約10 min,70%乙醇體表消毒。在無菌條件下,解剖取腦,以含有抗生素500 IU/mL青霉素和500 μg/mL鏈霉素及2.5 μg/mL兩性霉素的PBS緩沖液沖洗3次。分別采用不同方法嘗試進(jìn)行原代培養(yǎng):1)組織塊培養(yǎng)法,用眼科剪將組織剪碎成約1~2 mm3的小塊。用完全培養(yǎng)基(10 % FBS,青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL、兩性霉素2.5 μg/mL)浸潤(rùn)培養(yǎng)瓶,將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中,均勻排列,加入1 mL完全培養(yǎng)基,于28℃ CO2培養(yǎng)箱(SANYO,MCO-18AIC)中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的1~2 d內(nèi)避免移動(dòng)培養(yǎng)瓶,以便組織塊貼壁,在2~3 d吸出培養(yǎng)基,添加3 mL新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。2)消化法,用眼科剪將組織切成2~3 mm3小塊,以便于消化。0.25%胰蛋白酶酶解處理,期間輕輕搖動(dòng)數(shù)次。消化液混濁則吸出少許消化液于顯微鏡鏡檢,若組織已分散成單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)即終止消化。通過30 μm不銹鋼篩,濾掉尚未充分消化開的組織塊。600 rpm低速離心10 min收集細(xì)胞,完全培養(yǎng)基再懸浮,于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3)機(jī)械破碎法,在完全培養(yǎng)基浸潤(rùn)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,將腦組織置于200目滅菌尼龍網(wǎng)上,采用無菌注射器的橡膠推頭輕輕擠壓使腦組織通過網(wǎng)孔,得到細(xì)胞懸液,收集細(xì)胞懸液后通過 100目的尼龍網(wǎng)過濾,600 rpm低速離心 10 min 洗滌細(xì)胞一次,棄掉上清液后加入完全培養(yǎng)基重懸浮后,于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.4 細(xì)胞活力測(cè)定

    細(xì)胞活力測(cè)定采用CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒測(cè)定。采用如1.3中機(jī)械破碎法制備細(xì)胞懸液,取出20 μL細(xì)胞懸液,加入等體積的0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液,利用血球計(jì)數(shù)板快速估算細(xì)胞密度以及檢驗(yàn)細(xì)胞成活率[細(xì)胞成活率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100],當(dāng)細(xì)胞活力大于90%時(shí)可用。用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至2×106個(gè)/mL,細(xì)胞懸液分別接種到24孔及96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁穩(wěn)定,在培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后,分別計(jì)數(shù)其細(xì)胞數(shù)及測(cè)定其細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)開始時(shí),向培養(yǎng)板每孔中加入20 μL CellTiter 96?AQueous One Solution Reagent溶液,黑暗中孵育 4 h后終止培養(yǎng),490 nm波長(zhǎng)讀取吸光度值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 草魚腦細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

    本實(shí)驗(yàn)采用臺(tái)盼藍(lán)檢驗(yàn),死細(xì)胞被臺(tái)盼藍(lán)染色,顯微鏡下可見為淺藍(lán)色細(xì)胞,而活細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整使染料未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),顯微鏡下呈無色透明狀。顯微鏡觀察并計(jì)數(shù),采用機(jī)械法分離制備的草魚腦細(xì)胞的細(xì)胞成活率達(dá)到92.2%,表明細(xì)胞存活率較好。

    培養(yǎng)24 h后觀察到機(jī)械法培養(yǎng)腦細(xì)胞貼壁,呈不規(guī)則的多角形,貼壁的細(xì)胞多為上皮樣細(xì)胞形態(tài),并匯合形成單層細(xì)胞(圖1A)。組織塊法獲得的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后觀察也多呈多角形,細(xì)胞形態(tài)與機(jī)械法類似,但是細(xì)胞貼壁數(shù)量較機(jī)械法少(圖1B)。而消化法獲得的近乎圓形的細(xì)胞較多,少量不規(guī)則的多角形細(xì)胞(圖1C)。

    2.2 原代培養(yǎng)及細(xì)胞活力

    在5 d培養(yǎng)期內(nèi),細(xì)胞數(shù)量如表1所示,培養(yǎng)24 h細(xì)胞數(shù)目為2.53×106個(gè)/mL,而培養(yǎng)48~72 h細(xì)胞數(shù)目明顯增多,約為原來數(shù)量的2.6倍,但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng),細(xì)胞進(jìn)入衰退期,細(xì)胞數(shù)目減少至5.2×105個(gè)/mL。

    表1 不同培養(yǎng)時(shí)間草魚腦細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目(106個(gè)/mL)

    細(xì)胞活力隨培養(yǎng)時(shí)間的變化如圖2所示,草魚原代腦細(xì)胞的活力在前3 d培養(yǎng)期內(nèi)基本保持穩(wěn)定,第4天開始下降,第4、5天的細(xì)胞活力分別比第1天下降了11.7%和34.8%,說明3 d培養(yǎng)期是進(jìn)行原代草魚腦細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)比較合適的時(shí)間段。

    3 討論

    目前,魚類細(xì)胞作為研究工具頗受關(guān)注,已經(jīng)被應(yīng)用到魚類腫瘤學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、遺傳學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、生理學(xué)和資源保護(hù)等方面。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相比較,魚類細(xì)胞培養(yǎng)具有一定優(yōu)勢(shì):細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化程度高、均一性好;魚類離體培養(yǎng)細(xì)胞尤其是原代培養(yǎng)細(xì)胞,其生理生化功能接近在體狀態(tài),能夠快速獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果;而且可根據(jù)魚類生長(zhǎng)階段,進(jìn)行不同時(shí)期影響研究;可重復(fù)性高,離體條件下可以更為精確控制實(shí)驗(yàn)條件,有針對(duì)性地開展研究[1,3-4]。因此,本研究成功進(jìn)行了草魚腦細(xì)胞的原代培養(yǎng),為進(jìn)一步開展體外生理調(diào)控機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

    魚類種類、年齡以及不同組織器官的生理結(jié)構(gòu)不同,不同細(xì)胞內(nèi)環(huán)境也存在很大差異,因此,不同組織器官材料的取材方法、培養(yǎng)方式以及培養(yǎng)條件也因細(xì)胞而異[5]。本實(shí)驗(yàn)嘗試了不同的培養(yǎng)方法以獲得草魚原代腦細(xì)胞。組織塊固定法操作相對(duì)簡(jiǎn)單,但是獲得單層細(xì)胞時(shí)間較長(zhǎng),細(xì)胞得率較低。消化法細(xì)胞獲得量大,均一性較好,貼壁后可迅速形成單層細(xì)胞,但是要根據(jù)不同組織調(diào)整消化酶濃度以及消化時(shí)間,否則消化過度會(huì)損傷細(xì)胞。機(jī)械法操作同樣相對(duì)簡(jiǎn)便、快速,但對(duì)組織機(jī)械損傷較大,且細(xì)胞分散效果差于消化法,僅對(duì)纖維成分少的軟組織,如腦組織、胚胎組織較為適用[4]。本研究比較了以上三種培養(yǎng)方法,其中采用機(jī)械法獲得草魚原代腦細(xì)胞,細(xì)胞分散較為均勻、形態(tài)良好。

    影響細(xì)胞體外培養(yǎng)效果的因素包括血清濃度、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度等。不同研究在進(jìn)行不同物種的腦細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)所采用的體系不盡相同。血清濃度與培養(yǎng)基大多采用含有10%~20%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基[6-10];哺乳動(dòng)物多采用37℃作為培養(yǎng)溫度,而在魚類培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中采用的溫度因種類不同而有所差異,如培養(yǎng)青石斑魚28℃[6],斜帶石斑魚30℃/35℃[7],羅非魚腦細(xì)胞25℃[7],卡特拉魚腦細(xì)胞28℃[8],海鱸魚22℃[9],玳瑁石斑魚30℃[10]本研究用含有10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基在28℃進(jìn)行培養(yǎng),獲得了生長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定的腦細(xì)胞,可能是由于物種不同,細(xì)胞培養(yǎng)條件也存在一定的差異。魚類是變溫動(dòng)物,在一定的溫度范圍內(nèi)可以保持細(xì)胞功能和生理的完整性,對(duì)于魚類細(xì)胞培養(yǎng)溫度的選擇方面尚無定論。草魚最適生長(zhǎng)溫度為25~32℃,而在27~30℃時(shí)代謝最為活躍,細(xì)胞培養(yǎng)最佳溫度與其基本一致。

    細(xì)胞能夠在體外培養(yǎng)體系中保持活力,是進(jìn)行體外生理機(jī)制研究的基礎(chǔ)。本研究分離了草魚的原代腦細(xì)胞,而且可以獲得較高的細(xì)胞產(chǎn)率,從而可以滿足后續(xù)魚類腦部生理規(guī)律及其調(diào)控機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)的需要。并且本實(shí)驗(yàn)采用比色法檢測(cè)細(xì)胞活力,代謝活躍的細(xì)胞將新型四唑化合物MTS生物還原成一種有色甲臢產(chǎn)物。結(jié)果顯示,原代腦細(xì)胞的活力可以穩(wěn)定地保持3 d,超過3 d后,細(xì)胞明顯退化。因此在當(dāng)前培養(yǎng)條件下所制備的原代魚腦細(xì)胞可用于部分生理機(jī)制的離體分析。近年來,國內(nèi)外學(xué)者對(duì)魚類腦細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行了大量研究[6-11]。利用魚類原代腦細(xì)胞進(jìn)行離體測(cè)試已得到應(yīng)用,主要包括魚類病毒感染與細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)[2,6,10-11],以及持久性有機(jī)污染物的毒理學(xué)相關(guān)研究[12];但是持久細(xì)胞系隨著代數(shù)的增加,其細(xì)胞的基因型和表型都有可能發(fā)生改變,導(dǎo)致某些重要的生理功能和分化特征喪失,實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較差;而魚類細(xì)胞的原代培養(yǎng)是從活體動(dòng)物獲取組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng),細(xì)胞剛剛離體,生物性狀尚未發(fā)生很大變化,大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出原有組織的特性,在一定程度上更能反映體內(nèi)狀態(tài),測(cè)試的結(jié)果比較準(zhǔn)確,重復(fù)性好[13-14]。

    目前,魚類細(xì)胞培養(yǎng)已被應(yīng)用于魚類生理、毒理等分子機(jī)制研究,但是其應(yīng)用廣度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及其在哺乳動(dòng)物上的應(yīng)用。本研究進(jìn)行了草魚腦細(xì)胞原代培養(yǎng)的初步探索,后續(xù)需要開展進(jìn)一步的工作:完善細(xì)胞培養(yǎng)條件以建立持久細(xì)胞系;采用特定因子進(jìn)行細(xì)胞鑒定;利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)生理機(jī)制研究;開展離體實(shí)驗(yàn)與在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比,探討兩者區(qū)別與聯(lián)系,建立有效的評(píng)價(jià)指標(biāo),使離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果與在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)應(yīng),建立體外實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞模型。

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