鼻竇炎口服液對(duì)急性鼻-鼻竇炎大鼠Galectin-9及其受體Tim-3表達(dá)的影響

馬志躍（通訊作者） 李彬 馮勇 余曉旭 樊建剛 何剛

（四川省人民醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 四川 成都 610072）

急性鼻-鼻竇炎（acute rhinosinusitis，ARS）臨床表現(xiàn)為流膿涕、鼻塞、頭昏等，嚴(yán)重影響患者日常生活[1]。Galectin-9/Tim-3已被證實(shí)可調(diào)控炎癥反應(yīng)[2]，因此，分子水平探討Galectin-9、Tim-3與ARS發(fā)病關(guān)系，為預(yù)防和治療ARS具有重要臨床意義。鼻竇炎口服液已被證實(shí)對(duì)ARS具有有效性[3]。因此，本實(shí)驗(yàn)從鼻黏膜Galectin-9及其受體Tim-3為切入點(diǎn)，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察鼻竇炎口服液對(duì)ARS大鼠細(xì)胞因子及Galectin-9、Tim-3的影響，了解其對(duì)局部炎性病理改變的調(diào)節(jié)作用及機(jī)理，為臨床研究提供理論依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

24只健康SD大鼠，雌雄各半，200±10g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為空白組、模型組、鼻竇炎口服液組，每組8只，清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.2 大鼠ARS模型構(gòu)建

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，參考文獻(xiàn)[4]報(bào)道的方法造ARS模型：腹腔注射10%水合氯醛（4.5ml/kg）麻醉，整個(gè)過程保持無菌操作。在大鼠右側(cè)鼻腔用眼科鏡置入修剪好的醫(yī)用海綿，隨即滴入0.1ml金黃色葡萄球菌懸液于醫(yī)用海綿上，持續(xù)7d，造模后自由喂養(yǎng)，出現(xiàn)鼻塞、鼻腔可見黏膿性分泌物顯示造模成功。

1.3 藥物干預(yù)

大鼠造模成功后的第2天起開始給藥，鼻竇炎口服液（重慶桐君閣藥廠，批號(hào)：10090070）組以10ml/kg灌胃，空白組、模型組以5ml/kg無菌水灌胃，1次/d，連續(xù)7d。

1.4 樣本采集

末次給藥1h后，10%水合氯醛0.35g/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心取血清，4℃低溫保存，待檢測(cè)血清指標(biāo)；剝離雙側(cè)鼻中隔黏膜，每只大鼠組織樣本分成兩份，一份于4%多聚甲醛固定，用于后續(xù)組織病理檢測(cè)，另一份保存于-80℃，用于后續(xù)RT-PCR檢測(cè)。

1.5 檢測(cè)項(xiàng)目

將固定的鼻黏膜組織按常規(guī)方法制備石蠟切片，HE染色，鏡檢觀察病理組織學(xué)變化；ELISA試劑盒（上海茁彩）檢測(cè)大鼠血清IgE、IL-4、INF-γ含量；RT-PCR檢測(cè)鼻黏膜Galectin-9、Tim-3mRNA表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異采用單因素方差分析，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 病理組織觀察

空白組鼻黏膜無炎癥反應(yīng)，模型組可見鼻黏膜水腫、充血，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜上皮壞死，鼻竇炎口服液組可見輕度水腫，炎癥細(xì)胞明顯減少，圖1。

圖1 大鼠鼻黏膜病理組織學(xué)變化

2.2 大鼠血清IgE、IL-4、INF-γ含量

造模成功后，模型組小鼠血清IgE、IL-4含量較空白組均明顯增加，IFN-γ含量明顯降低（P＜0.01）。通過鼻竇炎口服液干預(yù)，IgE、IL-4含量較模型組明顯降低，IFN-γ含量明顯升高（P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠血清IgE、IL-4、INF-γ含量

2.3 大鼠鼻黏膜Galectin-9、Tim-3 mRNA表達(dá)

造模成功后，模型組較空白組鼻黏膜Galectin-9、Tim-3 mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。經(jīng)鼻竇炎口服液干預(yù)，Galectin-9、Tim-3 mRNA表達(dá)較模型組明顯降低（P＜0.01），見表2。

表2 各組大鼠鼻黏膜Galectin-9、Tim-3 mRNA水平

3.討論

ARS多由上呼吸道感染引起，嚴(yán)重者易造成鄰近組織、器官受累引發(fā)嚴(yán)重病變[1]。因此，尋找有效的治療方案極為重要。本實(shí)驗(yàn)采用鼻竇炎口服液治療ARS大鼠，病理組織考察結(jié)果表明，模型組鼻黏膜充血、黏膜上皮壞死，鼻竇炎口服液干預(yù)后炎癥細(xì)胞明顯減少，黏膜上皮輕度缺損，可明顯減輕鼻黏膜病理損傷。

目前Th1/Th2細(xì)胞失衡被認(rèn)為是發(fā)病核心，而INF-γ、IL-4分別是Th1、Th2的重要細(xì)胞因子。當(dāng)Th1反應(yīng)偏向Th2反應(yīng)，則致IL-4分泌增加，INF-γ分泌減少，而IL-4進(jìn)而上調(diào)免疫球蛋白（IgE），IgE是觸發(fā)呼吸道變應(yīng)性炎癥的關(guān)鍵因素[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組較空白組IgE、IL-4含量明顯増加，INF-γ明顯降低（P＜0.01），說明ARS發(fā)生了Th2的偏移。鼻竇炎口服液干預(yù)后IgE、IL-4含量較模型組明顯降低，INF-γ含量明顯增加（P＜0.01），說明鼻竇炎口服液能有效促進(jìn)形成新的Th1為主的平衡。

Galectin-9-Tim-3在炎癥調(diào)節(jié)中起重要作用。Galectin-9可誘導(dǎo)Th1極化并可阻止IgE抗原抗體復(fù)合物的形成。Tim-3可在活化的Thl細(xì)胞表面特異性表達(dá)，抑制Thl介導(dǎo)的細(xì)胞免疫[6]。同時(shí)，鼻黏膜局部Galectin-9、Tim-3表達(dá)與外周血IL-4、IFN-γ含量存在明顯相關(guān)性，Galectin-9通過與Tim-3結(jié)合可抑制Th1免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生，引起鼻腔黏膜水腫、鼻分泌物增加、上皮細(xì)胞損傷[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Galectin-9、Tim-3 mRNA表達(dá)模型組明顯高于空白組（P＜0.01），提示Galectin-9、Tim-3可能是導(dǎo)致鼻腔炎癥表現(xiàn)的因素之一。鼻竇炎口服液干預(yù)后Galectin-9、Tim-3 mRNA表達(dá)較模型組明顯降低（P＜0.01），說明鼻竇炎口服液可影響Galectin-9、Tim-3表達(dá)。

綜上所述，鼻竇炎口服液可有效抑制Galectin-9、Tim-3表達(dá)，平衡細(xì)胞因子，提示Galectin-9/Tim-3參與ARS發(fā)展過程，Galectin-9/Tim-3可作為治療ARS新的方向。