乙酰氨基葡萄糖合成關(guān)鍵酶氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的篩選及酶學(xué)性質(zhì)分析

徐小芳 ， 劉延峰 ， 李江華 *， 劉 龍 ， 堵國成 ， 陳 堅(jiān)

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

N-乙酰氨基葡萄糖 （N-acetylglucosamine，GlcNAc)是氨基葡萄糖（Glucosamine，GlcN)的 衍生物,具有重要的生理功能，在食品、醫(yī)藥及化妝品領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用[1]，如可以提高關(guān)節(jié)抗炎活性和蛋白活性[2]；食品方面的添加劑和抗氧化劑[3]；可作為天然的保鮮劑和抗菌劑廣泛應(yīng)用于食品保藏[4]；最近研究表明，GlcNAc能夠提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而起到延長(zhǎng)細(xì)胞壽命的作用[5]。

GlcNAc的生產(chǎn)方法可分為3種:甲殼素水解法、生物轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法[6-8]。發(fā)酵法生產(chǎn)GlcNAc利用的生產(chǎn)菌株主要有真菌和大腸桿菌（Escherichia.Coli，E.coli）[9-10]。目前本實(shí)驗(yàn)室采用枯草芽孢桿菌（Bacillus.subtilis，B.subtilis）發(fā)酵生產(chǎn)GlcNAc[8，11]，B.subtilis 已被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，其產(chǎn)品被認(rèn)定為是食品安全級(jí)[12]，且遺傳背景清晰、基因操作技術(shù)成熟、發(fā)酵工藝成熟并且不易被噬菌體污染，是生產(chǎn)GlcNAc的理想宿主[13]。

氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（glucosamine-6-phosphate N-acetyltransferase 1，Gna1，EC 2.3.1.4）作為合成GlcNAc代謝途徑上的關(guān)鍵酶是GCN5相關(guān)的GNAT蛋白質(zhì)超家族中的一員[14]，是一組參與相關(guān)天冬酰胺連接型（N-）聚糖合成與加工的重要酶類，能夠催化生成GlcNAc-6P，將Acetyl-CoA中的乙?；D(zhuǎn)移到GlcN-6P的氨基上[15-16]，生成的GlcNAc-6P進(jìn)一步在胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為GlcNAc并被轉(zhuǎn)移到胞外。目前GNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)在人類、酵母、人類、秀麗隱桿線蟲、煙曲霉及布氏椎蟲中有所報(bào)道[16-21]。許多物種包括白假絲酵母、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S.cerevisiae）、布氏椎蟲、小鼠等GNA缺失后，均引起致死表型[15，20-22]。然而前期研究GNA表達(dá)相關(guān)內(nèi)容僅集中于調(diào)控不同表達(dá)元件優(yōu)化GNA表達(dá)量，因此，找到一種能夠提高目標(biāo)產(chǎn)物GlcNAc產(chǎn)量氨基葡萄糖乙酰轉(zhuǎn)移酶并且對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)研究對(duì)提高發(fā)酵法生產(chǎn)GlcNAc具有重要意義。

本研究首先異源表達(dá)7種不同來源的GNA，篩選出秀麗隱桿線蟲來源的Cegna1能夠更有效的積累乙酰氨基葡萄糖。其次，考察了7株重組酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)Km與Kcat/Km發(fā)現(xiàn)重組Cegna1相比較其他6種重組酶均對(duì)GlcN-6P和Ac-CoA有較高的親和力和催化效率。最后發(fā)現(xiàn)底物GlcN-6P對(duì)重組Cegna1的抑制作用明顯，下一步可采用定向進(jìn)化策略改造Cegna1，解除底物GlcN-6P對(duì)重組Cegna1的抑制作用。本研究結(jié)果篩選到的Cegna1可用于GlcNAc合成途徑的優(yōu)化，同時(shí)為應(yīng)用定向進(jìn)化策略改造GNA提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 本文所用的菌株、質(zhì)粒及引物見表1和表2，出發(fā)菌株為重組BSGN6-PxylA-glmS，為本實(shí)驗(yàn)室所改造[11]，出發(fā)菌株在野生型菌株B.subtilis 168基礎(chǔ)上進(jìn)行改造得到。質(zhì)粒pP43NMK由張曉舟博士惠贈(zèng) （美國弗吉尼亞理工大學(xué)，生物系統(tǒng)工程學(xué)院）。表達(dá)氨基葡萄糖乙?；?種不同來源基因Cegna1（Caenorhabditis elegans，NCBIGenBank:AB017628.1）、Tbgna1 （Trypanosoma brucei，NCBI GenBank:FR715998.1）、Scgna1 （S.cerevisiae，NCBI GenBank:NM_001179949.1）、Cagna1（Candida albicans，NCBI GenBank:XM_715990.1）、Afgna1（Aspergillusfumigatus Af293 ，NCBI GenBank:XM_742738.1）、Dfgna1（Dictyostelium fasciculatum，NCBI GenBank:XM_004367264.1）、Osgna1（Oryza sativa，NCBI GenBank:AY772189.1）進(jìn)行枯草密碼子優(yōu)化后借由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，見表3。

表1 本論文中使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this chapter

表2 本研究所使用的引物Table 2 Oligonucleotides used in this study

表3 氨基葡萄糖乙?；?種不同來源基因經(jīng)枯草密碼子優(yōu)化優(yōu)化后序列總表Table 3 Sequence table of glucosamine acetylase with 7 different source genes after codon optimization

續(xù)表3

1.1.2 試劑 常用試劑及試劑盒，均購于TaKaRa生物工程有限公司；玉米漿和酵母粉，分別購自山東西王食品和上海一品鮮生物科技有限公司?；蚺c引物合成、DNA測(cè)序等，由上海生工生物工程有限公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件 發(fā)酵培養(yǎng)基成分為（g/L）:玉米漿干粉 20，酵母粉 20，K2HPO4·3H2O 12.5，KH2PO42.5，CaCO35，微量元素 15 ml/L；pH7.5；微量元素溶液按 g/L 計(jì)含有:MnSO4·5H2O 1.0，CoCl2·6H2O 0.4，NaMoO4·2H2O 0.2，ZnSO4·7H2O 0.2，AlCl3·6H2O 0.1，CuCl2·H2O 0.1，H3BO40.05，含 5 mol/L HCl。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株構(gòu)建 分別使用相對(duì)引物擴(kuò)增由上海生工生物工程有限公司合成的目的基因（如使用引物CeGna1-F和 CeGna1-R擴(kuò)增出CeGna1基因）獲得相應(yīng)的目的片段，分別插入pP43NMK質(zhì)粒中，獲得重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒在Escherichia.coli JM109中擴(kuò)增后轉(zhuǎn)入目的菌株BSGN6-PxylA-glmS，獲得重組菌株。通過菌落PCR驗(yàn)證篩選出陽性菌株，挑選的陽性菌株在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，最后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證及測(cè)序鑒定。

1.2.2 3 L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵 將種子液以體積分?jǐn)?shù)4%的接種量轉(zhuǎn)接至裝液量為1.5 L的3 L發(fā)酵罐中，通氣量為1.5 vvm在37℃條件下培養(yǎng)，pH使用體積分?jǐn)?shù)25%氨水和3 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)維持在7.4，發(fā)酵罐初始的攪拌轉(zhuǎn)速為600 r/min，使用木糖其終質(zhì)量濃度為5 g/L進(jìn)行誘導(dǎo)在菌體OD600達(dá)到0.4時(shí)。培養(yǎng)基中含20 μg/mLKana，葡萄糖初質(zhì)量濃度為20 g/L，葡萄糖發(fā)酵后8 h后開始流加，其質(zhì)量濃度控制在5 g/L，每隔4 h取樣分析。

1.2.3 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，具體步驟詳見蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書。

1.2.4 乙酰氨基葡萄糖HPLC測(cè)定方法 GlcNAc通過高效液相色譜法測(cè)定。高效液相色譜條件:檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器（RID）；色譜柱為Aminex?HPX-87H，300 mm×7.8 mm 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為35℃；流動(dòng)相為5 mmol/L硫酸；流速為0.6 mL/min；進(jìn)樣體積為10μL。樣品處理方法:發(fā)酵液經(jīng)12000 r/min離心4 min后，取適量上清液用超純水稀釋一定倍數(shù)，再將該樣品稀釋液用0.22 μm濾膜過濾。

1.2.5 重組氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的分離與純化 將重組菌株的單菌落分別接種于含相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)到OD600值為0.6，加入木糖（終質(zhì)量濃度5 g/L）誘導(dǎo)后培養(yǎng)4 h。菌液在4℃ 下8 000 r/min離心后棄上清液，沉淀用100 mmol/L PBS（pH 7.5）洗滌3次，經(jīng)750 W超聲破碎 （工作強(qiáng)度60%）后離心收集上清液。

鎳柱純化操作方法:采用AKTA蛋白純化儀，先用緩沖液 A （pH 7.4，20 mmol/L PBS，20 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl）平衡鎳柱，然后以1 mL/min流速進(jìn)行上樣；再用緩沖液A以1mL/min流速?zèng)_洗掉鎳柱中沒有結(jié)合蛋白質(zhì)；最后，用緩沖液B（pH 7.4，20 mmol/L PBS，500 mmol/L 咪唑，500 mmol/L NaCl）以流速為1 mL/min進(jìn)行梯度洗脫。純化后通過酶活測(cè)定和SDS-PAGE鑒定重組目的蛋白質(zhì)；純化后的目的蛋白質(zhì)用透析袋在20 mmol/L PBS（pH 7.4）中透析過夜，純化后的重組酶保存于-80℃冰箱。

步入21世紀(jì)的中國，面臨新的發(fā)展機(jī)遇和挑戰(zhàn)。這十年是極不平凡的十年：戰(zhàn)勝了2003年非典、2008年汶川地震等自然災(zāi)害等，經(jīng)受了2008年金融危機(jī)考驗(yàn)，舉辦了第29屆奧運(yùn)會(huì)、第41屆世博會(huì)。這十年也是中國成長(zhǎng)的十年，一次次的經(jīng)歷增強(qiáng)了中華民族的凝聚力，同時(shí)也提升了中國的國際影響力。這期間黨中央召開了十六大、十七大，更加堅(jiān)定了改革開放的步伐。黨的十六大向世人昭示了新世紀(jì)的中國舉什么旗、走什么路、實(shí)現(xiàn)什么樣的目標(biāo)等重大問題，并圍繞這些問題做了全方位的部署，大踏步向全面建成小康社會(huì)的目標(biāo)邁進(jìn)。黨的十七大總結(jié)了改革開放的歷史進(jìn)程和經(jīng)驗(yàn)，對(duì)深入貫徹科學(xué)發(fā)展觀提出明確要求，將改革開放不斷深入推進(jìn)。

1.2.6 酶活測(cè)定 乙酰氨基葡萄糖合成酶酶活的檢測(cè)具體方法如下[15]:50 μL反應(yīng)體系包含50 mmol/L Tris-HCl （pH 7.5）， 200 μmol/L GlcN-6-P，5 mmol/L MgCl2， 體積分?jǐn)?shù) 10%甘油，200 μmol/L Ac-CoA 和10 μL樣品 30°C反應(yīng) 10 min后加入50 μL終止溶液，包括50mmol/LTris-HCl（pH7.5）及 6.4 mol/L鹽酸胍；最后加入50 μL測(cè)量溶液，包括50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），1 mmol/L EDTA 以及 5，5-二硫代雙-2-硝基苯甲酸，產(chǎn)物可通過412 nm下的吸光度進(jìn)行檢測(cè)，從而計(jì)算乙酰氨基葡萄糖合成酶酶活。

氨基葡萄糖乙酰化酶酶活單位的定義為:在30℃下，每分鐘催化合成1 μmol乙酰氨基葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位，酶活單位為U/mL或U/mg。

1.2.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析方法 菌體比生長(zhǎng)速率（specific growth rate）通過Origin軟件模擬獲得；底物GlcN-6P對(duì)重組酶Cegna1的抑制曲線由軟件Graph Pad模擬獲得，并得到抑制常數(shù)Ki；重組酶的米氏常數(shù)Km和催化常數(shù)Kcat的值通過Graph Pad模擬獲得。

酶雙底物反應(yīng)機(jī)制分析方法:分別固定某一底物幾個(gè)不同濃度（底物濃度不飽和），研究每個(gè)不同濃度下另一種底物對(duì)合成GlcNAc-6P含量的影響。如分別固定 Acetyl-CoA底物濃度為 50、100、500 mmol/L，測(cè)定這3個(gè)濃度下GlcN-6P底物濃度對(duì)合成GlcNAc-6P的影響。如果分別得到3條平行線則為乒乓反應(yīng)機(jī)制，如果3條直線相交于一點(diǎn)，則為序列機(jī)制。所有數(shù)據(jù)由3次平行實(shí)驗(yàn)獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)不同來源GNA對(duì)B.subtilis重組菌生產(chǎn)GlcNAc的影響

參照1.2.1步驟，獲得重組質(zhì)粒pP43-CeGna1、pP43-CaGna1、pP43-ScGna1、pP43-DfGna1、pP43-AfGna1、pP43-OsGna1、pP43-TbGna1。 重組質(zhì)粒在E.coli JM109中擴(kuò)增后轉(zhuǎn)入出發(fā)菌株BSGN6-PxylA-glmS， 獲得重組菌株 CeBSGN、CaBSGN、ScBSGN、DfBSGN、AfBSGN、OsBSGN和TbBSGN。如表1所示，上述菌株分別表達(dá)來源于Caenorhabditis elegans、Candida albicans 、S.cerevisiae、Dictyostelium fasciculatum、AspergillusfumigatusAf293、Oryzasativa、Trypanosoma brucei。

將7株重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，并檢測(cè)GlcNAc的產(chǎn)量，搖瓶發(fā)酵48 h，各重組菌株發(fā)酵產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的情況如圖1所示。重組菌株CeBSGN中GlcNAc 的 產(chǎn) 量 比 CaBSGN、ScBSGN、DfBSGN、AfBSGN、OsBSGN和 TbBSGN，分別高 26.23%、25.43%、53.32%、83.37%、110.39%、92.19%。 綜上所述，重組菌CeBSGN6對(duì)目的產(chǎn)物GlcNAc的合成效果最佳。重組菌株CeBSGN中GlcNAc的產(chǎn)量最高，達(dá)到7.31 g/L。

圖1 不同重組菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)GlcNAc產(chǎn)量比較Fig.1 Comparison of different recombinant strains for GlcNAc shaking flask fermentation production

將7株重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，每4 h取一次樣并檢測(cè)殘?zhí)琴|(zhì)量濃度，搖瓶發(fā)酵48 h，各重組菌株發(fā)酵殘?zhí)乔闆r如圖2所示。搖瓶發(fā)酵初始葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L，在整個(gè)發(fā)酵過程中，葡萄糖被迅速消耗，重組7株菌株均在16 h左右將葡萄糖耗光，平均耗糖速率為1.25 g/L。從圖2中可以發(fā)現(xiàn)7株重組菌株在對(duì)碳源葡萄糖的消耗上情況較為一致。

圖2 不同重組菌株葡萄糖消耗情況比較Fig.2 Comparison of different recombinant strains for glucose consumption

7株重組菌搖瓶發(fā)酵細(xì)胞生長(zhǎng)情況如圖3所示。從圖3（a）中可以看出，在整個(gè)發(fā)酵過程中，重組7株菌株細(xì)胞干重在0～16 h增長(zhǎng)趨勢(shì)較快，16 h后隨著葡萄糖的耗盡，細(xì)胞干重開始下降。7株重組菌株細(xì)胞干重均在16 h左右達(dá)到最大值。經(jīng)計(jì)算，7株重組菌株中CeBSGN目標(biāo)產(chǎn)物GlcNAc對(duì)細(xì)胞得率（YGlcNAc/X）最高，最大值為 1.12。

圖3 不同重組菌株細(xì)胞生長(zhǎng)情況和比生長(zhǎng)速率Fig.3 Cell growth and specific growth rate for different recombinant strains

7株重組菌株在對(duì)碳源葡萄糖的消耗上情況較為一致，雖然重組菌株CeBSGN相比較6株菌株，發(fā)酵生產(chǎn)CeBSGN的產(chǎn)量最大，產(chǎn)物GlcNAc對(duì)細(xì)胞得率最高，但是從圖3（b）中可發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期菌株CeBSGN的比生長(zhǎng)速率相比較卻低于其他6種重組菌株。很多微生物的目標(biāo)代謝產(chǎn)物一般都是在進(jìn)入穩(wěn)定期后才開始大量的合成與分泌，比生長(zhǎng)速率與微生物的生命活動(dòng)有關(guān)，如果菌體在對(duì)數(shù)期比生長(zhǎng)速率過大，菌體量增加過多，代謝向菌體合成的方向發(fā)展，反而不利于目的產(chǎn)物的累積[23]。由此可以推斷，在相同碳源利用率的情況下，重組菌株CeBSGN比生長(zhǎng)速率相對(duì)較小，目標(biāo)產(chǎn)物GlcNAc對(duì)細(xì)胞得率較高，代謝更易于向目標(biāo)產(chǎn)物GlcNAc合成的方向發(fā)展，從而更有利于產(chǎn)物的合成。

表4 7株重組菌株生產(chǎn)GlcNAc的搖瓶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較Table 4 Comparison of GlcNAc shaking flask fermentation parameters on seven recombinant strains

進(jìn)一步對(duì)7株重組菌株的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表4所示，重組菌株CeBSGN的葡萄糖最高產(chǎn)量出現(xiàn)在45 h左右，最高產(chǎn)量為19.43 g/L，重組菌株CeBSGN6乙酰氨基葡萄糖最高產(chǎn)量出現(xiàn)在35 h，最高產(chǎn)量為24.23 g/L，較對(duì)照菌株提高了24.69%。GlcNAc生產(chǎn)強(qiáng)度和GlcNAc對(duì)細(xì)胞得率均高于其他6株菌株；但是對(duì)比細(xì)胞生產(chǎn)強(qiáng)度，重組菌株CeBSGN卻低于其他菌株。上述數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步驗(yàn)證了重組菌株CeBSGN葡萄糖的消耗較其他六株重組菌株更多的用于產(chǎn)物GlcNAc的合成而非菌體量的增加，再一次驗(yàn)證了重組菌CeBSGN6能夠更好地合成目的產(chǎn)物GlcNAc。

在搖瓶上進(jìn)行初步篩選，獲得重組菌株CeBSGN最高GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到7.31 g/L，為進(jìn)一步驗(yàn)證GlcNAc的產(chǎn)量，將重組菌株CeBSGN和對(duì)照菌株ScBSGN在3 L罐進(jìn)行上補(bǔ)料分批發(fā)酵，發(fā)酵過程曲線如圖4所示。對(duì)照菌株ScBSGN6乙酰氨基

圖4CeBSGN6和ScBSGN6 3 L罐GlcNAc產(chǎn)量比較Fig.4 Comparison of CeBSGN and ScBSGN for GlcNAc production in 3 L fermentor

在維持葡萄糖質(zhì)量濃度為5 g/L不變的情況下進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，重組菌株CeBSGN和對(duì)照菌株ScBSGN發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表5所示，重組菌株CeBSGN的細(xì)胞生產(chǎn)強(qiáng)度是對(duì)照菌株ScBSGN的3.82倍、GlcNAc生產(chǎn)強(qiáng)度是對(duì)照菌株ScBSGN的1.69倍、GlcNAc對(duì)細(xì)胞得率是對(duì)照菌株ScBSGN的2.53倍。綜上所述，表達(dá)了重組酶Cegna1的重組菌株CeBSGN能夠更好的利用葡萄糖合成目的產(chǎn)物GlcNAc。

參數(shù) 表5 7株重菌株組菌株CeBSGN6和ScBSGN6生產(chǎn)GlcNAc的上罐發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較Table 5 Comparison of GlcNAc shaking flask fermentation parameters on recombinant CeBSGN and ScBSGN

2.2 重組氨基葡萄糖乙酰轉(zhuǎn)移酶的分離純化及動(dòng)力學(xué)分析

按1.2.4的方法對(duì)重組氨基葡萄糖乙酰轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行分離與純化，將純化后的蛋白按1.2.5的方法進(jìn)行酶活測(cè)定，情況如圖5，重組菌株菌株CeBSGN的 Cegna1比酶活為 208.33 U/mg，比 CaBSGN、ScBSGN、Df BSGN、AfBSGN、OsBSGN、TbBSGN 分別高了 31.56%、28.29%、137.68%、198.08%、338.87%、344.20%。綜上，重組菌CeBSGN6中的重組酶Cegna1的催化效率最佳。

重組氨基葡萄糖乙酰轉(zhuǎn)移酶具體動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表6所示，Cegna1米氏常數(shù)Km相對(duì)小于其他6株重組菌株，而對(duì)應(yīng)的催化效率Kcat/Km卻相對(duì)高于其他6株菌株。Helge C.Dorfmueller等人[17]已解析Cegna1的晶體結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)Cegna1的空間位阻較小，底物更容易和酶的催化活性中心結(jié)合，并且2個(gè)底物GlcN-6P和Ac-CoA與活性中心形成多個(gè)氫鍵，更容易結(jié)合到活性中心。因此，重組Cegna1相比較其他六種重組酶均對(duì)GlcN-6P和Ac-CoA有較高的親和力和催化效率。

圖5 重組菌株GNA比酶活對(duì)比Fig.5 Comparison of recombinant strains GNA enzyme activity

對(duì)7株表達(dá)不同來源GNA的B.subtilis重組菌株進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)表達(dá)了重組酶Cegna1的重組菌株CeBSGN能夠更好的利用葡萄糖合成目的產(chǎn)物GlcNAc，并且重組Cegna1相比較其他6種重組酶對(duì)GlcN-6P和Ac-CoA有較高的親和力和催化效率。因此，我們對(duì)篩選出的重組酶Cegna1進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，以便為應(yīng)用定向進(jìn)化策略改造GNA的實(shí)現(xiàn)提供了理論依據(jù)。

表6 重組菌株GNA動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 6 Kinetic parameters of recombinant strains GNA

2.3 重組Cegna1酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 重組Cegna1最適反應(yīng)時(shí)間 50 mmol/L Tris緩沖液（pH 7.5）中，測(cè)定Cegna1在酶活反應(yīng)0~10 min之間催化酶活力，以反應(yīng)時(shí)間為5 min時(shí)的酶活力為相對(duì)酶活100%。由圖6可知，在反應(yīng)0～2 min，酶活隨時(shí)間延長(zhǎng)而迅速升高，在5～6 min，Cegna1催化效率最大，相對(duì)酶活可達(dá)到103%，在6～10 min，催化效率略有下降，基本能保持穩(wěn)定。

圖6 重組Cegna1酶活隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.6 Influence of reaction time on enzyme activities of recombinant Cegna1

2.3.2 重組Cegna1最適反應(yīng)溫度 50 mmol/L Tris緩沖液（pH 7.5）中，測(cè)定Cegna1在10~90℃之間催化酶活力，以初始溫度30℃時(shí)的酶活力為相對(duì)酶活100%。從圖7可得:當(dāng)溫度低于37℃時(shí)，催化效率隨溫度的升高而快速增加；當(dāng)反應(yīng)溫度為37℃時(shí)，催化效率最大；當(dāng)溫度在37～50℃時(shí)，催化效率迅速降低；當(dāng)反應(yīng)溫度在50～90℃時(shí)，酶活基本維持在65%。

圖7 重組Cegna1酶活隨反應(yīng)溫度的變化Fig.7 Influence of reaction temperature on enzyme activities of recombinant Cegna1

2.3.3 重組Cegna1最適反應(yīng)PH 以不同pH的緩沖液 （pH 3～10，50 mmol/L Tris緩沖液）稀釋Cegna1酶液與底物至設(shè)定 pH，測(cè)定Cegna1催化活力，以初始PH 7.5時(shí)的酶活力為相對(duì)酶活100%。由圖8可知，在PH值3～10的范圍內(nèi)，重組Cegna1均能保持75%以上的活性，具有較寬的PH適應(yīng)范圍，最適反應(yīng)PH為7。在酸性條件下，催化效率隨著PH值下降而迅速降低；在堿性條件下，催化效率隨PH值升高而下降較緩，PH為10時(shí)，仍保留著較高酶活，表明重組Cegna1相對(duì)酸性環(huán)境在堿性環(huán)境中更加穩(wěn)定。

圖8 重組Cegna1酶活隨反應(yīng)PH的變化Fig.8 Influence of reaction PH on enzyme activities of recombinant Cegna1

2.3.4 重組Cegna1熱穩(wěn)定性分析 將酶液在不同溫度下保溫不同時(shí)間，迅速冷卻，pH 7.5，30℃測(cè)定殘余Cegna1酶活，以未保溫的酶活力為相對(duì)酶活100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。由圖9可知，在4℃和30℃條件下Cegna1具有最大的催化活性，低溫下仍能保持較高酶活熱穩(wěn)定均沒有什么明顯變化；當(dāng)溫度超過30℃時(shí)，催化效率隨溫度的升高而迅速降低。40℃，100 min內(nèi)Cegna1能保持 80%以上的活性，而在 60℃條件下，100 min內(nèi) Cegna1仍能保持45%以上的酶活。

圖9 重組Cegna1熱穩(wěn)定性Fig.9 thermostability on enzyme activities of recombinant Cegna1

2.3.5 Cegna1的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究 為了研究重組Cegna1的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，分別以Acetyl-CoA和GlcN-6P為底物，固定一種底物濃度（如Acetyl-CoA）的情況下研究不同濃度的另一種底物（如GlcN-6P）對(duì)GlcNAc合成的影響。通過不同底物濃度測(cè)定重組Cegna1的酶活，最終獲得Lineweaver-Burk雙倒數(shù)（圖10所示）。從圖中可以看出，固定不同濃度的一種底物的情況下，不同濃度的另一底物的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的GlcNAc合成速率倒數(shù)為縱坐標(biāo)，擬合得到的直線相交于一點(diǎn)，進(jìn)一步進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，發(fā)現(xiàn)其符合序列機(jī)制的底物動(dòng)力學(xué)方程1，雙底物反應(yīng)機(jī)制為序列反應(yīng)。

圖10 重組Cegna1催化生產(chǎn)GlcNAc-6P的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.10 Lineweaver-Burk plots of the GlcNAc-6P biosynthesis by the recombinant Cegna1

2.3.6 底物與產(chǎn)物對(duì)重組Cegna1抑制分析 為了研究底物Acetyl-CoA和 GlcN-6P與產(chǎn)物GlcNAc對(duì)的抑制情況，固定Acetyl-CoA和GlcN-6P底物濃度為200 μmol/L，分別向反應(yīng)體系中加入0～60 mmol/L的添加物Acetyl-CoA、GlcN-6P和GlcNAc，結(jié)果如圖 11所示。 由圖11（a）可得，GlcNAc和Acetyl-CoA對(duì)重組Cegna1無明顯抑制作用；由圖11（b）可得，底物GlcN-6P對(duì)重組Cegna1的抑制作用明顯，5 mmol/L GlcN-6P已可對(duì)重組Cegna1的造成明顯抑制作用，采用GraphPad Prism計(jì)算抑制常數(shù)Ki值，求得重組Cegna1 對(duì) GlcN-6P 的 Ki值為（1.880±0.472） mmol/L，下一步可采用定向進(jìn)化策略改造Cegna1，解除底物GlcN-6P對(duì)重組Cegna1的抑制作用。

圖 11 GlcNAc、Acetyl-CoA(a)及 GlcN-6P (b)對(duì)重組Cegna1的抑制情況Fig.11 Inhibition of Cegna1 activity with increasing concentrations of GlcNAc,Acetyl-CoA （a）and GlcN-6P（b）.

3 結(jié) 語

本文通過在枯草芽孢桿菌中異源表達(dá)7種不同來源的氨基葡萄糖乙?；?，篩選出秀麗隱桿線蟲來源的氨基葡萄糖乙?；福–egna1）能夠更有效的積累乙酰氨基葡萄糖搖瓶水平上產(chǎn)量達(dá)到7.31 g/L，相較于過量表達(dá)來源于釀酒酵母的氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因的對(duì)照菌株，GlcNAc的產(chǎn)量提高了24.51%。在3 L發(fā)酵罐中，GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到24.23 g/L，相較于對(duì)照菌株GlcNAc的產(chǎn)量提高了24.69%。進(jìn)一步研究7株重組酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)Km與 Kcat/Km發(fā)現(xiàn)重組Cegna1相比較其他6種重組酶均對(duì)GlcN-6P和Ac-CoA有較高的親和力和催化效率。對(duì)篩選出的重組Cegna1酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)重組Cegna1最適反應(yīng)時(shí)間為5～6 min,最適反應(yīng)溫度為37℃，最適反應(yīng)PH為7，熱穩(wěn)定性良好，雙底物反應(yīng)機(jī)制為序列反應(yīng)。最后發(fā)現(xiàn)底物GlcN-6P對(duì)重組Cegna1的抑制作用明顯，下一步可采用定向進(jìn)化策略改造Cegna1，解除底物GlcN-6P對(duì)重組Cegna1的抑制作用。