釀酒酵母孢子作為GLP-1載體的研究

黃丹娣， 張慧杰， 閆 聽(tīng)， 馮詩(shī)倪， 中西秀樹(shù)， 高曉冬

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

糖尿病是目前危害人類(lèi)健康的主要疾病之一，它是一種有遺傳傾向的內(nèi)分泌代謝疾病，以高血糖和高血糖繼發(fā)的脂肪、蛋白質(zhì)、水、電解質(zhì)紊亂為特征。最新數(shù)據(jù)顯示糖尿病患者的人數(shù)將在2030年上升到3.6億[1]。而在我國(guó)，近年來(lái)隨著人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率迅速提高，患病人數(shù)已經(jīng)超過(guò)了1億人，其中，絕大多數(shù)為二型糖尿病患者。糖尿病可引起包括心腦血管疾病在內(nèi)的多種并發(fā)癥，因此，糖尿病的防治已成為人們最為關(guān)注的熱點(diǎn)之一。

二型糖尿病又被稱(chēng)為非胰島素依賴(lài)糖尿病，患者本身仍產(chǎn)生胰島素，然而由于胰島β細(xì)胞功能低下和胰島素抵抗，患者對(duì)胰島素的利用卻大打折扣[2]。目前，二型糖尿病患者的治療手段主要包括使用胰島素和降糖藥物等。雖然這些藥物能夠有效降低血糖，但是也存在一些問(wèn)題，例如會(huì)導(dǎo)致患者低血糖以及體重的增加等。此外，這些藥物只能延緩病情，無(wú)法恢復(fù)胰島β細(xì)胞功能，從而無(wú)法從根本上使病情得到控制。因此，開(kāi)發(fā)安全有效的糖尿病治療藥物，已成為現(xiàn)代科學(xué)家的研究熱點(diǎn)[3]。

胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1，GLP-1)含有37個(gè)氨基酸，是已發(fā)現(xiàn)的促胰島素分泌作用最強(qiáng)的腸肽類(lèi)激素。GLP-1的生物活性形式有2種，分別為GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺。GLP-1可以從多個(gè)方面發(fā)揮作用，如抑制胃排空，抑制胰高血糖素的分泌，降低血糖等[4]，并且能夠恢復(fù)胰島β細(xì)胞功能。更為重要的是，GLP-1的作用具有葡萄糖濃度依賴(lài)性，僅在葡萄糖濃度較高時(shí)才發(fā)揮作用，因此不會(huì)導(dǎo)致由于使用過(guò)度而導(dǎo)致的低血糖問(wèn)題。GLP-1已成為未來(lái)治療二型糖尿病的安全有效的多肽藥物[5]。然而天然的GLP-1（7-36）容易被二肽基肽酶（DPP-IV）降解為無(wú)活性的GLP-1（9-36），且由于其相對(duì)分子質(zhì)量較小從而易被腎清除，因此導(dǎo)致GLP-1在人體內(nèi)半衰期不足2 min，這大大限制了其臨床應(yīng)用。因此，科學(xué)家正致力于研究如何延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期從而提高其生理活性。目前的研究主要集中在以下幾個(gè)方面:篩選GLP-1類(lèi)似物，例如艾塞那肽，利拉魯肽[6]；對(duì)天然GLP-1進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，如GLP-1的N端修飾、脂肪酸修飾GLP-1等[7]；將GLP-1與生物大分子蛋白偶聯(lián)，如人清蛋白[8]，IgG重鏈結(jié)合蛋白IgG-Fc[9]等，以及將GLP-1串聯(lián)表達(dá)等，均取得了一定的效果。此外，傳統(tǒng)的多肽類(lèi)藥物以及胰島素需要注射使用，這讓病人痛苦不堪。研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1可以以活性形式被腸道直接吸收進(jìn)入血液，通過(guò)血液循環(huán)直接與胰島細(xì)胞表面的GLP-1受體結(jié)合并最終促進(jìn)胰島素的釋放[10]。因此，若能夠通過(guò)一些方法延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期，提高其利用率，并選擇合適的載體構(gòu)建口服GLP-1藥物，將為有效治療糖尿病提供更有力的方法，并具有巨大的科學(xué)意義和市場(chǎng)潛力[11]。

釀酒酵母是單細(xì)胞真核生物，其完整的基因組在1996年便已完成測(cè)序。釀酒酵母培養(yǎng)簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)迅速，且易于進(jìn)行基因改造，被最早應(yīng)用于酵母基因克隆和表達(dá)宿主菌及人源化蛋白[12]。釀酒酵母的細(xì)胞有2種生活形態(tài)，單倍體和二倍體。二倍體細(xì)胞可在營(yíng)養(yǎng)匱乏的條件下減數(shù)分裂生成孢子，一個(gè)母細(xì)胞可分裂成4個(gè)孢子。釀酒酵母孢子易于獲得，安全無(wú)毒，可以食用。釀酒酵母的孢子壁與母細(xì)胞相比有明顯的不同。如圖1所示，成熟的孢子壁從內(nèi)到外分別是甘露糖層、β-葡聚糖層、殼聚糖層和二酪氨酸層。而釀酒酵母從內(nèi)到外僅有β-葡聚糖層、甘露糖層。孢子特有的二酪氨酸層具有保護(hù)孢子抵御外界環(huán)境壓力的能力。因此，在口服過(guò)程中，孢子壁可以保護(hù)孢內(nèi)表達(dá)的外源蛋白抵抗一定的蛋白酶降解及胃酸低pH的影響。

圖1 釀酒酵母孢子壁的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of yeast spore wall

本研究擬利用釀酒酵母孢子構(gòu)建GLP-1可口服給藥體系。通過(guò)串聯(lián)表達(dá)GLP-1，突變GLP-1部分堿基等方式對(duì)GLP-1進(jìn)行改造，并同時(shí)將改造后的GLP-1表達(dá)到釀酒酵母孢子內(nèi)以提高GLP-1抗酶解能力和體內(nèi)半衰期。通過(guò)模擬腸胃液處理實(shí)驗(yàn)，體外刺激小鼠胰島β細(xì)胞分泌胰島素等實(shí)驗(yàn)證實(shí)了所構(gòu)建的GLP-1給藥體系的有效性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 釀酒酵母AN120野生型菌株，dit1Δ缺陷型菌株，小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞（江南大學(xué)食品學(xué)院孫佳教授饋贈(zèng)），大腸桿菌DH5α。

pBlueScriptⅡSK（+）質(zhì)粒，pRS424-TEFpr為本實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒，pRS424-TEFpr-8*GLP-1-GFP和pRS424-TEFpr-ss-8*GLP-1-GFP為本研究所構(gòu)建的質(zhì)粒。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基:酵母提取物10 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉 10 g，瓊脂粉 20 g（固體），加水至1 L，121℃高壓滅菌20 min。

SD-Trp培養(yǎng)基:無(wú)氨基酵母氮源（YNB）6.7 g，瓊脂粉20 g（固體），加水至900 mL，121℃高壓滅菌20 min，使用前加入2 g缺少色氨酸（Trp）的氨基酸粉末以及100 mL滅菌的20 g/dL的葡萄糖溶液。

YPAD培養(yǎng)基:酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，腺嘌呤0.03 g，瓊脂粉20 g（固體），加水至900 mL，121℃高壓滅菌20 min，使用前加入100 mL滅菌的20 g/dL的葡萄糖溶液。

YPACe培養(yǎng)基:酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，腺嘌呤0.03 g，瓊脂粉20 g，乙酸鉀20 g，加水至1 L，121℃高壓滅菌20 min。

產(chǎn)孢培養(yǎng)基:乙酸鉀20 g，加水至1 L，121℃高壓滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大腸桿菌質(zhì)粒的構(gòu)建 GLP-1的活性區(qū)域含有36個(gè)氨基酸，其氨基酸序列從NCBI中獲得，如圖2所示。為了防止其被二肽基肽酶（DPP-IV）和胰蛋白酶（Trypsin）降解，我們對(duì)其非保守序列的第2位、第20位、第28位的氨基酸進(jìn)行了修改優(yōu)化，已有文獻(xiàn)證明這3個(gè)位點(diǎn)的改變并不影響GLP-1的生理活性。同時(shí)，為了在孢子內(nèi)大量表達(dá)GLP-1并防止GLP-1被降解，將其4串聯(lián)表達(dá)，并在序列首尾設(shè)計(jì)了相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，以方便后面的基因操作。此外，為了防止同源重組，對(duì)不同串聯(lián)序列的一些堿基也做了微調(diào)，整個(gè)4*GLP-1序列也根據(jù)釀酒酵母偏愛(ài)密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，并由上海生工生物公司合成。

合成的4*GLP-1序列首尾兩端各設(shè)計(jì)了2個(gè)酶切位點(diǎn)，分別為BamHⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ以及EcoRⅤ。大腸桿菌質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建流程如圖3所示。由于pRS424-TEFpr質(zhì)粒本身有2個(gè)EcoRⅤ酶切位點(diǎn)，無(wú)法用于直接構(gòu)建8*GLP-1重組質(zhì)粒，因此選擇pBlueScriptⅡSK（+）作為出發(fā)質(zhì)粒。首先為了方便檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)和定位，以pRS424-TEFpr-GFP為模板，通過(guò)PCR的方法將綠色熒光蛋白GFP編碼序列連接到載體，分別在5’和3’端加入EcoRⅠ以及XhoⅠ酶切位點(diǎn)。引物序列如下:

上游引物:

5’-CCGGAATTCAAAGGAGAAGAACTTTTCAC-3’下游引物:

5’-CCGCTCGAGTTATTTGTATAGTTCATCCATGC-3’

PCR獲得目的條帶之后，通過(guò)酶切連接的方法，將GFP基因序列連接到pBlueScriptⅡSK（+）載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取4-6個(gè)單菌落于LB-AMP液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)，隨后通過(guò)菌液PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，再提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

接著為構(gòu)建pBlueScriptⅡSK （+）-4*GLP-1-GFP，用BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切4*GLP-1條帶和pBlueScriptⅡSK（+）-GFP重組質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，于LB-AMP培養(yǎng)基挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。為構(gòu)建重組質(zhì)粒pBlueScriptⅡSK（+）-8*GLP-1-GFP，用 SmaⅠ、EcoRⅤ雙酶切目的條帶，用 SmaⅠ單酶切重組質(zhì)粒pBlueScriptⅡSK （+）-4*GLP-1-GFP，獲得兩端為平末端的片段，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取一定數(shù)量的單菌落進(jìn)行酶切驗(yàn)證。并挑取陽(yáng)性單菌落于LB-AMP液體培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜培養(yǎng)以擴(kuò)增重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒用小提質(zhì)粒試劑盒提取。

圖3 質(zhì)粒構(gòu)建流程Fig.3 Construction of plasmid pBlueScriptⅡSK （+）-8*GLP-1-GFP

1.2.2 釀酒酵母質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建 為使目的蛋白能夠在釀酒酵母孢子內(nèi)表達(dá)，首先，需構(gòu)建釀酒酵母轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pRS424-TEFpr-8*GLP-1-GFP，通過(guò)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒將8*GLP-1-GFP序列切下來(lái)再連接到pRS-424-TEFpr表達(dá)載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，為使目的蛋白8*GLP-1能夠定位在釀酒酵母孢子壁上，需在目的蛋白前添加信號(hào)肽序列ss片段。因ss片段大小不足100 bp，本文采用將TEF啟動(dòng)子與ss序列一同PCR的方法，獲得TEFpr-ss片段以替代重組質(zhì)粒上的TEF啟動(dòng)子序列。以pRS424-TEFpr-ss-3HA為模板，通過(guò)PCR的方法獲得TEFpr-ss序列，分別在兩端引入SacⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。引物序列如下:上游引物:

5’-GCTGGAGCTCATAGCTTCAA-3’

下游引物:

5’-CCGGATATCGGAAACAGGATTACAG-3’

最終獲得pRS424-TEFpr-8*GLP-1-GFP以及pRS424-TEFpr-ss-8*GLP-1-GFP重組質(zhì)粒 （圖4-5），構(gòu)建好的質(zhì)粒由上海生工測(cè)序。

圖4pRS424-TEFpr-8*GLP-1-GFP重組質(zhì)粒Fig.4Plasmid pRS424-TEFpr-8*GLP-1-GFP

圖5pRS424-TEFpr-ss-8*GLP-1-GFP重組質(zhì)粒Fig.5 Plasmid pRS424-TEFpr-ss-8*GLP-1-GFP

1.2.3 GLP-1重組蛋白在釀酒酵母孢子的表達(dá)以及孢子的純化 將得到的重組質(zhì)粒通過(guò)一步轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到釀酒酵母后，涂相應(yīng)缺陷平板，2天后長(zhǎng)出的單菌落即為成功轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的酵母。挑取一個(gè)單菌落接種于5 mL SD-Trp培養(yǎng)基的試管中，并于30℃、220 r/min的搖床過(guò)夜培養(yǎng)。12 h后取1 mL菌液轉(zhuǎn)入盛有50 mL的YPACe液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于30℃、220 r/min搖床預(yù)產(chǎn)孢24 h；6 000 r/min離心2 min收集菌體，用產(chǎn)孢培養(yǎng)基重懸，并全部轉(zhuǎn)入250 mL的三角瓶中（無(wú)菌操作），于30℃，220 r/min搖床培養(yǎng) 24 h；取 5～10 μL產(chǎn)孢培養(yǎng)基中的菌液，于顯微鏡下觀察酵母產(chǎn)孢情況，正常可以看到視野中有大量四聯(lián)球形態(tài)的子囊細(xì)胞。

為了使單個(gè)孢子能夠從子囊孢子中釋放出來(lái)，需對(duì)重組酵母的子囊孢子進(jìn)行進(jìn)一步處理，8 000 r/min離心收集孢子，并重懸于2 mL原生質(zhì)體buffer中，充分混勻后加入約 100 μL 的 lyticase（1 mg/mL），并置于37℃的搖床處理3 h，隨后超聲破碎以獲得單個(gè)孢子。為進(jìn)一步除去孢子部分破碎的子囊壁和裂解酶，以獲得純凈的孢子。需對(duì)超聲破碎的孢子進(jìn)行純化處理:首先需配制體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%梯度的Percoll溶液，配方如下:5mL Pecoll、4mL體積分?jǐn)?shù)0.5%Triton X-100，1 mL 2.5 mol/L蔗糖；6 mL Pecoll，3 mL 體積分?jǐn)?shù) 0.5%Triton X-100，1 mL 2.5 mol/L 蔗糖；7 mL Pecoll，2 mL 體積分?jǐn)?shù) 0.5%Triton X-100，1mL 2.5 mol/L 蔗糖；8 mL Pecoll，1 mL體積分?jǐn)?shù) 0.5%Triton X-100，1 mL 2.5 mol/L蔗糖。接著將超聲破壁過(guò)的孢子懸浮液用5 mL體積分?jǐn)?shù)0.5%Triton X-100洗滌一遍，并溶解在1 mL的體積分?jǐn)?shù)0.5%Triton X-100中，將體積分?jǐn)?shù)80%、70%、60%、50%梯度的Percoll溶液各取 1 mL，沿離心管壁緩慢依次加入10 mL離心管中，最后加入1 mL溶解在體積分?jǐn)?shù)0.5%Triton X-100中的孢子液；4℃、15 000 r/min離心約30 min后，梯度溶液會(huì)分層，用移液槍吸取孢子懸浮的一層于干凈離心管中，用5 mL 0.6 mol/L NaCl溶液洗滌1次；接著用1 mL體積分?jǐn)?shù)0.5%Triton X-100洗滌2次；最后將純化后的孢子置于冷凍干燥機(jī)中（-50℃，72 Pa）24 h后取出備用。

1.2.4 GLP-1重組蛋白的檢測(cè) 為了檢測(cè)目的蛋白是否成功表達(dá)，需提取重組酵母孢子內(nèi)的全蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，具體方法為:離心收集約5 mL培養(yǎng)基的菌體于1.5 mL離心管中，用dd水洗2遍后用500 μL S buffer重懸，再加入5 μL的溶壁酶（lyticase），于30℃酶解30 min。離心收集沉淀并用 S buffer洗2遍后，加入400 μL lysis buffer重懸，再加入適量玻璃珠以及4 μL PMSF （100 mmol/L），于冰上破碎，具體步驟為冰上靜置1 min，再于振蕩器振蕩1 min，如此循環(huán)15次后，于4℃、1 000 g離心10 min，取上清液3 000 g離心10 min進(jìn)一步去除細(xì)胞碎片。所得的上清液即為提取的釀酒酵母全蛋白。全蛋白用Western blot進(jìn)一步檢測(cè)目的蛋白是否表達(dá)，Anti-GFP mouse和 Goat Anti-mouse lgGHRP分別作為一抗和二抗。

在Western blot檢測(cè)到目的條帶后，通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)進(jìn)一步確定GLP-1在孢子中的表達(dá)位置。首先重接種釀酒酵母并產(chǎn)孢，產(chǎn)孢過(guò)程同上，獲得四聯(lián)球孢子后，收集約5 mL菌液的孢子，并用dd水洗2遍后重懸，調(diào)節(jié)一定的濃度，取5 μL于載玻片上，并盡快置于熒光顯微鏡下，使用100×油鏡觀察檢測(cè)GFP熒光信號(hào)，獲得的熒光照片由NIS-Element AR軟件分析。

1.2.5 釀酒酵母孢子給藥體系的體外活性檢測(cè)在確定目的蛋白成功表達(dá)后，接下來(lái)要對(duì)釀酒酵母孢子給藥體系的活性進(jìn)行檢測(cè)。為模擬人體內(nèi)部消化環(huán)境，首先用模擬腸胃液對(duì)孢子載藥體系進(jìn)行處理。處理流程圖如圖6所示，首先，稱(chēng)取10 mg孢子粉，溶于10 mL模擬胃液中，于37℃、180 r/min搖床消化處理2 h，其中模擬腸胃液的配方為:2.0 g氯化鈉、3.2 g胃蛋白酶、7 mL HCL，溶解于 1 L ddH2O。隨后于模擬胃液中加入NaHCO3并調(diào)節(jié)pH至7.5，再加入胰酶至終質(zhì)量濃度為10 g/L，配制成模擬腸液，同樣于37℃搖床處理4 h。隨后為使蛋白酶失活，將樣品置于金屬浴中100℃熱處理5 min，然后迅速冷卻至室溫。離心管于3000r/min離心20min，收集上清液后置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干備用。

圖6 給藥體系體外活性檢測(cè)過(guò)程Fig.6 Detection of in vitro activity of the drug deliverysystem

為檢測(cè)經(jīng)模擬腸胃液處理后的消化產(chǎn)物是否具有促胰島素釋放的作用，需將凍干產(chǎn)物與MIN6細(xì)胞共培養(yǎng)并檢測(cè)上清液中的胰島素濃度。將MIN6細(xì)胞接種于96孔板上，接種密度為2×104個(gè)/孔，分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)平行樣。培養(yǎng)24 h后，取凍干的消化產(chǎn)物，重懸于100 μL的細(xì)胞培養(yǎng)基中，再取10 μL加入96孔板的樣品孔中，與MIN6細(xì)胞共培養(yǎng)2 h，隨后取上清液，并按照小鼠胰島素ELISA試劑盒的操作步驟進(jìn)行胰島素水平的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

為了能夠?qū)LP-1表達(dá)到釀酒酵母內(nèi)，需要構(gòu)建pRS424-TEFpr-8*GLP-1-GFP以及pRS424-TEFpr-ss-8*GLP-1-GFP重組質(zhì)粒，為使重組蛋白能夠定位在釀酒酵母孢子壁上，需在目的蛋白前添加信號(hào)肽序列ss片段。因ss片段大小不足100 bp，本文采用將TEF啟動(dòng)子與ss序列一同PCR的方法，獲得TEFpr-ss片段以替代重組質(zhì)粒上的TEF啟動(dòng)子序列。以pRS424-TEFpr-ss-3HA為模板，通過(guò)PCR的方法獲得TEFpr-ss序列，分別在兩端引入SacⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。最終獲得pRS424-TEFpr-8*GLP-1-GFP以及pRS424-TEFpr-ss-8*GLP-1-GFP重組質(zhì)粒，構(gòu)建好的質(zhì)粒首先經(jīng)過(guò)SacⅠ和 BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證（圖 7），圖 7 （a）在 2號(hào)泳道有一條約1 490 bp的條帶，與序列8*GLP-1-GFP的長(zhǎng)度一致。圖7（b）亦在500 bp（序列TEFprss）處檢測(cè)到條帶。在酶切驗(yàn)證后重組質(zhì)粒由上海生工進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)。

圖7 重組質(zhì)粒酶切電泳Fig.7 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmid

2.2 8*GLP-1-GFP重組蛋白的表達(dá)

為檢測(cè)目的蛋白是否成功表達(dá)，我們將pRS424-TEFpr-8*GLP-1-GFP和pRS424-TEFpr-ss-8*GLP-1-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母AN120野生型菌株，dit1Δ缺陷型菌株內(nèi)，產(chǎn)孢獲得相應(yīng)重組酵母孢子并提取蛋白。利用Western blot檢測(cè)目的蛋白條帶，從圖 8 可看出，在 55×103（8*GLP-1-GFP）左右有明顯的條帶。在野生型中，相對(duì)于胞內(nèi)表達(dá)的重組體系，表達(dá)在孢子壁上的目的蛋白量明顯較多，可能是由于表達(dá)到孢子壁上的重組蛋白可防止被內(nèi)部酶解。而在二酪氨酸缺陷型孢子中，情況正好相反，可能是由于其缺少最外層的二酪氨酸，從而導(dǎo)致大量的重組蛋白分泌到胞外。

圖8 8*GLP-1-GFP重組蛋白表達(dá)的Western blot驗(yàn)證Fig.8 Western blotting analysis of 8*GLP-1 expressed in yeast spore

2.3 8*GLP-1-GFP重組蛋白的在釀酒酵母孢子的定位

我們進(jìn)一步通過(guò)GFP的熒光定位來(lái)確定GLP-1 在孢子中的位置。 圖 9 中（b）、（e）為胞內(nèi)表達(dá)，可以檢測(cè)到明顯的熒光，（c）、（f）為胞子壁表達(dá)，其熒光強(qiáng)度明顯低于胞內(nèi)表達(dá)，且似乎有少量泄露到子囊殼內(nèi)。熒光定位實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了重組蛋白8*GLP-1被成功表達(dá)到釀酒酵母孢子內(nèi)。

圖9 8*GLP-1-GFP重組蛋白在孢子內(nèi)的熒光定位Fig.9 Localization of 8*GLP-1-GFP in yeast spore

2.4 釀酒酵母孢子載藥體系的體外活性檢測(cè)

圖10 GLP-1刺激MIN6細(xì)胞分泌胰島素結(jié)果Fig.10 Insulin secretion stimulated by GLP-1

在確定目的蛋白成功表達(dá)后，我們進(jìn)一步對(duì)釀酒酵母孢子GLP-1載藥體系的體外活性進(jìn)行檢測(cè)。將經(jīng)模擬腸胃液處理后的載GLP-1孢子與MIN6共培養(yǎng)，并用ELISA方法檢測(cè)胰島素濃度。如圖10所示，與單純的GLP-1相比，表達(dá)了GLP-1重組蛋白的孢子能夠顯著促進(jìn)胰島素的分泌，同時(shí)，胞子壁表達(dá)與胞內(nèi)表達(dá)的效果差別不大。說(shuō)明無(wú)論是表達(dá)到孢子壁還是表達(dá)到孢內(nèi)，孢子都可以對(duì)所表達(dá)的GLP-1具有一定的保護(hù)作用，并提高其促胰島素活性。

3 結(jié) 語(yǔ)

糖尿病作為影響現(xiàn)代人生命健康的一大疾病，至今仍無(wú)有效的解決方法。GLP-1及其類(lèi)似物已成為研究治療二型糖尿病的熱點(diǎn)。本文首先對(duì)GLP-1進(jìn)行基因改造及串聯(lián)表達(dá)，然后選擇釀酒酵母孢子作為表達(dá)和運(yùn)輸載體構(gòu)建GLP-1口服給藥體系。本文構(gòu)建了重組GLP-1質(zhì)粒并成功在釀酒酵母孢子內(nèi)表達(dá)，形成表達(dá)8串聯(lián)GLP-1的釀酒酵母孢子載藥體系。該體系在經(jīng)過(guò)模擬腸胃液處理后能有效刺激MIN6細(xì)胞分泌胰島素，證明了所構(gòu)建的GLP-1給藥體系的有效性。綜上，本研究為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)治療糖尿病的口服藥物提供了新的思路。