menA過表達(dá)菌株構(gòu)建及兩階段pH控制促進(jìn)VK2合成

劉 艷， 楊自名， 薛正蓮， 楊超英， 胡劉秀， 程良成，王 洲， 丁秀敏

（1.安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖241000；2.蕪湖張恒春藥業(yè)有限公司，安徽 蕪湖241009）

維生素K2（MK，VK2）是一類重要的甲萘醌系列脂溶性維生素，在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域都有重要應(yīng)用。健康人群適量補(bǔ)充富含維生素K2食品，可有效減少骨折發(fā)病率[1]。研究發(fā)現(xiàn)，日本兒童沒有其它國(guó)家兒童普遍存在的生長(zhǎng)痛，是因?yàn)閺男〕约{豆，而納豆中富含維生素K2，導(dǎo)致兒童的骨密度高、骨骼強(qiáng)壯。另外，對(duì)于不足6個(gè)月大的嬰兒來說，維生素K缺乏引起的嬰兒出血疾病是一個(gè)非常嚴(yán)重的世界性問題[2]。并且，近幾年國(guó)內(nèi)外學(xué)者在Science和Nature等頂級(jí)國(guó)際期刊發(fā)表的研究報(bào)道都表明，同輔酶Q相似，維生素K2作為一種膜結(jié)合電子載體，具有修復(fù)損傷細(xì)胞線粒體的功能[3-5]，這對(duì)于人類免受帕金森癥折磨起著重要的作用?；谶@3方面的應(yīng)用，國(guó)際市場(chǎng)對(duì)功能性食品維生素K2的需求量近年來不斷增長(zhǎng)。

由于化學(xué)法合成維生素K2存在安全問題，在歐盟和部分亞洲國(guó)家被限制不能直接將其用于食品中；此外，微生物發(fā)酵合成維生素K2，因具有反應(yīng)條件溫和、發(fā)酵原料價(jià)格低廉、環(huán)境污染小，同時(shí)因?yàn)樵蟻碓从谏铮铣傻漠a(chǎn)品具有高生物活性和高生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，成為維生素K2合成的首選方法。國(guó)內(nèi)外用于合成維生素K2的菌株主要有黃桿菌和納豆芽孢桿菌，分別生產(chǎn)在C3位側(cè)鏈上帶有4個(gè)和7個(gè)異戊二烯單位的維生素K2同系物 （MK-4和MK-7）[6-18]。MK-7在人體血液中具有較長(zhǎng)的半衰期[19]，并且納豆芽孢桿菌來源于食品，因此利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵獲得的維生素K2更有市場(chǎng)前景。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和基因組測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，菌體內(nèi)維生素K2的基礎(chǔ)代謝研究也在不斷被推進(jìn)和深入。維生素K2的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為2-甲基-3-烯基-1，4-萘醌，分別由主鏈 1，4-二羥基-2-萘甲酸（DHNA）和側(cè)鏈聚異戊二烯組成（圖 1（a））。1982年Bentley和Meganathan詳細(xì)綜述了維生素K2在細(xì)菌體內(nèi)生物合成途徑中的代謝中間物、關(guān)鍵酶以及催化反應(yīng)機(jī)理，提出維生素K2中主鏈底物萘醌骨架主要通過莽草酸途徑（圖1（b）），由men系列基因編碼的酶系催化合成[20]；乙酰CoA進(jìn)入甲羥戊酸途徑形成側(cè)鏈底物聚異戊二烯焦磷酸（OPP）。作為橋連主鏈和側(cè)鏈底物合成維生素K2的酶，過量表達(dá)1，4-二羥基-2-萘甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶（MenA）對(duì)于促進(jìn)維生素K2在菌體內(nèi)的代謝合成具有十分顯著的效果[21-22]。然而，目前的研究還只限于大腸桿菌和解淀粉芽孢桿菌，并且也尚未見有對(duì)menA基因過表達(dá)菌株進(jìn)行深入地發(fā)酵過程調(diào)控方面的研究。

圖1 維生素K2化學(xué)結(jié)構(gòu)式及代謝合成途徑Fig.1 Structure formula of vitamin K2and its metabolic pathway

作者考察了納豆芽孢桿菌menA基因過表達(dá)對(duì)維生素K2合成能力的影響，檢測(cè)并分析恒定pH對(duì)分批發(fā)酵培養(yǎng)過程中維生素K2合成動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并在此基礎(chǔ)上提出兩階段pH控制策略，為維生素K2的大規(guī)模生產(chǎn)提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與質(zhì)粒 納豆芽孢桿菌為本實(shí)驗(yàn)室誘變獲得。大腸桿菌BH5α，質(zhì)粒pHY-P43保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（g/L）:牛肉膏3，蛋白胨 10，NaCl 5，瓊脂粉 20；pH 7.0~7.2。

種子培養(yǎng)基（g/L）:甘油 10，蛋白胨 10，NaCl 5；pH 7.2~7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）:甘油 10.5，K2HPO4 0.4，蛋白胨 20，酵母提取物 25；pH7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 種子培養(yǎng):按照108個(gè)/mL的接種量吸取菌體溶液于100 mL種子培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min搖床培養(yǎng)36 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):將5 mL種子液接入含100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37°C，200 r/min搖床培養(yǎng)80 h。

5 L發(fā)酵罐小試發(fā)酵:種子液培養(yǎng)24 h后以10%體積分?jǐn)?shù)的接種量倒入發(fā)酵罐中，裝液量為2 L，控制通氣量為1.0~2.0 vvm，200 r/min 37°C下發(fā)酵80 h。每間隔8 h測(cè)定發(fā)酵過程中各項(xiàng)生化指標(biāo)，包括培養(yǎng)基中殘余甘油量、菌體生物量、pH變化和維生素K2含量等。

1.2.2 menA過表達(dá)菌株的構(gòu)建 以納豆芽孢桿菌全基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到menA基因片段，設(shè)計(jì)引物序列如下:

擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pHY-P43連接，得到重組質(zhì)粒pHY-P43/menA。酶切連接后獲得含有menA基因的重組表達(dá)質(zhì)粒。參照經(jīng)典的芽孢桿菌轉(zhuǎn)化法（即spizizen轉(zhuǎn)化法）[23]，上述構(gòu)建好的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切驗(yàn)證正確后，轉(zhuǎn)化到B.subtilis natto菌株中，挑取陽(yáng)性克隆。

1.3 分析方法

1.3.1 生物量測(cè)定 取一定量發(fā)酵液于8 000 r/min下離心10 min，下層沉淀用水洗滌2~3次，105°C烘至恒重后稱重。

1.3.2 甘油含量的測(cè)定[24]不同比色管中分別放置不同濃度的甘油標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1 mL，然后分別加入1 mL 0.015 mol/L高碘酸鈉溶液，混勻后室溫放置10 min，然后加入2 mL 0.1 g/dL L-鼠李糖溶液，再分別加入4 mL Nash試劑，53°C水浴中加熱15 min后于412 nm處測(cè)其吸光度。以甘油不同濃度為橫坐標(biāo)，吸光值OD為縱坐標(biāo)，作甘油濃度對(duì)OD的標(biāo)準(zhǔn)曲線。8 000 r/min離心發(fā)酵后的培養(yǎng)基5 min，上清液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?，按照甘油?biāo)品檢測(cè)方法，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中甘油的含量。

1.3.3 維生素K2提取及檢測(cè) 吸取10 mL納豆芽孢桿菌發(fā)酵液，并加入異丙醇和正己烷的混合液（1∶2∶4，體積比），搖床220 r/min震蕩30 min后靜置分層，取上清液旋蒸，記錄產(chǎn)物的質(zhì)量并用異丙醇將其洗出，定容到10 mL的棕色容量瓶中。高效液相色譜進(jìn)行維生素K2的定量檢測(cè)。液相色譜工作條件[14]:色譜柱:Brava-BDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流動(dòng)相:甲醇∶二氯甲烷=9∶1；流速:1.0 mL/min；進(jìn)樣量:20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng):248 nm。

1.3.4 動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算 利用Origin軟件對(duì)菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成數(shù)據(jù)進(jìn)行插值計(jì)算（時(shí)間步長(zhǎng)為0.1 h），擬合得到不同pH下比生長(zhǎng)速率μ、維生素K2比合成速率q、菌體得率系數(shù)Yx/s、以菌體細(xì)胞為基準(zhǔn)的產(chǎn)物得率系數(shù)YP/x、生物量生成速率Qx、產(chǎn)物比生成速率QP。計(jì)算公式分別為:

其中，x為菌體質(zhì)量濃度 （g/L）；p為維生素K2質(zhì)量濃度（mg/L）；s為發(fā)酵液中殘留甘油質(zhì)量濃度（g/L）；t為時(shí)間（h）。

2 結(jié)果與分析

2.1 menA過表達(dá)菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證

以提取得到的納豆芽孢桿菌全基因組 （圖2（a））為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得menA片段（圖2（b）），與pHY-P43質(zhì)粒連接，得到重組質(zhì)粒pHY-P43/menA。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入納豆芽孢桿菌后，挑取陽(yáng)性克隆并提取其中的重組質(zhì)粒，KpnI和EcoRI雙酶切，酶切后電泳圖如圖2（c）。重組質(zhì)粒的單酶切產(chǎn)物約6 000 bp，雙酶切產(chǎn)物中大片段與pHY-P43質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物堿基對(duì)數(shù)相近，在5 100 bp左右；小片段約885 bp，與menA基因堿基對(duì)數(shù)相仿。由此我們認(rèn)為pHYP43-menA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒pHYP43-menA經(jīng)上海生工測(cè)序，測(cè)序報(bào)告中menA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中menA基因序列比對(duì)結(jié)果100%相同，再次驗(yàn)證了menA基因在構(gòu)建過程中沒有發(fā)生突變。Western blot驗(yàn)證帶有空載體納豆芽孢桿菌、原始菌以及含pHY-P43-menA重組質(zhì)粒菌株中MenA蛋白表達(dá)情況，從圖2（d）中可以清晰看出含pHY-P43-menA重組質(zhì)粒菌株中MenA表達(dá)量明顯高于原始菌和只轉(zhuǎn)入空載體的納豆芽孢桿菌。含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板上篩選含pHY-P43-menA重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌株，劃線轉(zhuǎn)接3次陽(yáng)性單菌落，均能提取得到重組質(zhì)粒pHY-P43-menA，說明該菌株可用于下一步發(fā)酵。

圖2 基因組DNA、PCR產(chǎn)物、雙酶切產(chǎn)物電泳圖以及western blot檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The electrophoresis results of genomic DNA,PCR product,restriction enzyme digestion and result of western blot.

2.2 納豆芽孢桿菌產(chǎn)維生素K2分批發(fā)酵過程

通過5 L發(fā)酵罐小試，原始菌和menA基因過表達(dá)菌株均于8 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期迅速生長(zhǎng)，40 h時(shí)進(jìn)行穩(wěn)定生長(zhǎng)期（圖3）。2株菌均在40 h開始在體內(nèi)大量累積維生素K2，72 h左右其質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定。說明該次級(jí)代謝物與其結(jié)構(gòu)類似物輔酶Q10相似，不屬于生長(zhǎng)耦聯(lián)型[25]。menA過表達(dá)菌株在合成維生素K2的過程中，菌體生成、底物（甘油）消耗、產(chǎn)物（維生素K2）合成均與原始菌呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)，說明menA基因的過量表達(dá)并沒有對(duì)菌體生理特性造成影響。雖然menA基因過表達(dá)菌株的生物量與較原始菌相比略有下降（（6.84±0.28） g/L vs（7.86±0.31） g/L)，但維生素K2合成量卻是原始菌的1.51倍（（38.07±1.81） mg/L vs （25.21±0.81） mg/L)，說明 menA 的過量表達(dá)對(duì)提高納豆芽孢桿菌體內(nèi)側(cè)鏈底物DPP與主鏈底物1，4-二羥基-2-萘甲酸（DHNA）結(jié)合能力，促進(jìn)維生素K2的代謝合成具有非常重要的意義。Kong等同樣發(fā)現(xiàn)menA過表達(dá)能將大腸桿菌合成維生素K2的能力提高2倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單獨(dú)過表達(dá)men家族的其它基因[22]。并且，作者前期的研究發(fā)現(xiàn)在黃桿菌中4-羥苯甲酸-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶（UbiA）某些氨基酸位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致MenA蛋白表達(dá)量的增加，而MenA蛋白表達(dá)量的增加最終能提高維生素K2的合成量[26]。因此，接下來我們針對(duì)menA過表達(dá)菌株，對(duì)其發(fā)酵過程進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步提高維生素K2的產(chǎn)量。

圖3 原始菌和menA過表達(dá)菌株產(chǎn)維生素K2分批發(fā)酵過程曲線Fig.3 Batch fermentation time course of vitamin K2 production by original and menA over-expression strain of Bacillus subtilis natto

2.3 不同pH下過表達(dá)菌產(chǎn)維生素K2發(fā)酵過程曲線及動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

整個(gè)發(fā)酵過程中培養(yǎng)基pH值在持續(xù)下降，而菌體生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物生成的最適pH值往往不同，見圖 3（a）和 3（b）。 因此，作者考察了在分批發(fā)酵過程中恒定發(fā)酵液的pH，分別恒定為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，得到的發(fā)酵過程曲線見圖4。可以看出，不同pH下menA基因過表達(dá)菌株與原始菌在菌體生長(zhǎng)與維生素K2合成曲線上的趨勢(shì)基本對(duì)應(yīng)相同。在pH為7.0時(shí)生物量相對(duì)較高，為（8.91±0.31）g/L。pH為6.0時(shí)次之，并且生物量隨著pH值的下降，也在不斷降低。說明培養(yǎng)基的酸性越大越不利于菌體生長(zhǎng)。然而，與生物量的變化趨勢(shì)不同，維生素K2合成量隨著pH值的不斷下降，呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。維生素K2合成量最高值（30.23±0.44）mg/L出現(xiàn)在pH值為4.0時(shí)。也就是說，雖然pH 4.0不能保證最大的菌體生成量，但最有利于維生素K2合成。由于是胞內(nèi)產(chǎn)物，而相對(duì)較少的生物量也限制了維生素K2的大量合成。這說明單一pH不能同時(shí)保證最大菌體生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物得率。

圖4 不同恒定pH條件下維生素K2發(fā)酵過程曲線Fig.4 Time courses of vitamin K2production by Bacillus subtilis natto at various pH value

圖5 不同恒定pH值下納豆芽孢桿菌產(chǎn)維生素K2的動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較Fig.5 Comparison of kinetic parameters in vitamin K2 production by Bacillus subtilis natto at various constant pH value

圖5和表1列出了pH為3.0~7.0時(shí)的發(fā)酵過程動(dòng)力學(xué)參數(shù)。通過比較可以發(fā)現(xiàn)，比生長(zhǎng)速率μ和維生素K2比合成速率q在不同pH下的變化趨勢(shì)相似。不同pH下μ都在發(fā)酵前期（24 h）達(dá)到最大值，而q的最大值出現(xiàn)在發(fā)酵后期（48 h）。原因可能是發(fā)酵前期主要用于合成菌體和初級(jí)代謝產(chǎn)物，當(dāng)二者達(dá)到一定值后，菌體以前期積累的初級(jí)代謝產(chǎn)物為前體，啟動(dòng)合成次級(jí)代謝物。與其它pH值相比，當(dāng) pH 為 7.0 時(shí)，μmax（0.129 h-1）最高。生物量生成速率Qx同樣在pH為7.0時(shí)數(shù)值最高，為0.11 g/L·h。菌體進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間為40 h，說明在發(fā)酵前期（40 h）控制pH在7.0有利于菌體充分生長(zhǎng)。相較于pH7.0，pH為4.0時(shí)菌體的比生長(zhǎng)速率μmax和生物量生成速率Qx均較低，分別為0.079 h-1和0.05 g/L·h，但是q在整個(gè)發(fā)酵過程中都較高，且增加幅度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，也在逐漸增大，增幅明顯高于其它pH下的對(duì)應(yīng)值，在48 h達(dá)到最大值0.222 mg/g·h。這說明pH為4.0雖然不利于菌體生長(zhǎng)，但卻促進(jìn)了維生素K2的生成。以上結(jié)果表明，發(fā)酵過程中設(shè)定單一pH，不能使菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成都能達(dá)到最理想狀態(tài)。

2.4 兩階段pH控制策略強(qiáng)化納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)維生素K2

為保證菌體在充分生長(zhǎng)的同時(shí)提高維生素K2合成量，從上述分析中提出一種兩階段pH控制策略:在發(fā)酵前期0~40 h控制pH 7.0，在發(fā)酵后期40~80 h控制pH恒定為4.0進(jìn)行分批發(fā)酵。由圖6和表2可知，在發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)速率較pH自然狀態(tài)下明顯提高，最大生物量達(dá)到了（11.46±0.67）g/L，比menA過表達(dá)菌pH自然狀態(tài)下的最大生物量提高了67.54%，比原始菌提高了45.80%。值得一提的是，當(dāng)經(jīng)過過表達(dá)menA基因，并采用了兩階段pH控制后，維生素K2的產(chǎn)量有了大幅度提高，分別是原始菌和過表達(dá)菌自然狀態(tài)下的2.6和1.7倍。說明在此策控制策略下，不僅提高了菌體生物量，還提高了維生素K2產(chǎn)量，為大規(guī)模生產(chǎn)維生素K2提供了基礎(chǔ)條件。李珊等[27]發(fā)現(xiàn)兩階段pH控制對(duì)于哈茨木霉合成β-1，3-葡聚糖內(nèi)切酶同樣具有非常明顯的促進(jìn)作用，說明該策略在提高特定發(fā)酵產(chǎn)品總體產(chǎn)量方面具有一定的適用性。

表1 不同pH下維生素K2分批發(fā)酵過程動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較Table 1 Comparison of fermentation kinetic parameters at various pH value

表2 不同發(fā)酵過程下維生素K2發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較Table 2 Comparison of fermentation kinetic parameters at various fermentation process

圖6 兩階段pH控制Bacillus subtilis natto產(chǎn)維生素K2 Fig.6 Time course of vitamin K2production by Bacillussubtilis natto using two-stage pH control strategy

3 結(jié) 語(yǔ)

過量表達(dá)menA基因能使Bacillus subtilis natto維生素K2合成量提高51%。發(fā)酵過程中最適菌體生長(zhǎng)和維生素K2合成pH分別為7.0和4.0。作者采用兩階段pH控制策略，將發(fā)酵前期0~40 h的pH控制為7.0，確保得到能充分合成維生素K2的菌體量。在發(fā)酵后期40~80 h控制pH為4.0，確保在得到最大菌體生物量的同時(shí)最大程度合成維生素K2。采用menA過表達(dá)和兩階段pH控制，菌體生物量和維生素K2的產(chǎn)量分別達(dá)到了（11.46±0.67）g/L和（63.60±1.81）mg/L，分別是原始菌分批發(fā)酵pH自然狀態(tài)下的1.5倍和2.6倍。