貴州草海小龍蝦蝦青素提取條件及含量測定

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(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550000；2.貴州省林業(yè)廳，貴州 貴陽 550000；3.貴州師范大學(xué)喀斯特洞穴研究中心，貴州 貴陽 550000)

蝦青素(Astaxanthin)是一種非維生素A源類的胡蘿卜素，在常溫中呈現(xiàn)紫黑色結(jié)晶的粉末狀態(tài)，易被氧化且對陽光異常敏感，易溶于丙酮、二氯甲烷和氯仿等多數(shù)有機溶劑中[1]。蝦青素具有抗氧化的性質(zhì)，其分子式中具有活潑的電子效應(yīng)，極易和自由基發(fā)生反應(yīng)而使自由基被清除，水產(chǎn)類生物體中含有蝦青素可以起到免疫、著色和保險的作用，對魚類的生長調(diào)節(jié)具有重要的作用，因而被譽為“超級維生素E”和“超級抗氧化劑”[2-5]。

自上世紀(jì)80年代開始，許多專家和學(xué)者對蝦青素的生物學(xué)功能進行大量研究，發(fā)現(xiàn)蝦青素擁有很多重要的生物學(xué)功能，安全性較好，因而越來越被人們所關(guān)注[6-7]。當(dāng)前蝦青素的主要來源有：從雨生紅球藻中提取[9-10]、用法夫酵母生產(chǎn)[11-12]、從甲殼類水產(chǎn)廢棄物中提取[13-14]。陳西廣、何立堅[6、8]等研究了用乙酸乙酯浸提法提取甲殼類蝦青素的工藝流程，張芬[15]等用高效液相色譜法測定了小丑魚體內(nèi)蝦青素的含量，宋慶洋[16]等研究了克氏原螯蝦蝦殼在三種不同干燥條件下蝦青素提取的效果，杜云建[17]等采用稀堿法從蝦殼中提取蝦青素，孫來娣[18]等研究了二氯甲烷一甲醇溶液提取南極磷蝦粉蝦青素的工藝條件。為了探究貴州草海小龍蝦(Procambarusclarkii)不同部位蝦青素含量，本研究中以貴州草海的小龍蝦為原料，采用單因素實驗確定最佳提取條件，運用分光光度法測定草海小龍蝦不同部位蝦青素的含量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小龍蝦(草海自然水域捕獲)、FA-1004型電子稱、HWS28型電熱恒溫水浴鍋、752型紫外可見分光光度計、SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000、乙酸乙酯(分析純AR)、乙醇(分析純AR)、石油醚(分析純AR)、異丙醇(分析純AR)、二氯甲烷(分析純AR)、燒杯、試管、漏斗、蝦青素標(biāo)樣。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 蝦殼處理：將小龍蝦蝦殼剝離去肉清洗干后，放入55 ℃的烘箱中烘干，稱量；將干蝦殼放入打粉機中打粉。

去蛋白質(zhì)處理：取適量打好的干蝦粉，加入胃蛋白酶在溫度60 ℃、pH值為2.5的條件下水解1 h，水解后將濾渣進行抽濾，用蒸餾水水洗至中性，在陰涼通風(fēng)處自然干燥。

蝦青素提?。悍Q量已定量經(jīng)過去蛋白處理的蝦殼粉，將樣品轉(zhuǎn)入燒杯中，加入適量的溶液，攪拌均勻，在一定溫度下浸提一段時間后，濾去溶液中的廢渣，得蝦青素提取溶液。

1.2.2 內(nèi)臟、蝦肉中蝦青素的提取 內(nèi)臟、蝦肉中蝦青素的提取方法同1.2.1相同。

1.3 繪制蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

配置標(biāo)準(zhǔn)溶液：用電子天平稱取1 mg的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)樣品放入50 mL的容量瓶中，加入25 mL的乙酸乙酯溶液，配置得到0.04 mg·mL-1的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用時用10 mL乙酸乙酯溶液分別稀釋成5、4、3、2和1 μg·mL-1等不同濃度梯度的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液。將稀釋后的溶液置于紫外分光光度計中(吸收波長為474 nm)測定吸光值。以稀釋濃度為橫坐標(biāo)，蝦青素的吸光值為縱坐標(biāo)，制作蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.4 蝦青素提取的單因素實驗

1.4.1 提取溶劑的選取 用天平稱取5份經(jīng)過去蛋白處理的蝦殼粉放入25 mL的試管中，分別將10 mL的乙醇、石油醚、乙酸乙酯、異丙醇和二氯甲烷加入到5個試管中，在常溫下提取3 h后，將溶液進行旋蒸干燥，分別再加入10 mL的石油醚溶液，將溶液置于紫外分光光度計中(吸收波長468 nm)測定吸光值。

1.4.2 料液比的選擇 用天平稱取5份經(jīng)過去蛋白處理的蝦殼粉放入25 mL的試管中，然后加入1.5 、3、4.5、6和7.5 mL的乙酸乙酯溶液，常溫下浸提3 h，旋蒸干燥后，將溶液置于紫外分光光度計中(吸收波長474 nm)測定吸光值。

1.4.3 提取溫度的選取 用天平稱取8份經(jīng)過去蛋白處理的蝦殼粉放入25 mL的試管中，分別加入10 mL乙酸乙酯溶液，將試管放入20、30、40、50、60、70、80和90 ℃的水浴鍋中進行加熱1 h后，將溶液置于紫外分光光度計中(吸收波長474 nm)測定吸光值。

1.4.4 提取時間的選取 用天平稱取5份經(jīng)過去蛋白處理的蝦殼粉放入25 mL的試管中，加入10 mL乙酸乙酯溶液，在溫度為60 ℃的水浴鍋中分別加熱1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后，將溶液置于紫外分光光度計中(吸收波長474 nm)測定吸光值。

1.4.5 提取次數(shù)的選擇 用天平稱取3份經(jīng)過去蛋白處理的蝦殼粉放入25 mL的試管中，加入10 mL乙酸乙酯溶液，在60 ℃的水溫下提取1 h后，將溶液進行過濾，濾渣重新加入10 mL乙酸乙酯溶液重新加熱。此步驟重復(fù)4次，將4次所得溶液置于紫外分光光度計中(吸收波長474 nm)測定吸光值。

1.4.6 小龍蝦不同部位蝦青素含量的測定 用天平分別稱取處理后的蝦殼樣品2.0 g、內(nèi)臟樣品5.0 g和蝦肉樣品25 g，按照單因素實驗中所得的最佳提取條件對小龍蝦3個部位的樣品進行蝦青素提取，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算不同部位蝦青素的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

在乙酸乙酯最大的吸收波長474 nm處測得蝦青素各梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值(如圖1所示)，乙酸乙酯溶液中蝦青素濃度和吸光值之間的關(guān)系式為y=0.166 4 x+0.018 4，R2=0.999 4，線性關(guān)系良好。

圖1 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 單因素提取實驗的結(jié)果

2.2.1 溶劑的提取效果 從圖2中可以看出，5種不同溶劑對于蝦青素的提取效果差異明顯，其中乙酸乙酯溶液的提取效果最佳，所以選擇乙酸乙酯溶液為最宜提取溶劑。

2.2.2 料液比的最佳提取結(jié)果 從圖3種可以看出，隨著乙酸乙酯溶液用量的增加，料液比由1∶1到1∶2時吸光度增加幅度較大，而料液比為1∶2之后隨著溶液的增加吸光值變化不明顯，所以最佳的料液比為1∶2。

圖2 不同溶劑的提取效果圖

圖3 不同料液比下的吸光值圖

2.2.3 提取溫度的最佳結(jié)果 從圖4中可以看出，隨著提取溫度的增加吸光值也呈現(xiàn)出增大的趨勢，當(dāng)溫度在60 ℃時吸光值達到最大，60 ℃后吸光值呈現(xiàn)減小的趨勢，故最佳的提取溫度應(yīng)為60 ℃。

2.2.4 提取時間的結(jié)果 由圖5可以看出，隨著提取時間的增加，吸光度值在2 h處達到最高，此后隨著時間增加吸光度值呈現(xiàn)下降趨勢。故選擇最佳的提取時間為2 h。

圖4 不同提取溫度下的吸光值變化圖

圖5 提取時間對提取效果的影響

2.2.5 提取次數(shù)的結(jié)果 3份蝦殼樣品經(jīng)過4次提取后，提取結(jié)果如表1所示。經(jīng)過前兩次乙酸乙酯溶液浸提后，多數(shù)蝦青素已被提取出來，以至于3、4次提取出的蝦青素很少，所以最佳提取次數(shù)為2次。

表1 提取次數(shù)對提取效果的影響

2.3 各部位蝦青素含量的測定結(jié)果

通過上述的單因素實驗得出的最佳提取方法來測定草海4個樣地小龍蝦蝦殼、蝦肉和內(nèi)臟中的蝦青素含量，結(jié)果如表2所示，草海小龍蝦蝦青素在4個樣地蝦殼中含量最高，西海碼頭(45.28±0.12 μg·g-1)、江家灣(38.24±0.14 μg·g-1)、吳家?guī)r頭(46.18±0.23 μg·g-1)、嘍啰山(42.97±0.26 μg·g-1)，4個樣地蝦肉和內(nèi)臟中也含有少量蝦青素，但是含量遠低于蝦殼中的含量，這也說明了小龍蝦蝦青素主要富集在蝦殼中。

表2 4樣地小龍蝦不同部位的蝦青素含量

3 結(jié)論與討論

目前，蝦青素提取工藝的研究已經(jīng)取得了很大的進展，但是對于小龍蝦野外種群蝦青素的研究國內(nèi)外報道相對較少。宋慶洋[16]等對潛江市小龍蝦蝦青素研究結(jié)果表明潛江小龍蝦蝦殼中蝦青素含量達到148.2 μg·g-1。孫來娣[17]等從南極磷蝦蝦粉中提取蝦青素的實驗結(jié)果顯示，蝦粉中蝦青素含量為179.21 μg·g-1，比本研究中草海小龍蝦蝦青素含量高，這可能是與兩地間環(huán)境因素有關(guān)；何立堅[8]等對明蝦蝦殼中蝦青素的研究結(jié)果顯示，明蝦蝦殼中蝦青素含量為38.285 μg·g-1；徐煜[9]等從雨生紅球藻中提取蝦青素的實驗結(jié)果顯示，雨生紅球藻中蝦青素的實際含量測定值為2.896%；陳西廣[6]等對海蝦蝦殼中蝦青素進行提取，實驗結(jié)果表明海蝦蝦殼中蝦青素含量為45.5 μg·g-1，與本研究中草海小龍蝦蝦青素含量基本一致，說明除環(huán)境因素外，蝦類水產(chǎn)品蝦青素含量可能相差程度不大。

筆者對貴州草海自然水域的小龍蝦不同部位蝦青素含量、蝦青素提取條件進行了研究，單因素實驗結(jié)果顯示，蝦殼中蝦青素的最佳提取條件為：用乙酸乙酯為浸提溶液，料液比為1∶2，置于60 ℃下提取2 h，重復(fù)提取兩次，在此條件下得到最佳提取效果。在蝦殼、蝦肉和內(nèi)臟各部位蝦青素提取含量看，蝦殼中蝦青素的含量最高，4個樣地蝦殼中蝦青素含量分別為西海碼頭(45.28±0.12 μg·g-1)、江家灣(38.24±0.14 μg·g-1)、吳家?guī)r頭(46.18±0.23 μg·g-1)、嘍啰山(42.97±0.26 μg·g-1)，4個樣地蝦肉和內(nèi)臟中也含有少量蝦青素，但是含量遠低于蝦殼中的含量，這也說明了草海小龍蝦蝦青素主要富集在蝦殼中。