組學(xué)技術(shù)在核盤菌研究中的應(yīng)用

孫慧穎，馮杰，梁月，王澤昊，王婷月

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組學(xué)技術(shù)在核盤菌研究中的應(yīng)用

孫慧穎1，馮杰2，梁月1，王澤昊1，王婷月1

1 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866 2 阿爾伯塔省農(nóng)業(yè)部 植物健康實驗室，加拿大阿爾伯塔 埃德蒙頓 T5Y 6H3

孫慧穎, 馮杰, 梁月, 等. 組學(xué)技術(shù)在核盤菌研究中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報, 2019, 35(4): 589–597.Sun HY, Feng J, Liang Y, et al. Application of omics approaches in Sclerotinia sclerotiorum. Chin J Biotech, 2019, 35(4): 589–597.

核盤菌是一種典型的死體營養(yǎng)型植物病原真菌，全球分布且寄主范圍廣泛，嚴(yán)重危害多種植物，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。核盤菌研究主要集中在真菌生物學(xué)及病理學(xué)等方面。近年來，隨著高通量分析技術(shù)的不斷改進(jìn)，多種組學(xué)技術(shù)為系統(tǒng)生物學(xué)研究提供了平臺。文中主要綜述利用多種組學(xué)研究方法在植物病原真菌核盤菌研究中的應(yīng)用及研究進(jìn)展，探討開展植物病原物及病害發(fā)展的系統(tǒng)性研究思路，以期為核盤菌的分子生物學(xué)及致病機(jī)理等研究提供參考，同時也為其他植物病原物及病害系統(tǒng)研究提供理論依據(jù)。

核盤菌，草酸，組學(xué)，致病機(jī)理，分子互作

核盤菌是一種典型的死體營養(yǎng)型真菌，在世界各地引起多種病害，屬于廣泛分布且具毀滅性的植物病原菌之一[1]。核盤菌研究多集中于寄主范圍、生物學(xué)特性、侵染機(jī)制及防控方法等方面。近年來隨著分子生物學(xué)和生物化學(xué)研究方法的發(fā)展，多層面信息資源的整合以及多組學(xué) (Multi-omics) 方法的運用，為探索微生物生物學(xué)等方面奠定基礎(chǔ)[2]。因此，本文主要綜述利用多種組學(xué)研究方法在植物病原真菌核盤菌研究中的應(yīng)用及研究進(jìn)展，探討針對植物病原物及病害發(fā)展的系統(tǒng)性研究思路，以期為核盤菌的分子生物學(xué)及致病機(jī)理等研究提供參考，同時也為其他植物病原物及病害系統(tǒng)研究提供理論依據(jù)。

1 核盤菌及其重要性

核盤菌 ((Lib.) de Bary) 屬于真菌界 (Fungi)、子囊菌門 (Ascomycota)、盤菌綱 (Discomycetes)、核盤菌屬 ()[1]。核盤菌寄主范圍廣泛，已知寄主植物超過400種，主要包括雙子葉植物 (如向日葵、大豆、油菜和多種蔬菜)，但部分單子葉植物 (如洋蔥等) 也可被侵染[3]。據(jù)統(tǒng)計，該真菌引起病害60余種，包括最為常見的菌核病、棉腐病、軟腐病、莖腐病等[1]。核盤菌侵染植物的莖蔓、葉片和果實，造成腐爛壞死；在高濕條件下，罹病部位表面密生棉絮狀菌絲體并不斷擴(kuò)大，后期在莖稈及種莢內(nèi)部形成大量菌核[3]。核盤菌病害循環(huán)中越冬菌核在適宜環(huán)境下萌發(fā)形成子囊盤及子囊，釋放大量子囊孢子并隨風(fēng)傳播至寄主組織上萌發(fā)引起初侵染；隨著受侵染的組織 (如花瓣) 散落在葉片和葉鞘上，造成腐爛壞死，其表面密生白色棉絮狀菌絲體，在莖稈及種莢內(nèi)部產(chǎn)生大量菌核以抵抗外界不利環(huán)境并越冬，次年再引起新病害發(fā)生[1]。目前，核盤菌引起的病害防控方法有限，尚缺乏高抗品種，生物防治見效緩慢且受到環(huán)境限制，而化學(xué)防治易造成環(huán)境污染并產(chǎn)生抗藥性等問題[1]。

2 核盤菌的組學(xué)

各種組學(xué)技術(shù)能夠高通量定量分析各種生物分子，監(jiān)測不同生物狀態(tài)下的變異，已廣泛用于微生物系統(tǒng)生物學(xué)研究中，包括測定mRNA轉(zhuǎn)錄水平的轉(zhuǎn)錄組學(xué) (Transcriptomics)、定量蛋白豐度的蛋白質(zhì)組學(xué) (Proteomics)、鑒定小分子細(xì)胞代謝物的代謝組學(xué) (Metabolomics) 等[2]。多組學(xué)整合生物信息學(xué)等方法，為深入了解真菌的生活史和進(jìn)化、真菌與環(huán)境關(guān)系 (如與寄主植物的互作) 等研究提供大量數(shù)據(jù)與信息[4]。隨著核盤菌基因組測序的完成以及基于高通量測序、色譜質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)等組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，核 盤菌分子生物學(xué)的研究已經(jīng)逐步跨入后基因組時代。

2.1 基因組學(xué)

基因組學(xué) (Genomics) 作為一門交叉學(xué)科，包括基因組的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化等諸多方面[5]，其研究對微生物學(xué)及生命科學(xué)產(chǎn)生了重大影響[6]。其中，真菌基因組計劃 (1KFG) 的開啟為真菌遺傳與進(jìn)化的研究提供基礎(chǔ)[5]。核盤菌基因組研究始于2005年，并完成初步注釋。核盤菌 (菌株1980) 的基因組約為38.3 Mb (圖譜大小39.6 Mb，ASM14694v2)；GC含量約40%，低于同類真菌，而外顯子比內(nèi)含子GC含量高6%。基因組含有約1.4萬個預(yù)測基因，同屬于盤菌亞門的其他真菌則含有約1.1萬個，這種差異源于其含有大量小于100個氨基酸的預(yù)測蛋白[7]。此外，核盤菌的線粒體基因組 (NC_035155.1) 約為128.8 kb，為深入研究基因組結(jié)構(gòu)組成及進(jìn)化等提供參考[8]。另外，基因組含有7.7%的重復(fù)序列，這可能影響基因組結(jié)構(gòu)及功能[7]。核盤菌編碼基因參與真菌發(fā)育 (如有性生殖、子實體發(fā)育及孢子產(chǎn)生) 和致病機(jī)制 (如草酸合成、肽酶的分泌及效應(yīng)蛋白等)，也與進(jìn)化、代謝、信號途徑相關(guān)[7]。比較基因組分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)大量分泌蛋白參與植物細(xì)胞氧化還原反應(yīng)等[9]，核盤菌通過草酸調(diào)控植物氧化還原動態(tài)平衡 (Redox homeostasis) 引起侵染[10]。核盤菌具有非典型的雙速基因組 (Two-speed genome) 特點，能夠利用轉(zhuǎn)座和重復(fù)序列誘導(dǎo)的點突變 (Repeat-induced point mutation，RIP) 促進(jìn)分泌蛋白的突變[11]。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

轉(zhuǎn)錄組學(xué) (Transcriptomics) 聚焦從RNA水平研究基因表達(dá)及調(diào)控規(guī)律，對揭示真菌與植物的互作及致病性等機(jī)制具有重要意義[12]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)主要包括cDNA文庫、表達(dá)序列標(biāo)簽文庫 (Expressed sequence tags，EST)[13]、DNA微陣列技術(shù) (DNA microarray)[14]和RNA測序技術(shù) (RNA-seq)[15]等。隨著轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的興起，近年來在核盤菌發(fā)育和致病等研究中得到了普遍應(yīng)用。核盤菌的基因組中含有330個轉(zhuǎn)錄因子 (TFs) 基因，69%在cDNA文庫或寡核苷酸芯片雜交出現(xiàn)，其中12個轉(zhuǎn)錄因子僅在核盤菌中特異性表達(dá)[7]。通過比較菌絲及罹病組織的cDNA文庫發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁降解酶和絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 信號途徑等參與核盤菌的發(fā)育與侵染[16]。罹病植物組織及侵染結(jié)構(gòu)的EST分析表明，不同基因 (如草酰乙酸水解酶OAH) 在致病過程中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式各異[17]。利用EST及microarray分析發(fā)現(xiàn)，部分核盤菌預(yù)測分泌蛋白參與真菌發(fā)育及侵染后寄主的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[9]。另外，通過cDNA抑制消減雜交 (SSH) 或microarray對核盤菌與寄主植物互作機(jī)理研究表明，代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞防御等功能因子參與寄主防衛(wèi)反應(yīng)[18-19]。同時，在草酸氧化酶 (OxO) 轉(zhuǎn)基因大豆microarray分析中也發(fā)現(xiàn)抗病反應(yīng)基因 (如細(xì)胞色素P450) 被誘導(dǎo)表達(dá)[20]。此外，非編碼RNAs (ncRNAs) 包括長鏈非編碼RNA (lncRNAs) 和小非編碼RNA (sncRNAs)，在真核生物中廣泛存在并參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、分化與發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)等[21]。通過高通量RNA-Seq方法發(fā)現(xiàn)lncRNAs參與核盤菌侵染所引起的植物應(yīng)激反應(yīng)與調(diào)控[22]，部分sncRNA參與真菌發(fā)育調(diào)控[23]。比較不同抗性植物轉(zhuǎn)錄組變化揭示大量基因參與病原識別、茉莉酸及乙烯信號及病程相關(guān)蛋白等寄主反應(yīng)[24]，特別是草酸能夠誘導(dǎo)鐵蛋白同源物表達(dá)[20]。研究也發(fā)現(xiàn)寄主油菜利用乙烯調(diào)控氧化還原動態(tài)平衡獲得誘導(dǎo)抗性[25]，并通過水化酶等因子協(xié)助病原菌定殖及調(diào)控防衛(wèi)反應(yīng)[26]。

2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué) (Proteomics) 是指在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)、結(jié)構(gòu)和功能等[27]。隨著基因組計劃及反向遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組逐漸成為真菌生活史、致病機(jī)理與分子互作等領(lǐng)域的主要研究手段[28]。目前，雙向凝膠電泳 (Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)、質(zhì)譜 (Mass spectrometry, MS)、同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù) (Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ) 等逐步用于核盤菌蛋白組學(xué)研究[27–29]。應(yīng)用2-DE和ESI-q-TOF MS/MS首次分析核盤菌蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)，菌絲體蛋白主要與代謝和能量產(chǎn)生相關(guān)，分泌蛋白具有細(xì)胞壁降解酶功能且參與致病[30]。菌絲細(xì)胞壁含有大量細(xì)胞壁合成酶 (如纖維素酶和果膠裂解酶等)，但菌核細(xì)胞壁蛋白在形成中并未發(fā)生明顯變化[31]。菌核作為逆境存活結(jié)構(gòu)及病害初侵染源在真菌生活史及病害循環(huán)中具有重要作用[1]。通過對不同發(fā)育階段菌核蛋白質(zhì)組變化分析，脂類及次生代謝功能蛋白參與早期發(fā)育，而碳水化合物代謝則在發(fā)育后期顯著增加[32]；菌核滲出液作為菌核發(fā)育期主要特征，蛋白組分析表明碳水化合物代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等參與分泌液形成[33]。利用生物信息學(xué)方法在基因組水平上預(yù)測的分泌蛋白在菌核滲出液及分泌物中均有發(fā)現(xiàn)[9,30,33]。此外，在蛋白質(zhì)組水平分析核盤菌侵染的寄主反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，光合作用、激素信號及抗氧化等蛋白與植物應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)[34]，而氧化還原動態(tài)平衡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等參與植物抗性反應(yīng)[35]，并調(diào)控寄主植物細(xì)胞程序性死亡[36]。草酸作為核盤菌致病因子介導(dǎo)寄主反應(yīng)[10]，在蛋白質(zhì)組水平發(fā)現(xiàn)能夠抑制水楊酸信號途徑但不影響NADPH氧化酶參與的氧化還原動態(tài)平衡[37]，同時通過草酸積累調(diào)控不同菌齡的菌絲毒性[38]。

2.4 代謝組學(xué)

代謝組學(xué) (Metabolomics) 研究生命活動過程中代謝物、小分子化合物及代謝產(chǎn)物的變化，并尋找代謝物與表型的關(guān)聯(lián)性[39]。真菌次生代謝物的產(chǎn)生過程復(fù)雜并與形態(tài)發(fā)育等相關(guān)，例如代謝聚酮化合物 (PK)、非核糖體肽 (NRPS)、萜烯(Terpenes) 和吲哚生物堿 (Indole alkaloids) 等[40]。核盤菌基因組含有參與氨基酸合成及線粒體功能的初級代謝基因 (如NADH脫氫酶)，同時具有 (非特異性) 毒素和其他次級代謝產(chǎn)物關(guān)鍵酶基因[7]。草酸作為非特異性毒素參與核盤菌侵染及寄主反應(yīng)調(diào)控[10]，通過高效液相色譜 (HPLC) 分析發(fā)現(xiàn)草酸合成與碳水化合物(如葡萄糖、阿拉伯糖及木聚糖等) 和有機(jī)酸 (琥珀酸、蘋果酸、草酰乙酸) 等次生代謝物相關(guān)[41]。另外，核盤菌含有的生物堿及異香豆素 (Isocoumarins) 等次生代謝物具有細(xì)胞毒素活性[42]，聚胺 (Polyamine) 影響分生孢子及菌核的發(fā)育[43–44]，選擇性毒素核盤菌素 (Sclerin) 能夠引起寄主植物壞死與褪綠[45]。代謝組學(xué)研究也有助于闡明植物對核盤菌的抗性機(jī)制[46]，例如，運用氣相色譜-質(zhì)譜 (GC-MS) 聯(lián)用技術(shù)發(fā)現(xiàn)向日葵抗性與糖類、有機(jī)酸、脂肪酸等代謝相關(guān)[47]；菜豆抗性品種也含有氨基酸和植保素等代謝物[48]；苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 活性及植保素異黃酮的變化反映大豆抗病機(jī)制差 異[49]；酚類化合物和木質(zhì)素參與向日葵防衛(wèi)反 應(yīng)[50]；擬南芥通過脂類代謝參與寄主反應(yīng)[51]；硫代葡萄糖苷和亞麻薺素 (Camalexin) 也與防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)[52]。

2.5 功能及病理基因組學(xué)

功能基因組 (Functional genomics) 主要基于高通量基因組分析策略在系統(tǒng)水平上研究基因功能[53]，病理基因組學(xué) (Pathogenomics) 則關(guān)注病原菌的致病機(jī)理及其相關(guān)因子的功能與分子互作等[54]。核盤菌通過菌核萌發(fā)和有性生殖形成的子囊孢子造成病害發(fā)生與流行[55]，表明菌核在真菌生活史及病害循環(huán)中發(fā)揮重要作用[1]。作為典型的同宗配合子囊真菌，交配型基因編碼的產(chǎn)物是有性生殖的重要調(diào)控因子[55]。核盤菌交配型基因座融合并相連，包括、、和，并存在與交配型轉(zhuǎn)換相關(guān)的染色體倒位現(xiàn)象[7,56]。其中，交配型、和基因缺陷型突變體能夠形成產(chǎn)囊體但無法形成子囊盤，而基因突變則延緩菌核萌發(fā)并影響子囊盤形態(tài)及子囊孢子發(fā)育[55]。參與有性生殖調(diào)控的叉頭框蛋白 (SsFKH1) 影響核盤菌發(fā)育及致病性[57]；而另一蛋白 (Ss-FoxE2) 只與子囊盤的形成有關(guān)卻不影響致病性[58]。此外，菌核的發(fā)育受到多種蛋白影響，其中特異性蛋白 (Ssp1和Ssp2) 參與菌核形成[59–60]，黑色素合成蛋白 (Scd1和Thr1) 與抗逆性相關(guān)[61]。

核盤菌通過草酸調(diào)控寄主的氧化還原狀態(tài)并引起侵染[10]。草酸合成相關(guān)的草酰乙酸乙酰水解酶 (OAH) 影響核盤菌形態(tài)建成和毒性[62]，草酸脫羧酶 (OxDC) 影響附著孢發(fā)育及初侵染[63]。另外，活性氧 (ROS) 參與的氧化還原動態(tài)平衡是核盤菌引起病害的重要調(diào)控因子[10]，如NADPH氧化酶 (SsNox) 影響草酸產(chǎn)生及菌核發(fā)育[64]；過氧化氫酶 (SCAT1) 缺失引起菌絲分支及菌核發(fā)育異常且毒性降低[65]；超氧化物歧化酶 (SsSOD1) 影響真菌毒性但與草酸及菌核的產(chǎn)生無關(guān)[66]，而谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 (Ss-Ggt1) 與菌核和附著孢發(fā)育及寄主互作相關(guān)[67]。

植物病原真菌通過分泌蛋白調(diào)控寄主反應(yīng)建立侵染[11]，利用單分子實時測序技術(shù) (Single molecule real-time sequencing technology) 在基因組分析中鑒定了70個候選效應(yīng)因子[11]，轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平也發(fā)現(xiàn)大量分泌蛋白 (如效應(yīng)因子) 參與致病性或毒性[30,68]。例如，分泌蛋白阿拉伯呋喃糖酶 (Ssaxp) 影響真菌毒性[69]；富含半胱氨酸蛋白 (SsCVNH)影響菌核發(fā)育及毒性[68]，而富含半胱氨酸蛋白 (SsSSVP1) 卻參與植物壞死反應(yīng)[70]；未知功能分泌蛋白 (ssv263) 與毒性有 關(guān)[71]，并用于植物病害診斷及流行監(jiān)測[72]；與附著孢形成相關(guān)的分泌蛋白 (Ss-Caf1) 也影響致病性及菌核發(fā)育[73]；重排熱點蛋白 (Ss-Rhs1) 基因沉默導(dǎo)致菌落形態(tài)異常及毒性降低[74]；木聚糖蛋白酶 (SsXyl1) 基因缺失引起菌核異常并降低毒性[75]。

3 展望

核盤菌作為一種毀滅性的植物病原真菌，在世界范圍引起多種植物病害并造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。核盤菌引起的病害防控目前主要依賴化學(xué)殺菌劑，但隨著抗藥性、環(huán)境污染等問題出現(xiàn)及消費安全意識的提高，對經(jīng)濟(jì)、高效、環(huán)境友好的防控方案需求日益突出。了解植物病原真菌生物學(xué)基礎(chǔ)，探索病害發(fā)生與發(fā)展規(guī)律，挖掘致病相關(guān)因子等研究為植物病害防控策略制定奠定基礎(chǔ)。隨著對復(fù)雜的生物系統(tǒng)的認(rèn)知逐漸深入，生物學(xué)研究已經(jīng)從分子水平發(fā)展到系統(tǒng)水平[76]。系統(tǒng)生物學(xué)(Systems biology) 作為多學(xué)科交叉研究領(lǐng)域，建立基于組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析策略，揭示生物系統(tǒng)的組成結(jié)構(gòu)與動態(tài)，代替僅關(guān)注單一分子或技術(shù)的傳統(tǒng)研究方法[77]。因此，整合多組學(xué)數(shù)據(jù)信息并運用系統(tǒng)生物學(xué)研究方法論，更有助于全面認(rèn)識植物病原真菌及其引起的植物病害系統(tǒng)。以基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)為基礎(chǔ)的組學(xué)技術(shù)在核盤菌研究中取得進(jìn)展(圖1)，為深層次研究核盤菌及其致病機(jī)制等提供了科學(xué)依據(jù)，但不同組學(xué)水平發(fā)掘的分子機(jī)理及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等仍然有待梳理。隨著核盤菌相關(guān)組學(xué)基礎(chǔ)研究不斷開展，加之生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，核盤菌的系統(tǒng)生物學(xué)及分子調(diào)控互作機(jī)制等方面需要特別關(guān)注以下幾個方面：擴(kuò)展組學(xué)研究內(nèi)涵，如利用脂類組學(xué) (Lipidomics)、糖組學(xué) (Glycomics) 及互作組學(xué) (Interactomics) 等；加強(qiáng)對真菌的基礎(chǔ)與分子生物學(xué)方面的大數(shù)據(jù)分析，通過構(gòu)建分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以發(fā)掘相關(guān)因子 (如效應(yīng)因子) 及其功能；探索植物寄主與病原真菌間的識別與應(yīng)答機(jī)理，了解二者互作及協(xié)同進(jìn)化關(guān)系；完善植物及真菌的遺傳操作技術(shù)，包括引入基因編輯CRISPR/Cas系統(tǒng)。通過上述方面的系統(tǒng)性研究，不僅有助于闡釋核盤菌及其引起的病害系統(tǒng)研究，也為探索其他真菌及植物病害提供研究策略參考。

圖1 核盤菌的多組學(xué)分析體系

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1 College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning, China 2 The Alberta Plant Health Lab, Alberta Agriculture and Forestry, Edmonton, Alberta T5Y 6H3, Canada

is a typical necrotrophic plant pathogenic fungus that distributes worldwide and causes severe diseases on a broad-range of plant species. Studies onhave been mainly focused on biology and pathology. The development of high-throughput technologies enabled multi-omics approaches for systems biology. This review summarizes current researches onandproposes systemic strategies for understanding its biology and pathology, to provide novel insights and references for further investigation on molecular biology and pathogenesis of the pathogenic fungi and the pathosystems.

, oxalic acid, omics, pathogenesis, molecular interactions

10.13345/j.cjb.180361

September 8, 2018;

December 4, 2018

Scientific Research Foundation for the Introduced Talents of Shenyang Agricultural University (No. 20153040), Program for Liaoning Excellent Talents in University (No. LR2015058).

Yue Liang. Tel/Fax: +86-24-88487148; E-mail: yliang@syau.edu.cn

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動費項目 (No. 20153040)，遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計劃 (No. LR2015058) 資助。

2019-01-08

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190107.1310.004.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)