高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地山海螺中黨參炔苷的含量及指紋圖譜

王景雁，馬秉智，蘭 頤，王海洋，李 棟，赫 軍，陸 進(jìn)，劉 曉?

（1.中日友好醫(yī)院 藥學(xué)部，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；3.山東達(dá)因海洋生物制藥股份有限公司，威海 264300）

山海螺為桔?？浦参镅蛉镃odonopsis lanceolata（Sieb.et Zucc）Trautv 的干燥根。 味甘性溫，歸心、肺經(jīng)，功能益氣養(yǎng)陰、解毒消腫、排膿、通乳。 用于神疲乏力、頭暈頭痛、肺癰、瘡癤腫毒、喉蛾、瘰疬、產(chǎn)后乳少、白帶、毒蛇咬傷[1]。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山海螺具有耐缺氧和抗疲勞[2，3]及增強(qiáng)免疫的作用[4]，鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥和提高記憶力的作用[5]，抗腫瘤作用[6]，抗炎、抗菌和鎮(zhèn)咳作用[7]，抗氧化[8，9]，催乳作用[10]，抗突變活性和調(diào)節(jié)血脂作用[11，12]，保肝醒酒作用[13]。筆者通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，山海螺藥材中黨參炔苷含量很高[14]，而且同屬植物黨參也以黨參炔苷作為質(zhì)控指標(biāo)[15]，故本文以黨參炔苷作為質(zhì)控指標(biāo)，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定了13 個(gè)不同產(chǎn)地山海螺樣品，為山海螺的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1260 高效液相色譜儀 （包括DAD 檢測(cè)器，四元高壓梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，美國(guó)安捷倫公司）；Sartorius CPA225D 型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；DT5-3 型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；HH-S4 型電熱恒溫水浴鍋 （北京科偉家興儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

山海螺樣品產(chǎn)地見表1，鑒定為桔?？浦参镅蛉镃ondonopsis lanceolata （Sieb.et Zucc.）Trautv.的干燥根。 黨參炔苷對(duì)照品（中日友好醫(yī)院自制，純度≥99%），乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher 公司）；甲醇為分析純；水為高純水。

山海螺供試品由中日友好醫(yī)院門診中藥房提供（購(gòu)自北京鶴延齡藥業(yè)發(fā)展有限公司，產(chǎn)地：河北，批號(hào)：140941）

2 方法與結(jié)果

2.1 不同產(chǎn)地山海螺中黨參炔苷的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色 譜 柱：Agilent Eclipse plus C18 （4.6mm×100mm，3.5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫50min（以乙腈比例表示），0～30min（5%～35%），30～50min（35%～100%）；流 速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量10μl。 色譜圖見圖1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取黨參炔苷對(duì)照品10.14mg，置于50ml 量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備

稱取山海螺樣品粉末5g（河北，過(guò)六號(hào)篩），精密稱定，置于100ml 錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定質(zhì)量，超聲處理30min（頻率100kHz，溫度40℃），冷卻至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，離心，取上清液，水浴蒸干，加甲醇溶解，定容至25ml，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.1.4 空白對(duì)照品溶液的制備

精密移取甲醇50ml，置于100ml 三角瓶中，按供試品溶液的制備方法制成空白對(duì)照溶液。

2.1.5 線性關(guān)系考查分別精密移取對(duì)照品溶液1μl、5μl、10μl、15μl、20μl，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。 以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到黨參炔苷的回歸方程為y=37.067x+20.901（r=0.9999）。 結(jié)果表明，黨參炔苷質(zhì)量濃度在10.1～202.0μg/ml 范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.1.6 其它方法學(xué)考查

圖1 HPLC 圖（1-黨參炔苷）

表1 樣品產(chǎn)地、含量測(cè)定及HPLC 指紋圖譜相似度分析結(jié)果（n=3）

表2 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表4 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別考查精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率，結(jié)果分別見表2 和表3。

2.1.7 樣品含量測(cè)定

分別稱取13 個(gè)不同產(chǎn)地的山海螺樣品5 g （過(guò)六號(hào)篩），精密稱定，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中黨參炔苷的含量，結(jié)果見表1。

2.2 不同產(chǎn)地山海螺HPLC 指紋圖譜

2.2.1 色譜條件

同山海螺含量測(cè)定“2.1.1 ”項(xiàng)下色譜條件。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

同山海螺含量測(cè)定“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液的制備。

2.2.3 供試品溶液的制備

同山海螺含量測(cè)定“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備。

2.2.4 其他方法學(xué)考查

取S5 號(hào)山海螺樣品，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別考查精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性，經(jīng)國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A 版）進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見表4。由結(jié)果可知，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。

2.2.5 山海螺樣品測(cè)定

取13 個(gè)產(chǎn)地山海螺樣品，分別按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照“2.1.1 ”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄50mim 色譜圖。 根據(jù)樣品溶液HPLC 提供的相關(guān)參數(shù)，確定山海螺共有峰為18 個(gè)，見圖2。

2.2.6 指紋圖譜相似度計(jì)算

圖2 不同產(chǎn)地山海螺HPLC 指紋圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜R

將13 個(gè)樣品的色譜圖導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì) 《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A 版），設(shè)定樣品S5 為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法計(jì)算，進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，選取“時(shí)間窗寬度”為0.1min，進(jìn)行譜峰自動(dòng)匹配。 結(jié)果見圖2 和表1，由結(jié)果可知，13 個(gè)樣品的指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.848～0.994 范圍內(nèi)。

3 討論

山海螺的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，黃昌杰[16]、王文永[17]采用HPLC 法測(cè)定了山海螺中紫丁香苷的含量，武佳等采用HPLC 法測(cè)定了四葉參中四葉參皂苷的含量[18]，趙燕燕等采用HPLC 法測(cè)定了泰山四葉參的指紋圖譜[19]，陳恒沖[20，21]用薄層色譜（TLC）法鑒別輪葉黨參藥材，以高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定藥材中輪葉黨參皂苷的含量；又采用高效液相色譜法測(cè)定了東北地產(chǎn)輪葉黨參的指紋圖譜。綜合分析，上述文獻(xiàn)中沒有以黨參炔苷作為質(zhì)控制指標(biāo)的，而且用于山海螺指紋圖譜研究的樣品產(chǎn)地也有限，因此，筆者將黨參炔苷作為山海螺的質(zhì)控指標(biāo)，采用HPLC 法測(cè)定13個(gè)不同產(chǎn)地山海螺中黨參炔苷的含量及指紋圖譜，是很有意義的。該方法簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，可作為山海螺的質(zhì)量控制方法，為山海螺的質(zhì)量控制提供了一定的依據(jù)。 通過(guò)測(cè)定13 個(gè)不同產(chǎn)地山海螺中黨參炔苷的含量可知，不同產(chǎn)地的樣品差異較大，其中，安徽六安的含量最高，廣東茂名的含量最低，分析其原因，可能與產(chǎn)地、采收季節(jié)、生長(zhǎng)年限、是否野生有關(guān)，但具體原因有待進(jìn)一步研究。

供試品溶液的制備方法，本文考察了超聲法、回流法、煎煮法3 種提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲法與回流法、煎煮法提取效率無(wú)顯著差異，但超聲法操作簡(jiǎn)便，可控性強(qiáng)，故選擇超聲提取法； 然后筆者對(duì)超聲提取時(shí)間（15、30、45min）進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30min 和45min 提取效率無(wú)顯著性差異，均高于15min，，故選擇超聲提取時(shí)間30min；最后筆者簡(jiǎn)單地對(duì)提取溶劑（甲醇、水）進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)甲醇的提取效率遠(yuǎn)高于水，故選用甲醇為提取溶媒。

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，筆者考察了210nm、254nm、280nm、320nm、380nm 共5 個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，210nm 時(shí)山海螺HPLC 色譜圖中各色譜峰面積較大且分離度良好，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇210nm。