培養(yǎng)程序及培養(yǎng)基成分對茄子優(yōu)選植株花藥培養(yǎng)的影響

王 暢，崔群香，朱海佳，周 禎，陳丹陽，汪 輝，劉方嬌

（金陵科技學(xué)院，江蘇 南京 211169）

茄子（Solanum melongenaL.），茄科茄屬1年生草本植物，我國茄子栽培面積占世界總面積的52.2%[1]，其嫩果具有較高的營養(yǎng)和保健價值[2]。研究證明茄子可采用花藥培養(yǎng)，花粉細(xì)胞能夠通過胚狀體發(fā)生途徑產(chǎn)生再生植株[3-4]，甚至能夠產(chǎn)生自發(fā)加倍的雙單倍體（DH）植株，這為快速創(chuàng)制茄子新種質(zhì)提供了一條高效途徑。但目前茄子花藥培養(yǎng)體系尚未完善，存在污染率高、出胚率以及胚胎成苗率低等問題，且諸多因素如消毒技術(shù)、培養(yǎng)基成分、基因型等都會影響上述問題。因此，從上述影響因素入手，篩選最佳消毒方法、調(diào)整培養(yǎng)基成分，優(yōu)化茄子花藥培養(yǎng)程序是花藥培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于育種實(shí)踐時首先需要解決的問題。

采用品種間聚合雜交或多父本花粉授粉等方式，擴(kuò)大花藥供體的遺傳基礎(chǔ)，才能更有效地創(chuàng)制出聚合多種優(yōu)良性狀的茄子新種質(zhì)。本試驗(yàn)的目的就是在解決了花藥初代培養(yǎng)污染率高的問題的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并配制誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和壯胚培養(yǎng)基等，對幾個茄子商品種的聚合雜交后代進(jìn)行花藥培養(yǎng)，試驗(yàn)培養(yǎng)基成分以及培養(yǎng)程序?qū)ε郀铙w誘導(dǎo)率和正常生長的作用，以期利用花藥培養(yǎng)結(jié)合聚合雜交技術(shù)，快速獲得優(yōu)良茄子新種質(zhì)。

1 材料和方法

試驗(yàn)于2016年12月—2018年6月于金陵科技學(xué)院園藝試驗(yàn)站進(jìn)行。于2016年12月—2017年5月進(jìn)行商品種栽培和聚合雜交，種果于2017年7月采收，雜種于2017年7月底播種，優(yōu)良雜交后代選擇于2017年10—11月進(jìn)行，花藥培養(yǎng)于2017年8月—2018年6月進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 花藥

選用果實(shí)形狀符合長江流域市場消費(fèi)習(xí)慣的40個紫長茄商品種，2016年冬季育苗，春季定植在金陵科技學(xué)院園藝試驗(yàn)站，并在開花后采集40個品種的混合花粉，對所有品種的茄花進(jìn)行授粉，每個品種至少保證坐住1個果實(shí)，以獲得聚合雜交的后代。從聚合雜交后代中，篩選出以自身表現(xiàn)好的編號為16（鄂優(yōu)二號）、22（農(nóng)百萬—黑帥）、35（迎春一號）、36（鄂優(yōu)春韻）的4個商品種為母本的綜合性狀優(yōu)良的單株若干，采集所有入選茄子植株上的適宜花蕾作為試驗(yàn)材料用于花藥培養(yǎng)。植株篩選的標(biāo)準(zhǔn)是果皮紫色亮麗、果實(shí)形狀好、果長28 cm以上、果徑3.5 cm以上、單株商品果數(shù)超過10個、果實(shí)發(fā)育快。

1.1.2 培養(yǎng)基

試驗(yàn)設(shè)計(jì)了誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、成熟培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基具體成分及含量見表1、表2。

1.1.3 儀器

智能培養(yǎng)箱（寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)的PRX-1000 C型人工氣候箱）。

1.2 試驗(yàn)方法

采集抱合花瓣頂端距離萼片裂口±2 mm的花蕾，4 ℃低溫下處理2 d后進(jìn)行表面消毒和接種。消毒前撕去花蕾的萼裂片但保留萼筒，放入無菌三角瓶中，先用75%酒精消毒2 min，倒掉酒精后，加入1滴吐溫-80，然后加入6.5%的次氯酸鈉，搖動10～15 min后倒掉，并用無菌水沖洗花蕾3～5次，無菌紙吸干水分備用。

1.2.1 2種培養(yǎng)基組合對茄子花藥培養(yǎng)胚狀體成苗的影響

將表面消毒過的花蕾，放在無菌濾紙上剝?nèi)』ㄋ?，接種到直徑6 cm，裝有15 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)皿中，每種誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種10皿，每皿接種20～30個花藥（大約4～5個花蕾）；36 ℃黑暗條件下熱處理6 d后轉(zhuǎn)至25 ℃光照培養(yǎng)。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)了2種誘導(dǎo)培養(yǎng)基、1種分化培養(yǎng)基和2種胚成熟培養(yǎng)基，組成了2種培養(yǎng)基組合進(jìn)行茄子花藥培養(yǎng)。組合1：花藥→誘導(dǎo)培養(yǎng)基1（36 ℃黑暗培養(yǎng)6 d，25 ℃光暗培養(yǎng)9 d）15 d→胚分化培養(yǎng)基20～40 d→胚狀體成熟培養(yǎng)基1（無激素）中20 d→胚狀體生根培養(yǎng)基；組合2：花藥→誘導(dǎo)培養(yǎng)基2（36 ℃黑暗培養(yǎng)6 d，25 ℃光暗培養(yǎng)9 d）15 d→胚分化培養(yǎng)基20～40 d→胚狀體成熟培養(yǎng)基2（降低激素濃度）中20 d→胚狀體生根培養(yǎng)基。當(dāng)生根的胚狀體形成具有2～3片真葉的植株時進(jìn)行煉苗移栽，成活的植株移栽到土壤中或大花盆中直至開花結(jié)果。

除熱處理為高溫黑暗條件外，其余培養(yǎng)過程的培養(yǎng)條件一致，均為25 ℃，16 h光照，光照強(qiáng)度調(diào)節(jié)至最高。

分化培養(yǎng)結(jié)束時，統(tǒng)計(jì)其中花藥產(chǎn)生胚狀體的培養(yǎng)皿百分率、出胚的花藥百分率（出胚的花藥百分率=每組合出胚花藥總數(shù)/接種花藥總數(shù)×100%），觀察并記錄各培養(yǎng)過程中胚狀體產(chǎn)生、發(fā)育和生根成苗狀況，以及最終移栽成活植株情況。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基成分對胚狀體誘導(dǎo)和發(fā)育的影響

為提高胚狀體誘導(dǎo)頻率和成苗率，根據(jù)1.2.1培養(yǎng)中胚狀體誘導(dǎo)和發(fā)育的結(jié)果，調(diào)整培養(yǎng)基的配方（表2）：為消除1.2.1中基本培養(yǎng)基對誘導(dǎo)結(jié)果的影響，誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用NLN基本培養(yǎng)基，但不添加絲氨酸、谷胱甘肽和谷氨酰胺等3種固體有機(jī)物，僅對蔗糖或葡萄糖以及聚乙二醇的濃度進(jìn)行了調(diào)整，設(shè)計(jì)了G1、G2、G3、S1、S2和S3等6種誘導(dǎo)培養(yǎng)基；為了減輕胚狀體愈傷化和水漬化程度，在統(tǒng)一采用NLN培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，降低分化培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素的濃度，設(shè)制了B2、K1和K2等3種分化培養(yǎng)基；分化培養(yǎng)基上產(chǎn)生的胚狀體及其花藥隨機(jī)轉(zhuǎn)入胚成熟培養(yǎng)基1或2；成熟胚狀體轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。

每種誘導(dǎo)培養(yǎng)基至少試驗(yàn)3次，每次試驗(yàn)至少接種10皿，每皿接種4～5個花蕾的花藥。每種誘導(dǎo)培養(yǎng)基的花藥隨機(jī)轉(zhuǎn)入3種不同的分化培養(yǎng)基，每種分化培養(yǎng)基至少接種3皿，至少3次重復(fù)試驗(yàn)。分化培養(yǎng)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)每次試驗(yàn)6種不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基或3種不同分化培養(yǎng)基中接種花藥的出胚百分率（出胚百分率＝每種培養(yǎng)基中出胚花藥總數(shù)/接種花藥總數(shù)×100%），排除培養(yǎng)過程中的花藥或培養(yǎng)基污染等因素，保證每種配方獲得至少2次重復(fù)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，并利用Excel軟件進(jìn)行包含2次重復(fù)的單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組合對茄子胚狀體誘導(dǎo)和成苗的影響

熱激結(jié)束后，大多數(shù)花藥顏色由黃綠色變?yōu)樽睾稚?0%以上的花藥膨大，少量花藥保持原來大小。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基1中誘導(dǎo)培養(yǎng)的花藥，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基15 d后，其中2個培養(yǎng)皿中的部分花藥產(chǎn)生了形態(tài)比較正常的胚狀體（圖1-1），甚至有個別胚狀體不僅發(fā)育出側(cè)根，而且產(chǎn)生了真葉，但胚狀體數(shù)量較少；而在誘導(dǎo)培養(yǎng)基2中誘導(dǎo)培養(yǎng)的花藥，則在轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基17 d后，1個培養(yǎng)皿中的部分花藥才出現(xiàn)胚狀體，胚狀體數(shù)量多，但發(fā)育階段較晚，多數(shù)處于心形胚期或之前，少量胚狀體有胚根產(chǎn)生，但胚軸膨大腫脹，沒有發(fā)育出葉片（圖1-2）。同一花藥或不同花藥誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚狀體都存在發(fā)育速度不同、發(fā)育階段不一致的現(xiàn)象（圖1-3）。

表1 不同培養(yǎng)基的成分及含量

表2 調(diào)整后各種培養(yǎng)基的成分及含量

分化培養(yǎng)基上產(chǎn)生的胚狀體，大部分胚軸腫脹，轉(zhuǎn)入胚成熟培養(yǎng)基1后胚狀體容易褐變死亡；轉(zhuǎn)入胚成熟培養(yǎng)基2中的幼嫩胚狀體的胚軸甚至愈傷化，最終無法長成能夠移栽成活的植株。在分化培養(yǎng)基上即使產(chǎn)生真葉和胚根的成熟胚狀體，在無激素的胚成熟培養(yǎng)基1中也多數(shù)褐化死亡或生長發(fā)育停滯，只有及時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基后，才誘導(dǎo)少量形態(tài)正常的胚狀體繼續(xù)發(fā)育，并最終移栽成活。

由表3可知，1.85%～3.33%的接種花藥被誘導(dǎo)產(chǎn)生了胚狀體，其中含蔗糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基1中的花藥產(chǎn)生胚狀體總數(shù)少但成熟胚狀體數(shù)量多，胚狀體發(fā)育快，最終成苗率高（28.6%）；而含葡萄糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基2中的花藥產(chǎn)生的胚狀體數(shù)量多，但發(fā)育速度慢，最終成苗率低（3.3%）；因此，提高出胚花藥百分率和胚狀體成苗率，是茄子花藥培養(yǎng)能夠應(yīng)用于茄子育種實(shí)踐的關(guān)鍵。

追蹤觀察發(fā)現(xiàn)，成活苗的頂芽往往多個并生，只有除去多余的頂芽，保留的頂芽才能進(jìn)一步發(fā)育至開花坐果，說明這類植株來源的胚狀體，可能是多個細(xì)胞起源的。隨后試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單一胚狀體發(fā)育成的植株，存在分株或分支現(xiàn)象（圖2），甚至在分株性狀上存在差異（圖2-2），與前述胚狀體多細(xì)胞起源的推測相符。圖2-2顯示，1個胚狀體發(fā)育來的植株存在2個分株，2個分株在莖葉顏色方面存在差異，且2個分株都包含2個或3個分枝。據(jù)此推斷，胚狀體多細(xì)胞起源，每個分株可能來源于不同的花粉細(xì)胞，且各分株中的分枝可能來源于2細(xì)胞或3細(xì)胞雄配子體中的單倍體細(xì)胞。

分析茄子花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)和發(fā)育的過程，并根據(jù)培養(yǎng)基成分推斷：培養(yǎng)基組合1（程序1）更有利于茄子花藥培養(yǎng)產(chǎn)生移栽成活的再生植株；含葡萄糖的起始培養(yǎng)基更有利于胚狀體的誘導(dǎo)但不利于胚狀體成熟；含蔗糖的起始培養(yǎng)基盡管出胚花藥頻率低，但有利于胚狀體成熟；胚狀體形態(tài)不正?？赡芘c培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑濃度過高或種類不合適有關(guān)。

表3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其與分化和胚成熟培養(yǎng)基組合對茄子花藥胚狀體誘導(dǎo)和發(fā)育的影響

2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基成分對胚狀體誘導(dǎo)和發(fā)育的影響

6種誘導(dǎo)培養(yǎng)基以及3種分化培養(yǎng)基對花藥出胚率的作用見表4，由表4可見培養(yǎng)基成分調(diào)整后，茄子花藥出胚百分率從原來最高3.33%（表3），提高到最低8.1%，最高達(dá)到了12.3%，各培養(yǎng)基間差異不顯著，表現(xiàn)較為一致（表4）；以葡萄糖為碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，茄子花藥出胚率略高于以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基；PEG濃度為10 g/L時，出胚花藥最多；G1、B2分別是出胚花藥百分率最高的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，每個花藥產(chǎn)生的胚狀體數(shù)量顯著增加，平均達(dá)到5個以上。

圖1 茄子胚狀體誘導(dǎo)和植株再生成苗情況

圖2 單個胚狀體發(fā)育的植株

表4 不同培養(yǎng)基成分對花藥胚胎誘導(dǎo)的影響

3 結(jié)論與討論

花藥培養(yǎng)的程序?qū)ε咛グl(fā)育有重要的影響。目前茄子花藥基本沿用Dumas de Vaulx和Chambonnet于1982年建立的程序[5-6]，即花藥接種于培養(yǎng)皿中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在35 ℃黑暗中培養(yǎng)8 d，然后在12 h/12 h光周期和25 ℃中繼續(xù)培養(yǎng)4 d，第12天將花藥轉(zhuǎn)接至R1分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每20 d更新1次培養(yǎng)基，直至從花藥中產(chǎn)生胚胎，將胚胎分離并在V3培養(yǎng)基中培養(yǎng)成小植株。本試驗(yàn)沿用該程序并適當(dāng)調(diào)整，推遲胚胎剝離花藥的時間，建立了優(yōu)化的培養(yǎng)程序，減輕了胚狀體的褐化，促使更多的胚狀體發(fā)育成植株。鑒于發(fā)育階段較早的胚狀體如果脫離了花藥母體，在隨后培養(yǎng)時難以被誘導(dǎo)發(fā)育成苗，因此本試驗(yàn)所建立的培養(yǎng)程序還需要補(bǔ)充或者進(jìn)一步優(yōu)化。

聚乙二醇是一種滲透調(diào)節(jié)劑，能夠促進(jìn)茄子小孢子發(fā)育成胚狀體[4]，Patricia Corral-Martínez等[7]在進(jìn)行茄子游離小孢子培養(yǎng)時證實(shí)：是PEG而不是甘露醇，能顯著增加小孢子胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)。本試驗(yàn)也證實(shí)，茄子花藥初代培養(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2～10 g/L的聚乙二醇，能夠減輕胚狀體的水漬化，大大提高產(chǎn)生胚狀體的花藥頻率，出胚花藥百分率為8.1%～12.3%，考慮到每茄子花蕾中的花藥數(shù)至少5個，則出胚花蕾百分率達(dá)到40%～60%；而在后期分化培養(yǎng)基中添加聚乙二醇則不利于胚狀體誘導(dǎo)。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加蔗糖或葡萄糖，花藥胚狀體誘導(dǎo)率和發(fā)育階段會存在一定的差異。其中添加葡萄糖時胚狀體誘導(dǎo)數(shù)量多，而且早期胚胎多，胚胎可確定來源于花粉細(xì)胞；而添加蔗糖時，也產(chǎn)生較多的子葉期以前的未成熟胚胎。未成熟的早期胚胎直接轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基中褐變嚴(yán)重，分裂素濃度較高的培養(yǎng)基中胚狀體胚軸部位膨大愈傷化，胚狀體難以成苗。因此，如何促使早期胚狀體發(fā)育成熟，就成為影響花藥育種的限制因素之一。

本試驗(yàn)通過降低分化培養(yǎng)基中激素濃度，促進(jìn)了胚狀體成苗，但成苗率仍舊很低，Y XING等[8]在進(jìn)行茄子子葉培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度影響愈傷組織的產(chǎn)生，較低濃度蔗糖能夠抑制愈傷組織形成而有利于不定芽的產(chǎn)生，蔗糖濃度對于茄子花藥產(chǎn)生的幼胚發(fā)育是否也存在類似的影響，值得進(jìn)一步研究；幼胚下胚軸愈傷化也影響花粉胚進(jìn)一步發(fā)育成苗，多次調(diào)整培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑濃度，均未能誘導(dǎo)這種胚胎繼續(xù)發(fā)育。而茄子下胚軸和子葉培養(yǎng)都有很多成功的報(bào)道，能否從形態(tài)不正常的胚胎分離出下胚軸和頂芽，誘導(dǎo)其重新通過器官發(fā)生途徑產(chǎn)生植株，有待進(jìn)一步研究。

茄子花藥培養(yǎng)產(chǎn)生的胚狀體，有單倍體、二倍體和多倍體等不同倍性差異，自交結(jié)實(shí)的二倍體植株，經(jīng)后代性狀穩(wěn)定性判斷為單倍體花粉細(xì)胞起源，結(jié)合胚狀體由脫離花藥的細(xì)胞產(chǎn)生的現(xiàn)象，可推斷本實(shí)驗(yàn)室建立起來的茄子花藥培養(yǎng)程序，誘導(dǎo)出的胚狀體主要是花粉細(xì)胞起源的。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單個胚狀體發(fā)育來的植株，存在分株或分枝現(xiàn)象，根據(jù)分枝或分株的表現(xiàn)，推斷胚狀體可能是多細(xì)胞起源，至于胚狀體是不同的花粉細(xì)胞融合產(chǎn)生，還是同一配子體中的營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞融合產(chǎn)生，尚需要將各個分枝或分株建成單株，并得到自交系，根據(jù)自交后代性狀表現(xiàn)，結(jié)合細(xì)胞學(xué)鑒定，加以確定。

茄子花藥培養(yǎng)技術(shù)要成功應(yīng)用于育種實(shí)踐，重點(diǎn)需要解決3個問題：一是提高胚狀體誘導(dǎo)和發(fā)育成植株的頻率，二是確保胚狀體是單倍體細(xì)胞來源，三是單倍體加倍技術(shù)。單倍體加倍技術(shù)已經(jīng)取得成功[9]，本研究將花蕾胚狀體誘導(dǎo)頻率提高到接近50%，并且獲得了雙單倍體（DH）株系，今后研究重點(diǎn)是確保胚狀體單倍體細(xì)胞起源，以提高茄子單倍體誘導(dǎo)技術(shù)應(yīng)用于育種實(shí)踐的可靠性，大幅度縮短自交系選育的年限，提高茄子雜交品種選育的效率。

綜合上述研究結(jié)果，茄子花藥培養(yǎng)優(yōu)化的培養(yǎng)程序調(diào)整為：花藥→誘導(dǎo)培養(yǎng)基S1培養(yǎng)15 d（36 ℃黑暗條件下培養(yǎng)6 d，25℃光照16 h黑暗8 h培養(yǎng)9 d）→分化培養(yǎng)基B2培養(yǎng)20 d→胚成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d→出胚花藥生根培養(yǎng)20 d→萌發(fā)胚胎生根培養(yǎng)基成苗→煉苗移栽。利用該程序，能夠多次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，并擴(kuò)大了茄子花藥培養(yǎng)的基因型反應(yīng)范圍。