HPV16/18 E6蛋白與小分子抑制劑RITA和姜黃素的結(jié)合模式研究

張?zhí)煲?徐 苗,丁 歡,田菲菲

(西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,中國四川成都610031)

宮頸癌是全球高發(fā)病率和高致死率的婦科惡性腫瘤,嚴(yán)重影響女性的身心健康和生活質(zhì)量[1]。高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus,hrHPV)的持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸上皮細(xì)胞癌變的主要因素[2～4],其中HPV16和HPV18是引起宮頸癌的最常見的兩種亞型,在宮頸癌和宮頸上皮瘤樣病變中的檢出率達(dá)到70%,分別引起宮頸腺癌和宮頸鱗癌[5～6]。此外,研究表明HPV感染也與肛門癌、陰莖癌和口腔癌等癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[7～10]。目前,市場上已有3種針對特定亞型HPV的預(yù)防性HPV疫苗[11～12],但這些疫苗較為昂貴,在發(fā)展中國家尚未普及[13～14]。而且,現(xiàn)階段對已感染HPV的患者仍缺乏有效的治療方法,每年有約27萬人死于宮頸癌,五年的存活率仍維持在60%左右[7,15]。小分子藥物因具有較好的空間分散性、良好的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)和非免疫原性,與傳統(tǒng)細(xì)胞毒性藥物不同,成為治療宮頸癌的先導(dǎo)化合物的研究熱點[16]。

高危型乳頭瘤病毒的早期蛋白E6和E7可改變細(xì)胞內(nèi)信號通路,破壞細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的檢查點,幫助病毒及其宿主細(xì)胞逃避免疫反應(yīng),因而在HPV的致癌特性中起關(guān)鍵作用[17～18]。hrHPV E6最顯著的特性之一是與泛素連接蛋白E6AP、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p53形成三元復(fù)合物,并通過泛素化降解途徑誘導(dǎo)p53的降解,阻止細(xì)胞凋亡,允許受損DNA的復(fù)制和變異的積累,這是hrHPV感染促使細(xì)胞癌變的重要因素[19～22]。通過模擬E6AP的LxxLL基序,一種被命名為pep11**的結(jié)合肽和小分子化合物木犀草素及其衍生物被發(fā)現(xiàn)能夠特異性結(jié)合E6,競爭性抑制E6AP與E6的結(jié)合,從而增加HPV16陽性細(xì)胞的p53蛋白水平并引起細(xì)胞凋亡,表明E6的LxxLL結(jié)合區(qū)具有作為藥物靶點的可行性[23～24]。根據(jù)近期獲得的HPV16 E6/E6AP/p53三元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)[25],我們發(fā)現(xiàn)E6AP與p53都和E6緊密結(jié)合,但E6AP與p53兩者之間幾乎沒有直接作用,因此可以推測,抑制E6與p53的結(jié)合同樣能夠達(dá)到提高p53水平和恢復(fù)細(xì)胞凋亡能力的目的,但以E6的p53結(jié)合區(qū)域作為藥物靶點的研究有待填補(bǔ)。

通過查閱文獻(xiàn),我們發(fā)現(xiàn)一些具有芳香性的化合物[26～29],如白藜蘆醇、紫檀芪等多酚或黃酮化合物,能夠誘導(dǎo)HPV陽性細(xì)胞在G2期積累,而細(xì)胞中野生型p53的存在對G2期的阻滯是必需的[30],提示這些化合物能夠解除hrHPV E6蛋白對p53的抑制作用,有望開發(fā)為治療宮頸癌的藥物。Sangthong等[29]合成的幾種蒽-9,10-二酮衍生物能夠干擾HPV E6表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其中以芐胺為取代基的4-(芐基氨基)-9,10-二氧代-4a,9,9a,10-四氫蒽-1-基4-乙基苯磺酸鹽的IC50值為0.3 μmol/L,顯著高于其他取代基。Sangthong等認(rèn)為這是由于芳香環(huán)的π-π作用相比靜電作用可導(dǎo)致更高的凋亡能力,而支鏈結(jié)構(gòu)可能降低了化合物進(jìn)入靶標(biāo)的能力,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡能力喪失。遺憾的是,該團(tuán)隊并未更深入闡述其分子機(jī)制。我們的文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn),富含芳香環(huán)、無側(cè)鏈且具有宮頸癌細(xì)胞抑制作用的小分子化合物RITA(reactivation of p53 and induction of tumor cell apoptosis)和姜黃素(curcumin)符合上述特點,且兩者分子大小相近、結(jié)構(gòu)相似并對稱,可能具有相似的作用方式。RITA是從美國國家癌癥研究所化合物庫中篩選出的,能夠通過抑制HDM-2(human double minute-2)對p53蛋白的泛素化降解發(fā)揮抗癌作用的小分子化合物[31]。但是,有實驗研究發(fā)現(xiàn),RITA是通過抑制hrHPV E6蛋白介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體途徑對p53蛋白的降解,誘導(dǎo)p53蛋白的積累,從而恢復(fù)HPV16和HPV18陽性細(xì)胞的周期調(diào)控和凋亡功能,而非通過抑制HDM-2對p53的泛素化降解的方式產(chǎn)生抗癌作用[32～34]。因此,我們推測在HPV陽性細(xì)胞中RITA能夠直接作用于E6蛋白,阻斷E6蛋白與p53的結(jié)合,抑制復(fù)合物形成,避免p53蛋白被E6/E6AP介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體途徑降解,從而發(fā)揮腫瘤抑制功能。姜黃素是從姜科、天南星科植物的根莖中提取的一種二酮類化合物,具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用。有文獻(xiàn)報道,姜黃素可能是以HPV E6蛋白為靶點誘導(dǎo)細(xì)胞自噬并抑制HPV的復(fù)制[35～36]。虞艷霞等[37]的實驗結(jié)果表明姜黃素能夠?qū)m頸癌的放射治療起到增敏作用。另外,相關(guān)研究表明姜黃素在與順鉑、紫杉醇等化療藥的聯(lián)合使用中也呈現(xiàn)出對宮頸癌細(xì)胞的生長抑制作用[38～39]。這些結(jié)果顯示姜黃素與RITA有著近似的作用效果?？紤]到兩者在分子結(jié)構(gòu)方面具有一些相似的特征,我們猜想：RITA和姜黃素在抑制HPV陽性細(xì)胞p53蛋白的降解方面可能具有相同的分子機(jī)制。基于此,我們采用分子對接和分子動力學(xué)模擬的方法,分別對RITA、姜黃素與HPV16/18 E6蛋白p53界面的結(jié)合模式進(jìn)行研究,以探究RITA和姜黃素抑制宮頸癌細(xì)胞的可能的分子機(jī)制,并為宮頸癌的藥物設(shè)計提供理論指導(dǎo)。

1 研究方法與實驗操作

1.1 分子表面靜電勢計算

使用量子化學(xué)波函數(shù)分析程序Multiwfn[40]計算并分析RITA與姜黃素分子的表面靜電勢分布,同時分析配體在E6蛋白復(fù)合物中的相對朝向以及次級鍵的成鍵傾向。使用可視化軟件VMD[41]對計算結(jié)果制圖。

1.2 同源建模

在 NCBI數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取HPV18 E6蛋白的氨基酸序列(GI：1258167973),NCBI BLAST顯示其與HPV16 E6蛋白氨基酸序列的一致性為59.64%。隨后,分別使用Modeller 9.20 軟件、在線服務(wù)器 SWISS-MODEL(https：//www.swissmodel.expasy.org/)和在線服務(wù)器I-TASSER(https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)[42～44]進(jìn)行同源建模,并使用SAVES(http：//servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/)對模型質(zhì)量進(jìn)行評價。

1.3 分子對接

在Chemical Book(www.chemicalbook.com)化合物數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站下載RITA(CAS#：213261-59-7)和姜黃素(CAS#：458-37-7)的分子文件作為配體。從PDB數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org)下載HPV16 E6/E6AP/p53三元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)文件(PDB ID：4XR8),取其中的E6蛋白結(jié)構(gòu)(H鏈)作為對接的受體分子。使用分子對接軟件AutoDock 4.2.6[45]進(jìn)行對接操作。對接采用遺傳算法,其余設(shè)置選擇默認(rèn)參數(shù)。根據(jù)E6蛋白晶體結(jié)構(gòu)和文獻(xiàn)[25]可知,HPV16 E6蛋白與p53的作用區(qū)域大致可分為3個亞界面(圖1),我們分別以這3個亞界面作為對接區(qū)域。HPV18 E6蛋白對應(yīng)HPV16 E6三個亞界面的殘基選擇對接區(qū)域。

1.4 分子動力學(xué)模擬

選擇HPV16 E6與RITA和姜黃素對接結(jié)果中符合條件的構(gòu)象,使用the PRODRG Server(http：//davapc1.bioch.dundee.ac.uk/cgi-bin/prodrg/submit.html)構(gòu)建蛋白質(zhì)配體復(fù)合物文件,用GROMACS 5.1分子模擬套件進(jìn)行分子動力學(xué)模擬[46]。采用適用于蛋白質(zhì)分子動力學(xué)模擬的Gromacs54a7力場,添加SPC水模型,構(gòu)建蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物的原子文件與拓?fù)湮募?盒子形狀設(shè)置為六面體,盒子最近處距離蛋白質(zhì)邊緣的距離設(shè)置為1.2 nm,加入0.15 mmol/L的氯離子和鈉離子以平衡電荷。使用最陡梯度法對該體系進(jìn)行能量最小化。對能量最小化后的體系依次進(jìn)行200 ps的熱浴(NVT,number of particles,volume,and temperature)和1 000 ps的壓浴(NPT,number of particles,pressure,and temperature)系綜模擬,之后進(jìn)行30 ns的位置非限制性分子動力學(xué)模擬。模擬過程的步長時間設(shè)置為2 fs,溫度設(shè)置為310 K以模擬人體溫度。

使用PLIP在線服務(wù)器(http：//plip.biotec.tudresden.de/plip-web/plip/index)[47]對分子對接和分子動力學(xué)模擬的結(jié)果進(jìn)行配體和受體結(jié)合模式的分析,使用UCSF Chimera程序[48]顯示蛋白質(zhì)配體復(fù)合物構(gòu)象。

圖1 HPV16 E6蛋白上與p53蛋白作用的3個亞界面Fig.1 Three sub-interfaces of HPV16 E6 protein interacting with p53 protein

2 結(jié)果與分析

2.1 RITA和姜黃素分子表面的靜電勢分布

分子表面靜電勢的計算結(jié)果經(jīng)VMD軟件可視化處理后如圖2所示：RITA和姜黃素表面靜電勢的分布大體相似,分子長軸兩端的靜電勢絕對值較大,芳香環(huán)結(jié)構(gòu)表面的靜電勢絕對值較小;不同的是,具有3個芳香環(huán)的RITA僅在兩端具有較大的靜電勢分布,而姜黃素分子的中部由于存在兩個酮羰基,所以也具有較大的靜電勢。相似的靜電勢分布意味著配體在復(fù)合物中具有近似的相對朝向及氫鍵位點,即比較一致的構(gòu)象和結(jié)合模式,顯示了RITA和姜黃素能夠產(chǎn)生相同藥理作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

2.2 HPV18 E6蛋白的同源建模結(jié)果及評價

Modeller 9.20、SWISS-MODEL 和 I-TASSER構(gòu)建的HPV18 E6蛋白模型以SAVES在線服務(wù)器進(jìn)行模型質(zhì)量評價。Verify 3D評價結(jié)果顯示,SWISS-MODEL建模結(jié)果中82.69%的氨基酸殘基的3D-1D分?jǐn)?shù)高于0.2,建模質(zhì)量較好,而另外兩者未通過評價(圖3A)。PROCHECK評價結(jié)果顯示,Modeller建模結(jié)果最好(圖3A),但拉氏圖顯示SWISS-MODEL建模結(jié)果只有ARG152在不允許區(qū)(圖3B),遠(yuǎn)離選擇作為對接區(qū)域的3個亞界面,對于本文的研究結(jié)果影響甚微。ERRAT評價方面,雖然SWISS-MODEL的分?jǐn)?shù)83.783 8低于I-TASSER的92.666 7,但通過查看每個殘基分?jǐn)?shù)發(fā)現(xiàn)不合理殘基主要位于遠(yuǎn)離結(jié)合對接區(qū)域的C末端(圖3C),說明SWISS-MODEL模型中3個亞界面的殘基評價比較合理。綜合考慮各項評價,我們認(rèn)為SWISS-MODEL建模結(jié)果更適用于本文研究。

2.3 分子對接結(jié)果及分析

2.3.1 HPV16 E6蛋白的分子對接結(jié)果及分析

通過查看HPV16 E6蛋白上與p53蛋白作用的3個亞界面的對接結(jié)果中能量最低的構(gòu)象,對RITA和姜黃素與HPV16 E6蛋白的結(jié)合模式進(jìn)行比較和分析,結(jié)果如圖4所示。

亞界面Ⅰ為HPV16 E6蛋白的6～18位殘基區(qū)域。對接結(jié)果顯示,在此區(qū)域RITA更傾向于與E6蛋白的ARG8、ARG10、GLN14殘基形成氫鍵,而姜黃素則更多通過疏水作用與E6蛋白的GLN14、THR17、GLU18 殘基結(jié)合。

亞界面Ⅱ為HPV16 E6的41～49位殘基區(qū)域。對接結(jié)果中的最低能量構(gòu)象顯示,RITA與E6蛋白的ILE23、ALA46、PHE47殘基形成疏水鍵,與THR17、ASP49殘基形成氫鍵;姜黃素與HPV16 E6蛋白的 LYS11、PRO13、PHE47殘基形成疏水鍵,與LYS11、THR17、ASP49形成氫鍵。兩個小分子的兩端都與E6蛋白THR17、ASP49殘基形成氫鍵,形成了比較一致的配體結(jié)合構(gòu)象。

亞界面Ⅲ為HPV16 E6的97～115位殘基區(qū)域,結(jié)果顯示RITA與PRO109、PRO112形成疏水鍵,與 SER97、ILE101、LYS115 形成氫鍵;姜黃素未形成疏水鍵,而是通過甲氧基和羥基與LEU99、ILE101、LYS108、PRO109、LYS115 形成較多氫鍵。

2.3.2 HPV18 E6蛋白的分子對接結(jié)果及分析

通過查看HPV18 E6蛋白上與p53蛋白作用的3個亞界面的對接結(jié)果中能量最低的構(gòu)象,對RITA和姜黃素與HPV18 E6蛋白的結(jié)合模式進(jìn)行比較和分析,結(jié)果如圖5所示。

亞界面Ⅰ為HPV18 E6蛋白的6～18位殘基區(qū)域。對接結(jié)果顯示,在此位點RITA和姜黃素都與E6蛋白10～20位殘基形成豐富的氫鍵,且都與TYR12形成疏水鍵,但RITA也能與ASP16、THR19和GLU20形成疏水鍵。

圖2 RITA和姜黃素分子表面的靜電勢分布Fig.2 Electrostatic potential distribution on the surfaces of RITA and curcumin

圖3 HPV18 E6同源建模結(jié)果的SAVES評價(A)三種方法建模結(jié)果的評價總覽;(B)SWISS-MODEL建模結(jié)果的主拉氏圖。用于評價氨基酸殘基的空間合理性,允許區(qū)為紅色,最大允許區(qū)為黃色,不允許區(qū)為白色;(C)SWISS-MODEL建模結(jié)果的ERRAT殘基評價。通過重原子間非鍵作用評價氨基酸殘基分布,綠色為正確,黃色為警告,紅色為錯誤。Fig.3 SAVES evaluation of homology modeling for HPV18 E6(A)Overview of evaluation of three homology modeling methods;(B)Main Laplace diagram of SWISS-MODEL modeling results.To evaluate the spatial rationality of amino acid residues,the allowable area is red,the maximum allowable area is yellow,and the unallowable area is white;(C)ERRAT residue evaluation of SWISS-MODEL modeling results.To evaluate the distribution of amino acid residues by non-bonding between heavy atoms,green is correct,yellow is warning,and red is wrong.

圖4 HPV16 E6蛋白對接構(gòu)象及結(jié)合模式左圖：E6蛋白親疏水表面的配體疊加構(gòu)象,其中RITA顯示為黃色,姜黃素顯示為綠色;右圖：RITA、姜黃素分別與E6蛋白的相互作用。Fig.4 Protein docking conformation for HPV16 E6 and binding modeLeft panel：RITA is shown in yellow in the ligand-superimposed conformation of the protein-hydrophobic surface,and curcumin is shown in green;Right panel：Interaction between RITA/curcumin and E6 protein.

亞界面Ⅱ為HPV18 E6的41～49位殘基區(qū)域。對接結(jié)果顯示,RITA的噻吩結(jié)構(gòu)與E6蛋白的 PHE45、PHE49 形成 π-π 堆積,與 GLN26、GLU46形成氫鍵,且與PHE49形成疏水鍵;姜黃素一端的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)與HPV18 E6蛋白的PHE45殘基形成π-π堆積(這與RITA的結(jié)合情況相似),而另一端的芳環(huán)結(jié)構(gòu)僅與E6蛋白的LYS110、ASN113形成氫鍵,與LYS110形成疏水鍵。我們分析認(rèn)為這可能是由于姜黃素的分子結(jié)構(gòu)中部缺乏芳香環(huán),所以與PHE49形成疏水鍵而非π-π相互作用。

亞界面Ⅲ為HPV18 E6的97～115位殘基區(qū)域,結(jié)果顯示 RITA 與 PHE49、LEU102、PRO111形成疏水鍵,與 LEU101、ILE103、LYS110、ASN113、LYS117形成氫鍵;姜黃素與TYR99、PRO111形成疏水鍵,與 PHE49、LYS110、ASN113、LYS117形成氫鍵,且與TYR99形成π-π堆積。

根據(jù)Martinez-Zapien等[25]解析的HPV16 E6/E6AP/p53晶體結(jié)構(gòu),HPV16 E6蛋白的PHE47、ILE23、HIS24和TYR43殘基為其與p53結(jié)合貢獻(xiàn)疏水作用,ASP49與p53的HIS115以氫鍵形式相互作用,F47R或D49A突變會干擾三元復(fù)合物的形成并抑制p53的降解。這同我們的RITA和姜黃素與HPV16 E6蛋白亞界面Ⅱ的對接結(jié)果的成鍵情況非常吻合,而且不論是HPV16還是HPV18的E6蛋白,RITA和姜黃素在亞界面Ⅱ均有更好的構(gòu)象重疊,與亞界面Ⅱ殘基的結(jié)合方式也更一致,因此我們選擇亞界面Ⅱ?qū)咏Y(jié)果中的蛋白質(zhì)配體復(fù)合物作為初始構(gòu)象進(jìn)行分子動力學(xué)模擬研究。

2.4 分子動力學(xué)模擬結(jié)果及分析

圖5 HPV18 E6蛋白對接構(gòu)象及結(jié)合模式左圖：E6蛋白親疏水表面的配體疊加構(gòu)象,其中RITA顯示為黃色,姜黃素顯示為綠色;右圖：RITA、姜黃素分別與E6蛋白的相互作用。Fig.5 Docking conformation for HPV18 E6 and binding modeLeft panel：RITA is shown in yellow in the ligand-superimposed conformation of the protein-hydrophobic surface,and curcumin is shown in green;Right panel：Interaction between RITA/curcumin and E6 protein.

在30 ns分子動力學(xué)模擬過程中,無論是RITA還是姜黃素都沒有從HPV16/18 E6蛋白的41～49位的疏水溝中脫離,表明該區(qū)域的結(jié)合穩(wěn)定。于分子動力學(xué)模擬25 ns之后選擇復(fù)合物體系能量較低時刻的構(gòu)象進(jìn)行分析,與對接結(jié)果相比,RITA和姜黃素與HPV16/18 E6蛋白結(jié)合模式中,疏水作用的比重顯著增大(圖6),推測是E6蛋白表面41～49位殘基形成的疏水溝與溶液環(huán)境共同作用的結(jié)果。從30 ns的動態(tài)模擬中多次截取瞬時構(gòu)象進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)HPV16 E6蛋白的PHE47殘基的側(cè)鏈苯環(huán)與配體的芳香環(huán)以疏水鍵或π-π堆積的方式發(fā)生相互作用,而HPV18 E6的PHE47殘基側(cè)鏈包埋于蛋白質(zhì)內(nèi),但PHE45和PHE49殘基的側(cè)鏈苯環(huán)暴露于蛋白質(zhì)表面,代償PHE47的側(cè)鏈苯環(huán)與配體發(fā)生疏水作用和π-π相互作用。在HPV18 E6蛋白復(fù)合物的30 ns分子動力學(xué)模擬中,RITA與E6蛋白的相對構(gòu)象變動較小,而姜黃素沿疏水溝方向發(fā)生較大的位移,這與HPV16 E6蛋白復(fù)合物的模擬結(jié)果相差較大。對比分析HPV16與HPV18的E6蛋白41～49位殘基的構(gòu)成及配體結(jié)合成鍵情況,推測出現(xiàn)這種差異是由于HPV18 E6亞界面Ⅱ表面存在PHE45和PHE49側(cè)鏈的兩個苯環(huán),芳香環(huán)結(jié)構(gòu)更為密集的RITA恰好能與兩個苯環(huán)同時形成疏水鍵和π-π相互作用,而姜黃素的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)位于分子兩端,當(dāng)一端與PHE45(或PHE49)側(cè)鏈形成疏水鍵或π-π相互作用時,由于空間分布和構(gòu)象能量的原因,另一端的芳香環(huán)與PHE49(或PHE45)側(cè)鏈相距較遠(yuǎn),而且由Multiwfn計算結(jié)果可知,姜黃素分子中部有較高的表面靜電勢分布,在41～49疏水溝中難以發(fā)生相互作用并穩(wěn)定構(gòu)象;HPV16 E6在此區(qū)域只有PHE47側(cè)鏈苯環(huán)位于蛋白質(zhì)表面,RITA分子中更為緊湊的3個芳環(huán)結(jié)構(gòu)使其與PHE47的相互作用具有更高的自由度,并易于在多種構(gòu)象間相互轉(zhuǎn)化。這也能夠解釋在Zhao等[34]的實驗中為什么RITA對HeLa細(xì)胞(HPV18)的抑制效果高于CaSki細(xì)胞(HPV16)。

3 總結(jié)與討論

圖6 分子動力學(xué)模擬25 ns之后復(fù)合物較低能量的構(gòu)象及結(jié)合模式(A)HPV16 E6-RITA復(fù)合物;(B)HPV16 E6-姜黃素復(fù)合物;(C)HPV18 E6-RITA復(fù)合物;(D)HPV18 E6-姜黃素復(fù)合物。Fig.6 The low-energy binding patterns and interactions of compounds by molecular dynamics simulation after 25 ns(A)HPV16 E6-RITA complex;(B)HPV16 E6-curcumin complex;(C)HPV18 E6-RITA complex;(D)HPV18 E6-curcumin complex.

基于已測得的晶體結(jié)構(gòu)和相關(guān)文獻(xiàn)[25]報道,我們推測小分子抑制劑RITA和姜黃素可能通過作用于hrHPV E6蛋白的p53結(jié)合界面,抑制E6蛋白對抑癌蛋白p53的降解。本研究通過同源建模構(gòu)建HPV18 E6蛋白模型,使用AutoDock軟件將RITA和姜黃素與HPV16/18 E6蛋白的3個亞界面分別進(jìn)行分子對接,比較兩個小分子在這3個區(qū)域的對接模式,結(jié)果顯示RITA和姜黃素與HPV16 E6蛋白或HPV18 E6蛋白均在亞界面Ⅱ有著相似的結(jié)合模式和較為一致的構(gòu)象重疊。為更進(jìn)一步研究體液環(huán)境中RITA和姜黃素與亞界面Ⅱ的結(jié)合模式,使用GROMACS 5.1進(jìn)行30 ns的分子動力學(xué)模擬,結(jié)果表明RITA和姜黃素均能與HPV16/18 E6蛋白的41～49位殘基形成較為穩(wěn)固的疏水作用,E6蛋白亞界面Ⅱ的PHE殘基的側(cè)鏈苯環(huán)是提供疏水作用和π-π相互作用的重要結(jié)構(gòu)。結(jié)合文獻(xiàn)報道的HPV16 E6 F47R/G定點突變導(dǎo)致其誘導(dǎo)p53降解能力降低的實驗結(jié)果[49～51],可以設(shè)想,抑制劑通過競爭性結(jié)合HPV16 E6蛋白PHE47可能獲得同樣結(jié)果,同理HPV18 E6蛋白的PHE45和PHE49可作為抑制劑結(jié)合靶點。這一結(jié)果或可作為宮頸癌特異性治療藥物分子設(shè)計的基礎(chǔ),而且受體的亞界面Ⅱ不僅是E6蛋白與p53蛋白相互作用的區(qū)域,本身也是暴露在E6蛋白表面最大的疏水區(qū)域,具有作為藥物靶點的可能性。此外,從配體方面來看,小分子抑制劑的芳香性基團(tuán)對結(jié)合貢獻(xiàn)了較多的疏水作用和π-π相互作用,可作為設(shè)計與篩選更多小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)特征。對此我們也做了虛擬篩選方面的嘗試,且篩選出的化合物比較符合這一特征規(guī)律,結(jié)合能低的主要是具有3～4個芳香環(huán)的多酚化合物,與RITA和姜黃素結(jié)構(gòu)比較相似。HPV的E6蛋白是具有多種生物活性的低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì),其結(jié)構(gòu)極易變化,在我們的分子動力學(xué)模擬過程中結(jié)合了不同配體的E6蛋白的構(gòu)象發(fā)生了顯著變化,這種蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化可能會破壞三元復(fù)合物的形成并使p53免于降解。

雖然RITA和姜黃素在體外和體內(nèi)實驗都顯示了對宮頸癌的治療作用,但由于耐藥性和生物利用度低等特點尚未能夠應(yīng)用于臨床[52-53]。很多研究證明,RITA、姜黃素等小分子對癌細(xì)胞的抑制除了通過恢復(fù)p53途徑外還有多種其他作用途徑,如 IRE1α/XBP1、p38 和 JNK/SAPK 途徑[54～56],而且對于RITA、姜黃素激活p53途徑的分子機(jī)制和結(jié)合模式也存在爭議,仍需更多研究。本研究進(jìn)行分子對接和分子動力學(xué)模擬,旨在通過比較兩者與HPV16/18 E6蛋白的結(jié)合模式,尋找潛在的藥物靶點,為宮頸癌的研究和新藥設(shè)計提供更多參考。在后續(xù)研究中,我們將以本研究的結(jié)論作為理論基礎(chǔ),以靶點結(jié)構(gòu)和小分子抑制劑特征為出發(fā)點,進(jìn)行更多探索,以期發(fā)現(xiàn)更有治療價值的活性小分子。